专利名称：一种微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法
技术领域：
本发明属于环境工程技术领域，涉及一种使用Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)检测微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法。
背景技术：
近年来饮用水(源)中有机污染物的种类日益增多，水质的安全评价至关重要，进行水质检测，综合分析水质污染状况，对于保证各行业用水及生活用水的质量有很重要的经济和社会意义。除了在生产，运输过程中化学物质的泄漏，污染物在饮用水源地的直接排放等因素外，饮用水相关材料中有害物质的溶出也是一个重要原因。日常饮用水相关材料中有较大比例是有机制品，在常温或高温下长时间浸泡可能会导致部分有机物质渗入饮用水中。这些物质具有三个显著的特点一是大多数是非极性有机物；二是浓度极低，一般为 ng μ g/L级，但是浓度低并不代表毒性小，有很多有机物有很强的积累性或具有致癌、致畸、致突变的效应，对人体健康造成巨大的隐患；三是种类繁多，多种污染物之间可能存在协同、加合或拮抗等作用，虽然每种污染物的浓度都在安全浓度之内，多种污染物一起也可能对人体造成危害。因此为了检测这种情况下污染物对人体的危害程度，需要检测方法满足两个方面的要求一是灵敏度要高，否则难以检测低浓度的污染物；二是能判断多种污染物的综合毒性。因此根据目前的发展方向，常用的水质检测方法包括化学法、仪器法和生物法。化学分析法是以化学反应为基础的分析方法，分为称量分析法和滴定分析法两种。仪器分析法则分为光学分析法、电化学分析法和色谱分析法三种。在水质检测分析中， 化学分析法和仪器分析法中的光学分析法、电化学分析法属于常规分析方法，主要用于物理指标和金属指标的测定，而有机物的测定主要依靠色谱法进行。近年来，由于色谱新技术的不断出现以及色谱-质谱联用分析技术的发展，能同时对污染物进行分离、定性和定量检测，使色谱法成为饮用水中有机物检测的主要方法之一。化学法可以快速准确地判断污染物的浓度，但首先要预测水样中可能含有的污染物质，然后对其进行定量分析。而饮用水中化学物质种类繁多，要全部分析检测这些污染物成分，工作量巨大，通常较难测定。同时， 两种或多种污染物之间可能存在协同作用、相加作用、独立作用或拮抗作用。因此化学法和仪器法无法满足评价有机污染物综合毒性的要求。而生物检测法是一种有效的饮用水综合安全评价手段。污染物对生物体的毒性作用可发生在个体、细胞及分子水平上。个体水平的生物毒性评价常用的指示生物包括微生物、藻类、大型蚤、鱼类和哺乳动物。前几种生物与人类的同源性较低，难以较为准确地反应毒物对人体的影响。同时生物体是一个有机的整体，生物体本身的排毒、解毒、免疫等能力， 有时可能会掩盖污染物对机体造成的影响，机体的活力、外在表现可能未出现异常，但实际上机体内部的组织、器官可能已出现损伤，这种情况下就难以灵敏地检测有毒物质的存在。 因此需要建立一种快速、经济的生物检测方法，代替活的动物实验用于毒性实验，细胞毒性检测的方法应运而生。
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细胞毒性主要表现为增殖速度、代谢产物的变化以及形态结构的改变等。通过检测细胞的增殖能力、细胞的存活与死亡等作为检测指标的方法有中性红吸收法、MTT比色法、蛋白含量测定法、台盼蓝排斥法、乳酸脱氢酶酶活测定法、ATP含量测定法、蛋白质和 DNA合成测定法、氧化压力法等。这些方法可以对污染物的细胞毒性进行定量评价，但是它们本身也存在灵敏度不高的缺点，难以满足对微量有机物的毒性进行判断的要求。通过观察细胞形态的变化只能定性判断污染物毒性，如果观察到细胞变圆，部分细胞不再贴壁，细胞器变形等现象时，说明细胞受到毒物作用。Vero细胞变形法是其中的一种，该方法是上世纪90年代，英国建立的一种用于饮用水及相关材料综合安全评价的生物检测法-Vero细胞变形法(BS6920 Suitability of water and non-metalic products for use in contact with water intended for human consumption with regard to their effect on the qualith of the water-Section 25，British Standards Insistution，1992)。该方法原理是利用来源于非洲绿猴肾脏的Vero细胞在正常情况下生长时呈不规则三角形状，而在含一定浓度有害化学物质的培养基中生长时则由三角形转变为圆形的特点来判断饮用水及相关材料的综合安全性(材料的安全性评价通过测定材料浸泡液的综合生物毒性)。 Vero细胞变形法的灵敏度较高，可以检测低浓度污染物的水体，同时Vero细胞与人体高度同源，检测时间仅需48h，因此该方法是一种理想的饮用水综合安全评价手段。但Vero细胞变形法也有其不足之处，该方法的评判标准是通过低倍显微镜直接观察生长细胞的形状变化，缺乏一个严格的科学定量标准。在实际操作中感性指标判断的准确性往往受到质疑(特别是污染物浓度处于临界状态下)，导致该方法不能作为一个最终的评价手段，一般只作为一种毒性初筛的手段，在全球范围未得到广泛推广(我国也未将该方法列为标准方法)。污染导致的最初反应是从分子相互作用开始的，因此分子生物标志物直接反映外来理化因素与细胞靶分子，特别是生物大分子如核酸和蛋白质的相互作用及其后果，因而具有较高的敏感性。不过分子标志物判断污染物毒性也有不足之处。在现阶段的研究中， 研究者的工作多集中在单一化合物和单一暴露途径的风险问题，但实际中生物往往暴露于来自多重途径的多种化合物的综合影响。同时，不同的分子标志物比较专一，普适性不高， 例如有些只能用于检测重金属污染，有些只能反映DNA损伤情况。而细胞与分子标志物相比，更能反映出多种污染物对生物的综合毒性效应，有更高的普适性。综上所述，要判断污染物的综合毒性，细胞水平的判断更为敏感且普适性更高。 但通过检测细胞的增殖能力、细胞的存活与死亡等作为检测指标的方法的敏感度不足以判断微量污染物的毒性，而细胞变形法的灵敏度虽然高，但难以定量判断。因此需要找到一种基于细胞水平、灵敏度高、且能够对微量非极性有机污染物的毒性进行定量评价的检测方法。研究表明细胞变形可能是细胞膜受损的宏观表征，因此根据膜损伤的原理设计基于Vero细胞的定量毒性分析技术是一个发展方向(Tingting Liao, Sensitivity of morphological change of Vero cells exposed to lipophilic compounds and its mechanism. Journal of Hazardous Materials, 2010, Vol. 179 :1055 1064)。事实上乳酸脱氢酶法(LDH)也是一种基于细胞膜受损的方法，其原理是细胞膜受损后，细胞会释放LDH 到培养基中。然而，LDH的分子量是140，OOODa,当LDH释放时表示细胞已经严重受损，所以 LDH的释放意味着不可逆转的细胞死亡。有学者研究发现，LDH法和MTT法的灵敏度相似(Putnam K P, Bombick D W, Doolittle DJ. Evaluation of eight in vitro assays for assessing the cytotoxicity of cigarette smoke condensate. Toxicology in Vitro, 2002, Vol. 16(5) :599 607 ；Repetto G, JosA, Hazen M J, et al. A test battery for the ecotoxicological evaluation of pentachlorophenol. Toxicology in Vitro,2001, Vol. 15(4 5) 503 509)。而碘化丙啶(Propidium iodide, PI)染料——一种常用的细胞核荧光染色剂，其分子量小，只有668. 4Da，不能透过完整的细胞膜，但可能在细胞膜受损程度很小时即可穿过细胞膜进入细胞并与核酸结合，所以PI染色法可能要比LDH法更灵敏。PI染料能穿过破损的细胞膜而将细胞核染色，释放红色荧光。PI在绿色光(540nm波长)的激发下，会在600nm处发出明亮的荧光，与细胞核中的DNA结合的PI发出的荧光与未结合的PI相比，强度会增强20-30倍。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法，该方法灵敏度高。本发明的技术方案如下本发明提供了一种微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法，该方法包括以下步骤1)配制含有非极性有机污染物的Vero细胞培养基；2)采用步骤1)配制的培养基对Vero细胞进行受试；3)受试后，除去培养基，在细胞培养皿中加入PI (碘化丙啶)染液，于暗处室温下
孵育；4)将孵育后细胞培养皿中的PI染液吸出，测所吸出的PI染液的荧光度；通过计算PI摄入率来判断细胞膜的受损程度，进而判断非极性有机污染物的细胞毒性大小。所述的非极性有机污染物选自2，4，6-三氯苯酚或全氟辛烷磺酰基化合物中的一种或两种。所述的非极性有机污染物的浓度为O 50mg/L的培养基。所述的步骤2)的受试包括以下步骤将Vero细胞以IO4 IO6个/mL的密度接种到培养皿中，加入步骤1)所述的培养基，培养18 Mh。所述的步骤3)包括以下步骤加入1 5mL浓度为10 100 μ g/mL的PI染液， 每个培养皿中加入的PI染液量一致，于暗处室温下孵育10 20min。所述的步骤幻中加入PI染液前进一步包括用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)冲洗细胞的步骤。所述的步骤4)包括以下步骤将PI染液分别加入96孔板中，100 200 μ L/孔， 用酶标仪测其荧光度，其中酶标仪激发波长为530nm，发射波长为620nm。所述的PI摄入率计算公式如下各浓度污染物受试细胞，PI摄入率即进入细胞的 PI染液的比例；PI 摄入率=[(U0-U) /U0] X 100%无细胞空白时的PI的荧光值为Utl，未进入细胞的剩余PI量的荧光值为U。本发明的原理如下PI染液无法透过完整的细胞膜，但可以透过受损的细胞膜，已有研究表明非极性有机物导致Vero细胞的细胞膜受损，因此进入细胞的PI染液的量越多，即未进入细胞的PI染液的量越少，说明细胞膜受损程度越严重，进而说明非极性有机物的细胞毒性越强。本发明同现有技术相比，具有以下优点和有益效果1、现有技术中的化学法和仪器法仅能对饮用水中事先预测的化学物质进行定量判断，而本发明的测定方法——PI染色法可以评价微量非极性有机污染物的综合毒性。2、本发明的测定方法是评价非极性有机污染物的细胞毒性，与个体水平的生物毒性评价方法相比，具有更快速、经济，以及采用的Vero细胞与人类高度同源的优点。3、本发明的测定方法与现有技术中的评价细胞毒性的测定方法相比，Vero细胞变形法仅能定性表征有机污染物的细胞毒性，难以定量，而PI染色法可以定量评价；常用的基于细胞增殖抑制的方法(如MTT法)的灵敏度更适用于判断污染物的半致死剂量，而PI 染色法的灵敏度更高，特别适用于评价微量非极性有机污染物的细胞毒性，弥补了 MTT法的不足；因此PI染色法可以应用于一种或多种非极性有机污染物的毒性检测，具有良好的应用前景和实用价值。
图1为本发明方法测得的经不同浓度的TCP受试后Vero细胞的PI摄入率。图2为MTT方法测定的TCP对Vero细胞增殖的抑制率。图3为本发明方法测得的经不同浓度的PFOS受试后Vero细胞的PI摄入率。图4为MTT方法测定的PFOS对Vero细胞增殖的抑制率。
具体实施例方式以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。本发明中，选取了两种典型的非极性有机污染物2，4，6_三氯苯酚(TCP)和全氟辛烷磺酰基化合物(PF0Q进行测试，目的是为了更好地说明本发明的方法，而并不受其限制。TCP是一种非极性有机物，难溶于水，易溶于酒精和乙醚等有机溶剂。TCP是一种重要的化工原料，普遍用作除草剂、木材的防腐剂、杀菌剂、溶剂、热交换剂等。TCP是一种持久性有机物(POPs)和内分泌干扰素(EDCs)的代表物质，有蓄积作用，结构稳定。TCP具有较大的生物毒性，被人体吸入或经皮肤吸收可引起头痛、疲倦、眼睛和皮肤的刺激症状、神经痛、呼吸困难、肝肾损害等，属于三致物质，已被我国国家环保总局列入优先控制污染物黑名单。TCP已在水体、土壤及木材中被普遍检测到，而且有报道指出85%的TCP在使用后被排入水体，对水生生物产生危害。PFOS是一种典型的两性分子，既具有疏水性，也具有疏油性，所以被广泛应用于防水剂、防油剂、防尘剂和防脂剂(如用于织物、皮革、纸张、包装、毛皮和地毯)及表面活性剂等各种用途中。不粘锅、食品包装袋的内表面、部分洗发剂、沐浴露、肥皂、洗涤剂中均含有 PFOS0 PFOS具有极强的化学稳定性及热稳定性，即使在硝酸或硫酸中煮沸，C-F键也不会断裂，热解温度高达1200°C。目前环境中还未发现PFOS自然降解的迹象，人体内PFOS的半衰期长达14 天。试验研究表明，PFOS可以在有机生物体内聚积。水生食物链生物对PFOS有较强的富积作用，通过食物链向包括人类在内的高位生物转移。PFOS可引起生物各个层次的效应，包括动物繁殖与生育能力的降低，幼龄动物的生长发育延缓，肝组织受损，甲状腺功能的改变等。大量的研究发现，PFOS具有遗传毒性、生殖和生育毒性、神经毒性和内分泌干扰作用等多种毒性，被认为是一类具有全身多器脏毒性的化学污染物。实施例中所用的PBS溶液配制方法8g NaCl,0. 2g KClU. 44g Na2HPO4和0. 24g KH2PO4,用HCl调节溶液的pH值至7· 4， 加水定容至1L。实验材料与仪器UVero (CCL-81)细胞由杭州远方生物科技有限公司提供；2、MEM培养基粉末，新生牛血清和胰酶由美国GIBCO公司提供；3、MTT粉剂来自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；4、2，4，6_三氯苯酚(TCP)单标购自美国SUPELC0公司；PFOS购于Sigma公司；5、PI染料粉末购自美国Sigma公司，溶于双蒸水中至终浓度为50μ g/ml，分装后储藏于-20°C，三个月之内用完；6、酶标仪采用Bio-RAD公司Model 550型酶标仪；7、96孔板选用加拿大G&H公司标准孔板。细胞培养步骤将Vero细胞以3X IO4个/mL的浓度接种到Φ IOOmm的培养皿中，用血清浓度为7% (ν/ν)的MEM培养基进行传代，血清浓度为2% (ν/ν)的培养基维持细胞生长， penicillin (100IU/mL)(青霉素)and str印tomycin (链霉素)(100g/mL)，置于 37°C，二氧化碳浓度为5%的恒温培养箱中维持生长。实施例1 TCP对Vero细胞的毒性测试步骤1)TCP溶于DMSO (二甲基亚砜)中，配成200mg化―1的母液储存，然后用生长培养基将母液稀释到不同浓度，配成含TCP浓度分别为0，1，2. 5，5，7. 5，10，12. 5，15，20mg/ L的培养基；步骤2)将Vero细胞从Φ 100mm的培养皿中消化下来，以4X IO5个/mL的密度接种到Φ60πιπι的培养皿中，加入含有0，1，2. 5，5，7. 5，10，12. 5，15，20mg/L的TCP培养基，细胞孵育Mh。步骤3)受试后，除去培养基，并用PBS溶液洗细胞三次，然后在每皿中加入ImL的 PI染液(50 μ g/mL)，于暗处室温下孵育IOmin。步骤4)将孵育后细胞培养皿中的PI染液分别吸出，移至ImL的离心管中，将离心管中的PI染液分别加入96孔板中(100 μ L/孔)。用酶标仪测荧光度，激发波长为530nm， 发射波长为620nm，每个污染物浓度作三个平行样。步骤5)无细胞空白时的PI的荧光值为U。，未进入细胞的剩余PI量的荧光值为U, 各浓度污染物受试细胞后，PI摄入率即进入细胞的PI染液的比例，可用以下公式求出PI 摄入率=[(Utl-U)/U。] X 100%图1为本发明方法测得的经不同浓度的TCP受试后Vero细胞的PI摄入率。如附图1所示，PI摄入率随着TCP (2. 5-lOmg/L)浓度的升高而增大，说明在TCP的作用下细胞膜受损。当TCP的浓度分别大于10mg/L时，PI摄入率即进入细胞的PI量反而减少，这是因为在污染物高浓度下，污染物对细胞增殖产生明显的抑制作用，导致细胞数量减少，因此测得的进入细胞的PI量反而减少。比较例1为了将本发明的方法与现有的方法的灵敏度进行对照比较，我们还同时做了细胞增殖抑制率分析(MTT比色实验)，MTT法是用来检测污染物毒性的传统方法，可作为现有的检测细胞毒性的技术方法的代表。实验步骤如下以1 X IO5个/mL的密度将Vero细胞接种到96孔板，加生长培养基至120 μ L。培养过夜后分别换成含不同浓度TCP污染物(0-80mg/L)的培养液，每个浓度作6个复孔。同时，设对照(含0. 001 % DMS0/0. 5 %乙醇)，空白(不含细胞)。培养4 后加入20 μ LMTT溶液，放置4h，轻轻吸去培养板各孔溶液，加入120 μ L酸化异丙醇，震荡IOmin或放置40min， 用酶标仪在570nm波长下测定吸光度，650nm为参比波长，做了三次平行实验，取平均值。其中MTT溶液实验前用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)溶液新鲜配制，浓度为5mg/mL，过滤除菌后，4°C避光保存，保存时间不超过2周。图2为MTT方法测定的TCP对Vero细胞增殖的抑制率。TCP的浓度从30mg/L变化到80mg/L，细胞增殖抑制率从17. 增长到74. 8%。然而，当污染物的浓度较低时，MTT 的结果不稳定，甚至出现负值，即污染物对细胞的生长有促进作用，这是不合理的。这说明 MTT法不适合检测TCP在低浓度下的毒性，更适合判断污染物的半致死率。实施例2PFOS对Vero细胞的毒性的测试步骤1)将PFOS溶于双蒸水中，配成IOmM的母液，然后用生长培养基将母液稀释到不同浓度，配成含PFOS浓度分别为0，10，15，20，25，30，40，50mg/L的培养基；步骤2)将Vero细胞从Φ IOOmm的培养皿中消化下来，以4Χ IO5个/mL的密度接种到Φ60mm的培养皿中，加入含有0，10，15，20，25，30，40，50mg/L的PFOS培养基，细胞孵育 24h。步骤3)受试后，除去培养基，并用PBS溶液洗细胞三次，然后在每皿中加入ImL的 PI染液(50 μ g/mL)，于暗处室温下孵育IOmin。步骤4)将孵育后细胞培养皿中的PI染液分别吸出，移至ImL的离心管中，将离心管中的PI染液分别加入96孔板中(100 μ L/孔)。用酶标仪测荧光度，激发波长为530nm， 发射波长为620nm，每个污染物浓度作三个平行样。步骤5)无细胞空白时的PI的荧光值为Utl，未进入细胞的剩余PI量的荧光值为U, 各浓度污染物受试细胞后，PI摄入率即进入细胞的PI染液的比例，可用以下公式求出PI 摄入率=[(U0-U)/UJ X 100%图3为本发明方法测得的经不同浓度的PFOS受试后Vero细胞的PI摄入率。PI 摄入率随着PF0S(10-25mg/L)浓度的升高而增大，说明在PFOS的作用下细胞膜受损。当 PFOS的浓度分别大于25mg/L时，PI摄入率即进入细胞的PI量反而减少，这是因为在污染物高浓度下，污染物对细胞增殖产生明显的抑制作用，导致细胞数量减少，因此测得的进入细胞的PI量反而减少。比较例2
为了将本发明的方法与现有的方法进行对照比较，我们还同时做了细胞增殖抑制率分析(MTT比色实验)，实验步骤如下以1 X IO5个/mL的密度将Vero细胞接种到96孔板，加生长培养基至120 μ L。培养过夜后分别换成含不同浓度PFOS污染物(0-250mg/L)的培养液，每个浓度作6个复孔。同时，设对照(含0. 001 % DMS0/0. 5 %乙醇)，空白(不含细胞)。培养4 后加入20 μ LMTT溶液，放置4h，轻轻吸去培养板各孔溶液，加入120 μ L酸化异丙醇，震荡IOmin或放置40min， 用酶标仪在570nm波长下测定吸光度，650nm为参比波长，做了三次平行实验，取平均值。图4为MTT方法测定的PFOS对Vero细胞增殖的抑制率。PFOS的浓度从50mg/L 变化到250mg/L，细胞增殖抑制率从21. 9%增长到83. 5%。然而，当污染物的浓度较低时， MTT的结果不稳定，甚至出现负值，即污染物对细胞的生长有促进作用，这是不合理的。这说明MTT法不适合检测TCP或PFOS在低浓度下的毒性，更适合判断污染物的半致死率。通过PI染色法和MTT法的结果比较，可以发现PI染色法要比MTT法更灵敏。在低浓度范围内，进入细胞的PI量与污染物的浓度变化一致，即随着污染物浓度的上升，进入细胞的PI值增多。而由MTT法得到的细胞增殖抑制率在污染物低浓度时却上下波动，不能准确反映污染物对细胞的毒性大小。因此，对于低浓度的有机污染物，PI染色法是一种比MTT法灵敏的毒性检测方法。PI染色法与MTT法的结果不同，可能是因为两种方法检测细胞毒性的原理不同。 PI染色法是判断细胞膜的受损程度，而MTT法是检测活细胞体内线粒体脱氢酶的活性。而细胞质膜是细胞抵御外来物质入侵的第一道屏障，它比线粒体的功能更容易受到影响，这就可以解释为什么PI染色法比MTT法更灵敏。上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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权利要求
1.一种微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)配制含有非极性有机污染物的Vero细胞培养基；2)采用步骤1)配制的培养基对Vero细胞进行受试；3)受试后，除去培养基，在细胞培养皿中加入PI染液，于暗处室温下孵育；4)将孵育后细胞培养皿中的PI染液吸出，测所吸出的PI染液的荧光度；通过计算PI 摄入率来判断细胞膜的受损程度，进而判断非极性有机污染物的细胞毒性大小。
2.根据权利要求1所述的微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法，其特征在于 所述的非极性有机污染物选自2，4，6_三氯苯酚或全氟辛烷磺酰基化合物中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法，其特征在于 所述的非极性有机污染物的浓度为O 50mg/L的培养基。
4.根据权利要求1所述的微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法，其特征在于 所述的步骤幻的受试包括以下步骤将Vero细胞以IO4 IO6个/mL的密度接种到培养皿中，加入步骤1)所述的培养基，培养18 Mh。
5.根据权利要求1所述的微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法，其特征在于 所述的步骤3)包括以下步骤加入1 5mL浓度为10 100 μ g/mL的PI染液，每个培养皿中加入的PI染液量一致，于暗处室温下孵育10 20min。
6.根据权利要求1所述的微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法，其特征在于 所述的步骤幻中加入PI染液前，进一步包括用磷酸盐缓冲液冲洗细胞的步骤。
7.根据权利要求1所述的微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法，其特征在于 所述的步骤4)包括以下步骤将PI染液分别加入96孔板中，100 200 μ L/孔，用酶标仪测其荧光度，其中酶标仪激发波长为530nm，发射波长为620nm。
8.根据权利要求1所述的微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法，其特征在于 所述的PI摄入率计算公式如下各浓度污染物受试细胞，PI摄入率即进入细胞的PI染液的比例；PI 摄入率=[(U0-U) /U0] X 100%无细胞空白时的PI的荧光值为Utl，未进入细胞的剩余PI量的荧光值为U。
全文摘要
本发明属于环境工程技术领域，公开了一种使用Vero细胞检测微量非极性有机污染物毒性的定量检测方法，该方法包括以下步骤1)配制含有非极性有机污染物的Vero细胞培养基；2)采用步骤1)配制的培养基对Vero细胞进行受试；3)受试后，除去培养基，在细胞培养皿中加入PI染液，于暗处室温下孵育；4)将孵育后细胞培养皿中的PI染液吸出，测所吸出的PI染液的荧光度；通过计算PI摄入率来判断细胞膜的受损程度，进而判断非极性有机污染物的细胞毒性大小。使用本发明的方法灵敏度高于常用的基于细胞增殖抑制率的细胞毒性测定方法-MTT法。本发明的测定方法特别适用于评价微量非极性有机污染物的细胞毒性，弥补了MTT法的不足。
文档编号G01N21/64GK102505037SQ20111032800
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者付小花, 廖婷婷, 王磊, 贾入文, 贾建伟, 陈金海 申请人:同济大学