专利名称：一种红外光谱测定低浓度蛋白质二级结构的方法
技术领域：
本发明属于红外光谱分析技术领域，具体涉及一种红外光谱测定低浓度蛋白质二级结构的方法。
背景技术：
蛋白质是一类与生命相关的生物大分子，是生命体最重要的组成部分之一。蛋白质二级结构是指多肽链骨架的局部空间结构，不考虑侧链的构象及整个肽链的空间排列。常见的测定蛋白质二级结构的方法有X射线晶体衍射、核磁共振光谱、圆二色光谱、紫外光谱、荧光光谱与红外光谱法等。X射线晶体衍射是确定蛋白质构象最准确的方法。虽然其能够提供完整的蛋白质晶体结构信息，但它要求高质量的单晶样品，对结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质来说，得到所需的晶体结构较为困难。核磁共振(NuclearMagnetic Resonance,简称NMR)技术可以测定蛋白质在溶液中的构象，但一般限于研究分子量不超过20 kD的较小的蛋白，而且对样品的需求量大、纯度要求高并且整个测定过程较慢，因而也受到较大的限制。圆二色谱(Circular Dichroism，简称⑶)法被广泛地用于测定溶液状态下蛋白质和多肽构象的研究，但是只限于很窄的浓度范围内的澄清的溶液，且误差很大。紫外和荧光光谱只限于测定蛋白质分子中少数含有芳香族和杂环族的共轭环系统的发色团(如Trp，Try，Phe) ο 红夕卜光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopic,简禾尔 FT-IR)属于分子振动吸收光谱，是化合物鉴定和结构分析的常用手段。其独特之处在于可以测定不同状态、不同环境中的蛋白质和多肽的二级结构。因此它是目前研究蛋白质及多肽结构与功能关系的有效手段之一。然而在水溶液情况下，要得到高质量的红外图谱，一般要求蛋白质的浓度很高(>12mg/ml)。当蛋白质的浓度下降时，红外图谱的质量严重下降，特别是在对蛋白质构象敏感的酰胺I带。随着噪音干扰的强度增加，二阶导数的组成峰发生扭曲，这将直接影响蛋白质二级结构计算的准确度。这一传统方法对于蛋白质浓度的要求使得红外光谱在研究蛋白质二级结构时受到限制，比如对疫苗的研究、对一些难溶性蛋白质的研究等等。更为重要的是，由于荧光光谱和圆二色谱等技术研究蛋白质时要求浓度很低，而传统红外光谱方法要求浓度很高，二者互相比较时就存在很大不确定性。因此建立一种测定低浓度蛋白质二级结构含量的红外光谱方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、测试效率高的用红外光谱测定低浓度蛋白质二级结构的方法。本发明提出的红外光谱测定低浓度蛋白质二级结构的方法，采用蛋白质分析红外光谱仪，具体步骤如下
1、制备氢氧化铝-蛋白质复合物，具体步骤为
a.质量浓度为洲氢氧化铝胶体和蛋白质对应的缓冲液(如50 mM Tris, PH 7.8，100 mM KCl, 1 mM EDTA)按体积比为1 4_1 6混合，以低转速4000_5000rpm (每分钟转数，revolutions per minute)离心 2-3 分钟；
b.去除上清液，用缓冲液(如50mM Tris, PH 7.8,100 mM KCl, 1 mM EDTA)将步骤a中得到的氢氧化铝沉淀重悬至原浓度；
c.将低浓度(为0.5mg/ml-l. 5mg/ml)的蛋白质和步骤b中所得的氢氧化铝胶体按体积1:8-1:12混合，摇勻后放置室温孵化30-40分钟；
d.将步骤c中所得的混合物以转速4000-5000rpm离心2_3分钟，去除上清液；
2、收集谱图将由缓冲液洗过的的氢氧化铝胶体均勻的铺满蛋白质分析红外光谱仪的6. 5um固定光程的CaF2样品池，使用Prota数据处理软件收集背景光谱；在相同条件下，将氢氧化铝-蛋白质复合物均勻的铺满CaF2样品池，调节固定样品池，使得和背景的光程一样，收集样品的红外光谱3、谱图处理使用Prota数据处理软件，将氢氧化铝-蛋白质复合物的红外图谱扣除氢氧化铝胶体的背景图谱；位于2000 ^-1750 CnT1间呈一条光滑直线作为背景扣除与否的标志；使用Prota软件中Mvitsky-Golay求导功能对蛋白质吸收光谱进行二次求导，获得二级导数谱，并作基线修正。。氢氧化铝是一种纤维状粒子，这种粒子聚集后以松散的形式存在，粒子大小I-IOum。其表面可以吸附大量的蛋白质。将氢氧化铝胶体和低浓度蛋白质溶液混合后，蛋白质吸附在氢氧化铝表面，形成氢氧化铝-蛋白质复合物。本发明将氢氧化铝-蛋白质复合物作为红外光谱样品用于蛋白质二级结构的测定。商品化的氢氧化铝佐剂实际上是Al (OH)3的不完全脱水产物，即纤维状结晶的偏氢氧化铝。不同生产批次间的商用氢氧化铝粒径可能有差异，目前以丹麦生产的Alhydrogel为公认标准，其胶粒大小为3. 07um，通过传统红外光谱法测得氢氧化铝佐剂的比表面积约为514m2/g。本发明实施例中选用上述丹麦生产的产品。本发明的优点在于本发明在保持蛋白质二级结构不变和高质量红外图谱的前提下，对蛋白质样品浓度的要求可低至0. 5mg/ml，和传统方法相比，至少降低了 M倍，拓宽了红外光谱对蛋白质研究的范围，且操作简单、方便，不需要对蛋白质进行浓缩，节省了大量时间，提高了测试效率。更重要的是，该发明使得蛋白红外光谱能和荧光光谱及圆二色谱这二种常用的研究蛋白质结构的光谱技术可以直接进行比较。
图1为传统方法测定环磷酸腺苷受体蛋白(CRP)浓度分别为3，6，9，12，15 mg/ml时的红外吸收图谱。图2为传统方法测定CRP浓度分别在3，6，9，12，15 mg/ml时的酰胺I带的红外二级导数图谱。图3为浓度从上到下分别为0. 5，1. 0，1. 5 mg/ml的CRP-AL (OH) 3复合物的红外光谱和传统方法测定15 mg/ml CRP的红外图谱的比较。图4为浓度分别为0.5，1.0，1.5 mg/ml的蛋白激酶(PK)与AL(OH)3复合物的红外光谱和传统方法测定15mg/mlH(的红外图谱的比较。图5为浓度分别为0. 5，1. 0，1. 5mg/ml的钙调蛋白(CaM)与AL(OH) 3复合物的红外光谱和传统方法测定15 mg/ml CaM的红外图谱的比较。图6为浓度分别为0. 5，1. 0，1. 5 mg/ml的蛋白磷酸化酶(CN)和AL(OH)3复合物的红外光谱和传统方法测定15 mg/ml CN的红外图谱的比较。
具体实施例方式实施例1
采用蛋白质分析红外光谱仪，该红外光谱仪分辨率McnT1，波长范围4000 011^-450cm-1，扫描次数3次\秒，扫描总数120次；
(a) 1 ml质量浓度为洲氢氧化铝胶体(Breentagg公司)和5mlTEK缓冲液(50 mMTris, PH 7. 8，100 mM KCl, 1 mM EDTA)混合后(两者体积比为1:5)，以转速5000 rpm离心2分钟；
(b)去除上清液，用TEK缓冲液将步骤(a)中得到的氢氧化铝沉淀重悬至原浓度；
(c)取浓度为0.5 mg/ml和1. 0 mg/ml, 1. 5mg/ml的环磷酸腺苷受体蛋白(CRP)等蛋白各50 ul，分别和500 ul步骤(b)中所得的洲氢氧化铝混合后，室温孵化30分钟；
(d)将步骤(c)中所得的混合物以转速5000rpm离心2分钟，去除上清液，得氢氧化铝和CRP等蛋白的复合物；
(e)步骤(b)所得氢氧化铝胶体均勻的铺满6.5 um固定光程的红外光谱CaF2样品池，收集背景光谱。参数分辨率4 cnT1，波长范围4000 ^-450 cnT1，扫描次数3次\秒，扫描总数120次；
(f)在和步骤(e)参数设置相同条件下，将氢氧化铝-蛋白复合物均勻的铺满CaF2样品池，调节固定样品池的螺丝，使得和背景的光程一样后，收集样品的红外光谱(g)谱图处理使用数据处理软件，将步骤(f)得到的氢氧化铝-环磷酸腺苷受体蛋白复合物的图谱扣除步骤(e)得到的氢氧化铝胶体的背景图谱，得到氢氧化铝-环磷酸腺苷受体蛋白复合物的红外吸收图谱，位于2000 ^-1750 cnT1间呈一条光滑直线作为背景扣除与否的标志。使用Prota软件中Mvitsky-Golay求导功能对蛋白质吸收光谱进行二次求导，获得二级导数谱，并作基线修正；
(f)将步骤(g)获得的0. 5 mg/ml, 1. 0 mg/ml, 1. 5 mg/ml的氢氧化铝-蛋白复合物二级导数谱和传统方法测定的蛋白浓度为15mg/ml时的红外二级导数图谱进行比较，结果表明环磷酸腺苷受体蛋白(CRP)在低浓度0. 5mg/ml, 1. Omg/ml, 1. 5mg/ml时的二级导数图谱和高浓度15mg/ml时的二级导数图谱基本重合，说明环磷酸腺苷受体蛋白和氢氧化铝结合后，在保持较高的红外图谱质量时，蛋白质的二级结构并没有发生明显的变化。实施例2:
蛋白质为丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, HO，缓冲液为50 mM Tris, PH 7.5，其他条件与实施例1相同。结果表明丙酮酸激酶(PK)在低浓度0. 5mg/ml, 1. Omg/ml, 1. 5mg/ml时的二级导数图谱和高浓度15mg/ml时的二级导数图谱基本重合，说明丙酮酸激酶和氢氧化铝结合后，在保持较高的红外图谱质量时，蛋白质的二级结构并没有发生明显的变化。实施例3:
蛋白质为钙调蛋白(Calmodulin，CaM)，缓冲液为 50 mM Tris, 100 mM NaCl, PH 7.5。其他条件与实施例1相同。结果表明钙调蛋白(CaM)在低浓度0. 5mg/ml, 1. Omg/ml, 1. 5mg/ml时的二级导数图谱和高浓度15mg/ml时的二级导数图谱基本重合，说明钙调蛋白和氢氧化铝结合后，在保持较高的红外图谱质量时，蛋白质的二级结构并没有发生明显的变化。
实施例4:
蛋白质为蛋白磷酸化酶(CalcineurimCN)，其他与实施例3相同。结果表明蛋白磷酸化酶(CN)在低浓度0. 5mg/ml, 1. Omg/ml, 1. 5mg/ml时的二级导数图谱和高浓度15mg/ml时的二级导数图谱基本重合，说明蛋白磷酸化酶和氢氧化铝结合后，在保持较高的红外图谱质量时，蛋白质的二级结构并没有发生明显的变化。
权利要求
1. 一种红外光谱测定低浓度蛋白质二级结构的方法，其特征在于具体如下(1)制备氢氧化铝-蛋白质复合物，具体步骤为a.将质量浓度为洲氢氧化铝胶体和蛋白质对应的缓冲液按体积比为1:4-1:6混合，以低转速4000-5000rpm离心2_3分钟；b.去除上清液，用缓冲液将步骤a中得到的氢氧化铝沉淀重悬至原浓度；c.将浓度为0.5mg/ml-l. 5mg/ml的蛋白质和步骤b中所得的氢氧化铝胶体按体积1:8-1:12混合，摇勻后放置室温孵化30-40分钟；d.将步骤c中所得的混合物以转速4000-5000rpm离心2_3分钟，去除上清液；(2)收集谱图将由缓冲液洗过的氢氧化铝胶体均勻的铺满蛋白质分析红外光谱仪的.6. 5um固定光程的CaF2样品池，使用Prota数据处理软件收集背景光谱；在相同条件下，将氢氧化铝-蛋白质复合物均勻的铺满CaF2样品池，调节固定样品池，使得和背景的光程一样，收集样品的红外光谱图；(3)谱图处理使用Prota数据处理软件，将氢氧化铝-蛋白质复合物的红外图谱扣除氢氧化铝胶体的背景图谱；位于2000 ^-1750 CnT1间呈一条光滑直线作为背景扣除与否的标志，使用软件中Mvitsky-Golay求导功能对蛋白质吸收光谱进行二次求导，获得二级导数谱，并作基线修正。
全文摘要
本发明属于红外光谱分析技术领域，具体为一种红外光谱测定低浓度蛋白质二级结构的方法。本发明利用氢氧化铝胶体对蛋白质的吸附性，浓缩低浓度蛋白质，形成氢氧化铝-蛋白质复合物，用于红外光谱检测。该发明使得红外光谱在测定蛋白质二级结构时，对蛋白质浓度的要求降低至0.5mg/ml，和传统红外光谱测定蛋白质二级结构方法相比对蛋白质浓度的要求至少下降了24倍。本发明方法操作简单、测试效率高。
文档编号G01N21/35GK102393379SQ20111035378
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者余绍宁, 吁亭, 高铮亚 申请人:复旦大学