专利名称：一种肝癌标志物多抗免疫质谱试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多抗免疫质谱试剂盒及其检测方法。
背景技术：
原发性肝癌是目前世界上发病率最高的癌症之一，早期诊断的恶性肿瘤五年生存率可以达到70-95%，而晚期肿瘤的五年生存率只有20-30%。在治疗手段不能很快改善的前提下，提高恶性肿瘤的早期诊断率，达到恶性肿瘤的早发现、早治疗是改善恶性肿瘤患者总体生存率、提高生活质量、降低医疗费用的有效手段。目前临床常用的诊断手段包括体格检查、影像学检查、血清肿瘤标记物检测以及病理检查。由于癌瘤早期体积微小，肝脏又隐匿于上腹深部，有肋骨做屏障，采用B超、CT扫描等手段均难以早期发现；再者，肝脏具有强大的代偿功能，早期常无临床症状，也给肝癌的早期诊断带来困难。虽然，病理检查虽然是诊断金标准，但取材困难，且多为有创检查，不适于进行人群筛查。而血清肿瘤标记物以其非侵入性、重复性好在理论上已成为人群筛查恶性肿瘤的理想手段。血清蛋白质组学技术的进步，包括检测血清样品分离和规模化制备技术，高通量、 高灵敏度、高分辨率蛋白质分析和鉴定技术，生物信息学及统计分析技术，均为蛋白质组学用于恶性肿瘤筛查、早期诊断、病情监测、判断预后奠定了技术基础，但肿瘤标记物蛋白质组发现技术仍面临很多困难。首先，体液尤其是血清样品成分极其复杂，除了含有有机小分子化合物及无机盐等干扰物外，成千上万的蛋白质和多肽动态波动范围很广；许多疾病特异性蛋白为低丰度蛋白；样本处理过程中，可能在去除高丰度蛋白的同时将目标蛋白同时去除。其次，是实验重复性的问题，质谱技术具有高灵敏性、高通量的特点，可以提供巨大的信息量。但实验过程中很多因素可能影响质谱分析的结果。如样本的收集、处理、保存，检测的条件甚至检测时的温度、湿度都可能多结果产生影响。另外，从已有的研究发现，采用不同的质谱系统、不同的样本处理方法和不同的生物信息学方法，对同样的疾病进行处理可能得到不同的结果。近几年兴起的生物质谱已成功应用于几种癌的诊断研究，如乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌等，主要采用的是表面增强激光解吸离子化(SELDI)技术和免疫磁珠技术。Petricoin 等在美国FDA/OTH的临床蛋白质组计划资助下，利用蛋白芯片富集血清中的多肽或蛋白质，应用SELDI-TOF MS技术产生健康人和患者的血清多肽图，再利用生物信息学手段对血清多肽图的组成等模式进行分析，成功地对早期卵巢癌进行了诊断。结果显示，50例卵巢癌患者全部正确检出，其中18例为I期卵巢癌患者；66倒妇科良性肿瘤患者中正确检出63 例。该方法检测卵巢癌的敏感性、特异件和阳性预测使分别为100%，95%和94%，显著优于传统的CA125检测，特别是对早期卵巢癌(I期)的诊断也十分成功，提示此项技术有望用于卵巢癌的早期或预警检测。但随着临床应用，研究人员进一步改进和提高了 SELDI技术，将本来在固体芯片上进行的样品纯化和富集过程改为用磁珠来进行，改善了重复性较差、检测灵敏度和特异度不高等缺点。2006年Villanueva等采用免疫磁珠和生物质谱技术对32例前列腺癌、21例乳腺癌和20例膀胱癌血清多肽研究，发现14个、10个和58个可分别作为前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌的肿瘤标志多肽，预测准确率为100%。该技术可以对血液等样本中低分子量的蛋白/多肽有效富集和分析，同时它还具有SELDI不具有的优点，如富集后的样品容易洗脱用于鉴定。但该体系与SELDI-T0F-MS同样存在价格昂贵，不利推广的缺点。因此，寻找成本较低、富集能力强、重复性高的血清生物标志物富集检测技术成为重要研究热点之一。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明一种肝癌标志物的多抗免疫质谱检测试剂盒。本发明提供的肝癌标志物的多抗免疫质谱检测试剂盒，其包括血清多肽多克隆抗体和缓冲液，所述多克隆抗体固定在固相载体上，所述固相载体为包被蛋白A(Pr0tein A) 或蛋白G(Pr0tein G)的琼脂糖颗粒。其中，所述多克隆抗体为抗合成肽6抗体，所述合成多肽6的全长序列为NLGHG HKHDR DHGHG HQ。其中，所述缓冲液优选地为0. Olmol/L、pH7. 4的PBS缓冲液。本发明选用的包被蛋白A或蛋白G的琼脂糖颗粒(Protein A Agarose/Protein G Agarose)是免疫沉淀的基质，与蛋白A或包被蛋白G的磁珠(Protein A magnetic beads/ Protein G magnetic beads)相比，更具成本低的优点。本发明提供的多抗免疫质谱检测试剂盒，优选还含有洗脱液，所述洗脱液选自PH 2. 7的0. lmol/1甘氨酸-HCl溶液、含0. 1 % TFA的70% ACN的混合液、含0. 1 % TFA的50% ACN的混合液或5%乙酸。本发明优选的抗合成肽6抗体按照如下步骤制备1)采用偶联载体蛋白KLH的合成多肽6作为免疫原，结合弗氏完全佐剂与不完全佐剂免疫大耳白兔；2) 3-4周后耳缘静脉采血检测滴度，滴度在1 50000以上达到取血标准；3)颈动脉取血，得到多抗血清；4)采用亲和层析方法纯化多克隆抗体。本发明还提供所述多抗免疫质谱检测试剂盒的制备方法，该方法包括如下步骤将纯化后的所述多克隆抗体与所述固相载体悬浮液混合，所得浓度为0. 075 μ g/ μ L-0. 6 μ g/ μ L，在4°C旋转孵育5分钟_4小时，放置l-5min沉淀，过滤，用0. 01mol/L、 pH7. 4的PBS缓冲液100-200 μ L清洗所述固相载体2_5次，得到所述多肽免疫检测试剂盒。本发明还提供应用所述试剂盒在离血清中多肽标志物抗原的方法，其包括如下步骤1)取15_25μ1固相载体，置于Eppendorf管中，加入1. 5 μ g-Μ μ g多克隆抗体，4°C旋转混合5分钟-4小时，放置l-5min，移出上清液，用0. 01M、pH7. 4 PBS缓冲液 100-200 μ L清洗所得固相载体沉淀2-5次；2)取用10-40 μ 1血清样品、10-50 μ L PBS,与步骤1)清洗后的所述固相载体混合，4°C旋转混合8-Mh ；3)放置l-5min，移出上清液，用100-200 μ L PBS清洗沉淀2_5次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净Eppendorf管中；4)加入10-15 μ L洗脱液，吸排混合l-5min ；
5)离心，取上清液。本发明还提供免疫质谱检测多肽标志物的方法，应用本发明试剂盒分离出的多肽标准品、血清多肽标志物抗原，进行MALDI-T0F-MS检测，检测峰值与理论峰值小于0. 3Da, 即说明该峰是标志物峰。其中MALDI-T0F-MS的检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，N2激光器，激光波长337nm，能量2500，离子延迟提取时间390ns，质谱信号单次扫描累加2000 次，使用P印tide II standard kit离子峰校正，质量扫描范围lOOO-lOOOODa。本发明选取了肝癌的多种多肽标志物，相应制备了多种多克隆抗体，经检测分析及数据统计，意外的发现其中一种多克隆抗体检测特异度和灵敏度远高于其它几种，表明该标志物具有较强的肝病诊断能力。由此提供含有该多克隆抗体的免疫质谱检测试剂盒和检测方法。本发明的免疫质谱技术采用多克隆抗体，增强了富集特异性，同时制备过程简化， 进一步降低免疫质谱试剂盒成本。本发明将常规免疫测试技术和最先进的质谱测试技术有机结合起来，充分利用两技术高特异性、高通量、高准确性、高灵敏性、低假阳性等优势，是诊断技术的最新前沿。
图1为本发明的多抗免疫质谱检测方法示意图。图2为本发明实施方案中合成肽6标准样品的质谱图。图3为本发明实施方案中肝癌血清样品的质谱图。图4所示为本发明试剂盒的检测特异度和灵敏度。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1抗合成肽6多克隆抗体的制备方法1)采用偶联载体蛋白KLH的合成多肽6作为免疫原免疫大耳白兔；其全长序列为NLGHGHKHDRDHGHGHQ(SEQ ID No. 1)。1)采用偶联载体蛋白KLH的合成多肽6作为免疫原，结合弗氏完全佐剂与不完全佐剂免疫大耳白兔；2) 3-4周后耳缘静脉采血检测滴度，滴度在1 50000以上达到取血标准；3)颈动脉取血，得到多克隆抗体血清；4)采用亲和层析方法纯化多克隆抗体。实施例2多抗免疫检测试剂盒的制备方法取20 μ 1 包被蛋白 A 的琼脂糖颗粒(Protein A Agarose, Santa Cruz)，置于0. 2mL Eppendorf管中，加入7. 5 μ g实施例1制备的多抗，4°C旋转(转速5r/min)，混合1小时， 放置2分钟，移出上清液，用IOOyL PBS缓冲液(0. Olmol/1、ρΗ7· 4)清洗所得固相载体沉淀3次。实施例3多抗免疫检测试剂盒的制备方法取25 μ 1 包被蛋白 A 的琼脂糖颗粒(Protein A Agarose, Santa Cruz)，置于0. 2mLEppendorf管中，加入M μ g实施例1制备的多抗，4°C旋转(转速5r/min)，混合2小时，放置3分钟，移出上清液，用IOOyL PBS缓冲液(0. Olmol/1、ρΗ7· 4)清洗所得固相载体沉淀 5次。实施例4多抗免疫检测试剂盒的制备方法取15 μ 1 包被蛋白 G 的琼脂糖颗粒(Protein G Agarose, Santa Cruz)，置于0. 2mL Eppendorf管中，加入4. 5 μ g实施例1制备的多抗，4°C旋转(转速5r/min)，混合4小时， 放置3分钟，移出上清液，用IOOyL PBS缓冲液(0. Olmol/1、ρΗ7· 4)清洗所得固相载体沉淀3次。实施例5多抗免疫质谱检测方法本发明的多肽免疫质谱检测方法的流程如图1所示。具体为1)取 20 μ L 包被蛋白 A 的琼脂糖颗粒(Protein A Agarose, Santa Cruz)，置于 0. 2mL Eppendorf管中，加入7. 5yg实施例1制备的多抗，4°C旋转(转速5r/min)，混合 0. 5小时，放置2min，移出上清液，用100 μ L PBS缓冲液(0. 01mol/l、pH7. 4)清洗ftOtein G Agarose 3 次；2)取M μ g合成肽6的多肽标准品(固相化学合成，北京中科亚光生物科技有限公司)、50 μ L PBS,与清洗后的ftOtein G Agarose混合，4°C旋转混合12h ；3)放置 3min，移出上清液，用 200 μ L PBS 清洗 ftx)tein G Agarose 3 次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净Eppendorf管中；4)加入15 μ L 5%乙酸洗脱液，吸排混合;3min ；5)离心，取上清液，用MALDI-T0F-MS检测，谱图如图2所示。从图谱中可以看出， 多肽标准品峰明显，与理论偏差小于0. IDa0其中，检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，N2激光器，激光波长337nm，能量2500，离子延迟提取时间(Pulse ion extraction，PIE) 390ns，质谱信号单次扫描累加2000次，使用ρ印tide II standard kit (Bruker)离子峰校正(m/z 700-m/z ；3500)，质量扫描范围1000 10000Da。结果表明，经本发明的方法检测合成肽6标准品，得到的MALDI-T0F MS质谱图具有分辨率高、特异性强的特点。实施例6多抗免疫质谱检测方法本发明的多肽免疫质谱检测方法的流程如图1所示。具体为1)取 15 μ L 包被蛋白 G 的琼脂糖颗粒(Protein G Agarose, Santa Cruz)，置于 0. 2mL Eppendorf管中，加入4. 5yg实施例1制备的多抗，4°C旋转(转速5r/min)，混合 4小时，放置:3min，移出上清液，用100 μ LPBS缓冲液(0. 01mol/l、ρΗ7. 4)清洗Protein G Agarose 3 次；2)取M μ g合成肽6多肽标准品(固相化学合成，北京中科亚光生物科技有限公司)、50 μ L PBS,与清洗后的ftOtein G Agarose混合，4°C旋转混合16h ；3)放置 2min，移出上清液，用 200 μ L PBS 清洗 ftx)tein G Agarose 3 次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净Eppendorf管中；4)加入含0. 1 % TFA的50 % ACN洗脱液，吸排混合!Bmin ；5)离心，取上清液，用MALDI-T0F-MS检测，检测图谱表明多肽标准品峰明显，与理论偏差小于0. IDa0其中，检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，队激光器，激光波长337nm，能量2500，离子延迟提取时间(Pulse ion extraction，PIE) 390ns，质谱信号单次扫描累加2000次，使用ρ印tide II standard kit (Bruker)离子峰校正(m/z 700-m/z ；3500)，质量扫描范围1000 lOOOODa。实施例7多抗免疫质谱检测方法本发明的多肽免疫质谱检测方法的流程如图1所示。具体为1)取 20 μ L 包被蛋白 A 的琼脂糖颗粒(Protein A Agarose, Santa Cruz)，置于 0. 2mL Eppendorf管中，加入7. 5yg实施例1制备的多抗，4°C旋转(转速5r/min)，混合 1小时，放置anin，移出上清液，用100 μ LPBS缓冲液(0. 01mol/l、ρΗ7. 4)清洗ft~。tein G Agarose 3 次；2)取30 μ L合成肽6多肽标准品(固相化学合成，北京中科亚光生物科技有限公司)、50 μ L PBS,与清洗后的ftOtein GAgarose混合，4°C旋转混合8h ；3)放置 3min，移出上清液，用 200 μ L PBS 清洗 ftx)tein G Agarose 3 次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净Eppendorf管中；4)加入5 μ L 5 %乙酸洗脱液，吸排混合;3min ；5)离心，取上清液，用MALDI-T0F-MS检测，多肽标志物峰值与理论偏差小于 0. 2Da。谱图中杂峰较少，显示出目标峰有较高特异性。6)另取30 μ L检测100例确诊肝癌血清、100例正常血清，用MALDI-T0F-MS检测。 肝癌血清的质谱图如图3所示。所得图3与图2相似，其中杂峰较少，显示出目标峰有较高特异性。图4显示本发明的方法敏感度83. 0%、特异度93. 3%。其中，检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，队激光器，激光波长337nm，能量2500，离子延迟提取时间(Pulse ion extraction，PIE) 390ns，质谱信号单次扫描累加2000次，使用ρ印tide II standard kit (Bruker)离子峰校正(m/z 700-m/z ；3500)，质量扫描范围1000 lOOOODa。试验例1 按照实施例1相同的方法，以合成肽5 (NLGHG HKHER DQGHG HQ)(已知的肝癌标志物)(SEQ ID No. 2)、合成肽 6(NLGHG HKHDR DHGHG HQ)(肽 5 的突变多肽)(SEQ ID No. 1)、 合成肽 7 (NLGHG HKHKH DQGHG HQ)(肽 5 的突变多肽)(SEQ ID No. 3)和合成肽 8 (NLGHG HKHKR DHGHG HQ)(肽5的突变多肽)(SEQ ID No. 4)为免疫原获得各自的多克隆抗体。根据实施例7的方法，检测100例确诊肝癌血清、100例正常血清，结果如下表所示。
权利要求
1.一种肝癌标志物的多抗免疫质谱检测试剂盒，其特征在于，包括血清多肽多克隆抗体和缓冲液，所述多克隆抗体固定在固相载体上，所述固相载体为包被蛋白A或蛋白G的琼脂糖颗粒，所述血清多肽多克隆抗体为抗合成肽6多克隆抗体，所述合成多肽6的全长序列如 SEQ ID No. 1 所示。
2.根据权利要求1所述的多抗免疫质谱检测试剂盒，其特征在于，还含有洗脱液，所述洗脱液选自PH 2.7的0. lmol/1甘氨酸-HCl溶液、含0. 1% TFA的70% ACN的混合液、含 0. 1% TFA的50% ACN的混合液或5%乙酸。
3.根据权利要求1所述的多抗免疫质谱检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为 0. 01M, pH7. 4 的 PBS 缓冲液。
4.根据权利要求1 3任一项所述的多抗免疫质谱检测试剂盒，其特征在于，所述抗合成肽6多克隆抗体按照如下步骤制备1)采用偶联载体蛋白KLH的合成多肽6作为免疫原，结合弗氏完全佐剂与不完全佐剂免疫大耳白兔；2)3-4周后耳缘静脉采血检测滴度，滴度在1 50000以上达到取血标准；3)颈动脉取血，分离出多抗血清；4)采用亲和层析方法纯化多克隆抗体。
5.权利要求1 4任一项所述的多抗免疫质谱检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤将纯化后的所述多克隆抗体与所述固相载体悬浮液混合，所得浓度为 0. 075 μ g/ μ L-0. 6 μ g/ μ L,在4 °C旋转孵育5分钟-4小时，放置l-5min沉淀，过滤，用 0. 01mol/L、pH7. 4的PBS缓冲液100-200 μ L清洗所述固相载体2_5次，得到所述多肽免疫检测试剂盒。
6.应用权利要求1 4任一项所述的试剂盒分离血清中多肽标志物抗原的方法，其包括如下步骤1)取15-25μ1固相载体，置于Eppendorf管中，加入1. 5 μ g-Μ μ g多克隆抗体，4°C 旋转混合5分钟-4小时，放置l_5min，移出上清液，用0. 01M、pH7. 4PBS缓冲液100-200 μ L 清洗所得固相载体沉淀2-5次；2)取用10-40μ 1血清样品、10-50 μ L PBS,与步骤1)清洗后的所述固相载体混合，4°C 旋转混合8-Mh ；3)放置l-5min，移出上清液，用100-200μ L PBS清洗沉淀2_5次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净Eppendorf管中；4)加入10-15μ L洗脱液，吸排混合l-5min ；5)离心，取上清液。
7.一种多肽标志物抗原的免疫质谱检测方法，其特征在于，将根据权利要求6分离的血清中的多肽标志物抗原进行MALDI-T0F-MS检测。 全文摘要
本发明涉及一种肝癌标志物的多抗免疫质谱检测试剂盒，其包括血清多肽多克隆抗体和缓冲液，所述多克隆抗体固定在固相载体上，所述固相载体为包被蛋白A或蛋白G的琼脂糖颗粒，所述血清多肽多克隆抗体为抗合成肽6多克隆抗体，所述合成多肽6的全长序列如SEQ ID No.1所示NLGHG HKHDR DHGHG HQ。本发明选取了肝癌的多种多肽标志物，相应制备了多种多克隆抗体，经检测分析及数据统计，意外的发现其中一种多克隆抗体检测特异度和灵敏度远高于其它几种，表明该标志物具有较强的肝病诊断能力，由此提供含有该多克隆抗体的免疫质谱检测试剂盒和检测方法。
文档编号G01N33/574GK102507936SQ201110353728
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者付海媛, 侯利平, 原剑, 周晓明, 孙云波, 张拓, 杨保安, 王东茂, 甄蓓, 肖汉族, 郑俊杰, 魏开华, 黄亚娟 申请人:北京正旦国际科技有限责任公司, 湖南金健药业有限责任公司