专利名称：轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒。
背景技术：
轮状病毒(rotavirus)是世界范围内病毒性胃肠炎的重要病因。目前对轮状病毒感染引起的胃肠炎治疗尚无特效药物。无论在发达国家或是发展中国家，由轮状病毒引起的腹泻均有较高的发病率，是婴幼儿发病和致死的最主要病因。
轮状病毒在离体条件下存活力很强，对各种理化因子有较强抵抗力，耐乙醚和弱酸，用氯仿、反复冻融、超声波处理都不能使其失活，且这类病毒的序列变异较大，有多种血清型存在。近年来，轮状病毒引起的胃肠炎流行在世界范围内有不断上升的趋势，且流行范围广，传染性强，二次攻击率高，常造成急性严重的呕吐和腹泻。虽然不同病毒感染的症状轻重不一，但一般患者都具有低烧、呕吐、腹泻、头痛等严重的脱水样胃肠炎的症状。人群对这几种病毒普遍易感，儿童和老人最为严重，为胃肠炎病毒的危险人群。虽然轮状病毒胃肠炎的流行有一定的季节性，但全年均可发生，可呈暴发流行，也可呈散发流行，因此致使对其不能进行及时有效的防护。目前轮状病毒病原的检测方法有电镜技术、病毒分离培养技术、免疫学技术及分子生物学技术，但上述的前三种技术往往存在灵敏度较低、操作繁琐耗时、需要大型昂贵的仪器设备等缺点，在应用时往往有其局限性，尤其不能适用于大规模的病原筛查和检测等实际应用。分子生物学技术，其中尤其以RT-PCR检测技术由于其快速、灵敏、适合处理大通量的样品等特点，在病毒检测中显示出其优越性并越来越多的得以应用，但该方法从检测到结果的判读仍然需要多种专用仪器，操作较为繁琐，所需时间仍然在5小时以上，常有非特异性出现等缺陷。与上述几种实验室诊断方法相比，近年来新建立的环介导等温扩增(LAMP)技术由于其对仪器设备要求不高，临床上容易做到，检测时间也较短，不超过3小时，为快速、准确检测轮状病毒探索一种新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用环介导等温扩增检测轮状病毒(rotavirus)的轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，利用该检测试剂盒可以特异性的检测轮状病毒(rotavirus)。本发明的轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，包括RNA提取试剂，RNA反转录试剂，环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成上游外引物F3 :5，-ACCACTCCTTAATGCACAA-3，；(如 SEQ ID NO.1 所示)；下游外引物B3 :5’ -GCCATCCITTGATTAAAAATAGCT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)；上游内引物FIP :5’ -CCTCTCGCGTTGAGTTCGTAT-GGAATAAATCTTCCGATTACTG G-3’ ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)下游内引物BIP:5’-ATGTTTGTATTACCCAACTGAAGCA-AGAAAGTGTATCCTTCCA TGAA-3，(如 SEQ ID NO. 4 所示)。所述的环介导等温扩增试剂优选包括反应液A、反应液B和反应液C反应液A :每 24ii L 含有 2. LlOXThermopol 反应缓冲液、I ii 18U/ii L Bst DNA聚合酶、0. 4 u L10mmol/LdNTPs、0. 5 u LlO u mol/L 上游外引物 F3、0. 5 u LlO u mol/L 下游外引物 B3、l ii L40 ii mol/L 上游内引物 FIPUu L40 u mol/L 下游内引物 BIP,0. 6 u LlOOmmol/L MgSO4> 12. 5 V- L2mol/L 甜菜碱、4 u L 灭菌双蒸水 ddH20 ；反应液B 50mM MgCl2 ；反应液C :100 X的荧光染料SYBR Green I。所述的lOXThermopol反应缓冲液是现有技术中的物质，可以从试剂公司购买至丨J，其含有200mmol/L pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L 硫酸铵(NH4) 2S04、20mmol/L 硫酸镁(MgSO4)和 1% 曲拉通 X-100(TtitonX-100)，余量为水。本发明根据轮状病毒的基因保守序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为轮状病毒所共有。本发明采用LAMP技术，特异性强，且比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的水浴箱即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，可用于轮状病毒的检测，特别适合于基层现场应用。环介导等温扩增(Loop-mediatedIsothermal Amplif ication, LAMP)技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是对靶基因的6个部位设计4种引物，利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增。由于其反应是多种引物共同启动，使得反应结果比PCR更特异，另外，由于实行的等温扩增，反应在恒温水浴箱内便可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适用于现场快速检测。本发明解决了现有技术中检测轮状病毒的方法所需周期长、灵敏度较低、成本高等缺陷，可广泛应用于医院、食品行业、出入境检验检疫及质量监督等部门及领域。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1 :利用轮状病毒LAMP检测试剂盒检测轮状病毒待测样本制备以临床腹丨与样本为例本实施例收集了 3份医院收集的临床腹泻样本，分别按照以下方法进行检测。( I)样本处理取医院收集的临床腹泻样本，用pH7. 4的PBS稀释成10%的悬液，4°C、IOOOOg离心取上清，用于提取病毒RNA。(2)病毒RNA提取(a)取200 ii L步骤(I)的上清，加800 ii L Trizol试剂，用移液器反复混匀几次后静置5min ；(b)加入200 ii L氯仿，用力振摇15S，再静置2 3min ;
(c) 4°C, 12000g,离心 15min,弃去上层液体；(d)加入500 u L异丙醇，充分混匀，室温放置IOmin ；(e) 4°C, 12000g,离心 IOmin,再次弃去上清；(f)加入75 %的乙醇，振摇，充分洗涤沉淀；(g) 4°C, 7500g,离心 5min,小心弃去乙醇；(h)充分干燥后，将RNA沉淀悬浮于适量的无RNA酶的水中，由此得到RNA样品。(3)病毒RNA反转录取2 ii L RNA 样品，I ii LdNTP, 0. 5 u L RNasin, I u L MLV，各 I U L 的外引物 F3(5，-ACCACTCCTTAATGCACAA-3，)和外引物 B3 (5，-GCCATCCITTGATTAAAAATAGCT-3，)， 2. 5 u LlO X RT buffer,1. 5u LMgCl2,加入RNase free水至终体积为25 u L，反转录反应条件为42°C，30min，然后 95°C，2min，由此得到 cDNA。(4)环介导等温扩增在装有24 ii L反应液A的反应管中加入I ii L上述步骤3中的反转录产物cDNA，于65 °C恒温水浴箱中放置60min。(5)扩增产物的显色检测在上述反应管中依次加入I y L反应液B和I ii L反应液C,室温放置IOmin,用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有轮状病毒；如果颜色为黄色，说明待检样品不含有轮状病毒。其结果为阴性对照(模板为水)黄色，不含有轮状病毒，阳性对照(RT-PCR阳性并测序确证为阳性的轮状病毒)绿色，含有轮状病毒，2-4号样品为本实施例的临床腹泻样本，其颜色都为绿色，含有轮状病毒。这与通过常规RT-PCR检测方法检测得到的结果相同。实施例2 :特异性试验将I个已知轮状病毒阴性和2个已知轮状病毒阳性的样品，按照实施例1的RT-LAMP法再次检测，结果表明，已知阴性的样品，在LAMP检测结果中仍然呈现阴性，已知阳性的样品，在LAMP检测结果中仍然呈现阳性，表明LAMP检测结果和PCR检测结果相吻合，验证了本发明的特异性。实施例3 :灵敏度试验将轮状病毒RNA梯度稀释，按照实施例1中步骤3-5的方法进行反转录、环介导等温扩增和扩增产物的显色检测，验证本发明的灵敏度，检测结果为阴性对照(模板为水)为黄色，不含有轮状病毒，阳性对照(RT-PCR阳性并测序确证为阳性的轮状病毒)为绿色，含有轮状病毒，而100pg、10pg、lpg、0.1pg模板量的轮状病毒RNA样品其颜色都为绿色,都为阳性，确定其检测灵敏度为0.1pgo
权利要求
1.一种轮状病毒的检测试剂盒，包括RNA提取试剂，RNA反转录试剂，环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成上游外引物 F3 :5’ -ACCACTCCTTAATGCACAA-3’ ；下游外引物 B3 :5’ -GCCATCCTTTGATTAAAAATAGCT-3’ ；上游内引物 FIP :5’ -CCTCTCGCGTTGAGTTCGTAT-GGAATAAATCTTCCGATTACTG G-3’ ；下游内引物 BIP :5’ -ATGTTTGTATTACCCAACTGAAGCA-AGAAAGTGTATCCTTCCA TGAA-3’。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的环介导等温扩增试剂包括反应液A、反应液B和反应液C 反应液A :每24 μ L含有2. 5 μ LlOXThermopol反应缓冲液、I μ 18U/ μ LBst DNA聚合酶、O. 4μ L10mmol/LdNTPs、0. 5μ L10ymol/L 上游外引物 F3、0. 5 μ LlO μ mol/L 下游外引物 B3、I μ L40 μ mol/L 上游内引物 FIP、I μ L40 μ mol/L 下游内引物 ΒΙΡ、0· 6 μ LIOOmmoI/L MgSO4> 12. 5 μ L2mol/L 甜菜碱、4 μ L 灭菌双蒸水 ddH20 ；反应液 B :50mM MgCl2 ；反应液C :100 X的荧光染料SYBR Green I。
全文摘要
本发明公开了一种轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒。该检测试剂盒组包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP，分别如SEQ ID NO.1、2、3和4所示、反应液B和C。本发明根据轮状病毒的基因保守序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为轮状病毒所共有。本发明采用LAMP技术，特异性强，且比PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的水浴箱即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，可用于轮状病毒的检测，特别适合于基层现场应用。
文档编号C12Q1/70GK103014177SQ201210553449
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者寇晓霞, 吴清平, 薛亮, 张菊梅 申请人:广东省微生物研究所, 广东环凯微生物科技有限公司