专利名称：一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒以其制备方法
技术领域：
:本发明涉及的体外试剂盒技术领域，具体地说是一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒以其制备方法。
背景技术：
:动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)性血管疾病已成为威胁国人健康的"头号杀手"，随着我国经济的发展，发病率呈逐年上升趋势，我国每年用于该类疾病的医疗费用高达千亿元人民币，加强AS性血管疾病及其并发症的防治已成为我国重大疾病防治的主要任务。AS性血管疾病引发的急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)是临床最常见和最严重的表现，而冠脉易损斑块破裂继发血栓形成是其发生的最主要病理基础。目前作为冠心病诊断“金标准”的冠状动脉造影并不能很好的识别易损斑块，易损斑块的识别和诊断主要依赖于血管内超声及血管镜等介入影像学手段，可以显示血管壁的病变，精确地区别病变的性质来识别易损斑块，但却不能检测斑块中的炎症活性，更由于其为有创性检查，技术条件要求高且费用较昂贵，限制了它的推广应用。因此，寻找能反映AS易损斑块敏感而特异性的血清学标志物，并通过有效干预，在易损斑块破裂前，早期将其识别并使之趋向稳定，有望达到减少ACS发生的目的。但现有的诊断试剂盒多集中于借助外周血清标志物提高对ACS的诊断敏感性和特异性方面，在改善患者的危险分层和预后判断方面的相关试剂盒还是一个空白，而这方面恰恰是目前临床患者管理所急需的。液相芯片技术(xMAP)也称为流式荧光技术，是一种可广泛应用于蛋白、基因、受体/配体等多种生物反应的生物芯片技术平台，主要包括微球、探针分子、被检测物和报告分子四种成分，其微球在制作过程中使用不同配比的两种红色分类荧光染料将微球(微球分为直径为5.6 μ m的聚苯乙烯微球和6.5 μ m的磁性微球,两种微球主要在后期的洗漆和适用的仪器有所不同，原理一致)染成不同的荧光色，从而获得多达100种荧光编码的微球。把针对不同待测物的抗体分子或者基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码微球上，每个编码微球都对应相应的检测项目。先把针对不同待测物的荧光编码微球混合，然后加入待测物质或者待测的扩增片段，所形成的复合物再与标记荧光素发生结合反应。微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光，红激光用来判定微球的荧光编码，绿激光用来测定微球上报告分子的荧光强度。从而达到快速准确的定量检测目的。由于所有反应均处在液相环境，更有利于保持蛋白质的天然构想，使探针和被检测物的反应更快更完全，因此检测灵敏度和线性范围均得到极大的提高
发明内容
:本发明的目的在于提供一种改进的用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒以其制备方法，它可克服现有技术中诊断试剂盒多集中于借助外周血清标志物提高对ACS的诊断敏感性和特异性方面，在改善患者的危险分层和预后判断方面的相关试剂盒还是一个空白，同时现有试剂盒的制备方法复杂、稳定性差、应用效果不佳的一些不足。为了实现上述目的，本发明的技术方案是:一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒，其特征在于:所述的液相芯片试剂盒包括有以下组分:I)包被微球:微球主要包括两类,一种直径为5.6μηι的聚苯乙烯微球和另一种6.5 μ m的磁性微球，上述两类微球分别包被了 ox-LDL捕获抗体的微球、包被了 s⑶40L捕获抗体的微球、包被了 MMP-9捕获抗体的微球、包被了 TF捕获抗体的微球、包被了 omentin捕获抗体的微球和包被了 esRAGE捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；2)生物素标记检测抗体:含有分别用生物素标记的ox-LDL、s⑶40L、MMP_9、TF、omentin及esRAGE的检测抗体；3)链亲合素藻红蛋白。一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于:所述的制备方法包括有如下步骤:I)按照上述试剂盒的组成，制备相应的抗体包被微球:分别选取不同的微球，经涡旋或超声悬浮20-25秒；将50 μ I微球活化后，离心条件为彡8000g,离心1-2分钟；吸去上清，将微球重悬于250 μ I 50mM的MES的溶液中，涡旋25_30秒，超声25-30秒，离心收集活化后的微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟；重复该步骤一次；吸去上清，将微球重悬于100 μ I 50mM的MES的溶液中，涡旋25_30秒，超声25-30秒，加入I μ g的抗体，用50mM的MES的溶液将总体积补至500 μ I ;经涡旋震荡混匀，室温避光振荡3小时；离心收集偶联抗体的微球，离心条件为> 8000g，离心2-3分钟；吸去上清，将微球重悬于500 μ 1的PBS-TBN溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，室温避光震荡30分钟，离心收集微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟；吸去上清，将微球重悬于Iml的PBS-TBN溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，离心收集微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟重复该步骤一次；吸去上清，将微球重悬于600 μ I的PBS-TBN溶液中，将包被好的微球送往Luminex仪器或流式细胞仪计数；包被好抗体的微球置于2-8度避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择等比例混合。2)进行每种检测抗体的生物素标记:依据蛋白浓度计算反应体系:计算将抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，为目标体积(V)，配制NHS-Biotin反应液(用DMSO溶解，终浓度为10mg/ml);按摩尔比I: 100的比例在反应管中分别加入检测抗体和N-Biotin反应液；加入1/10V的碳酸氢钠溶液(pH8.9)；加入PBS溶液补至目标体积；包上铝箔或放入避光暗盒中，将反应管或避光暗盒置于圆周震荡器上，于25度恒温箱中避光孵育5小时，转速为IOOOrpm ；将反应管中的液体转至透析卡中，于1000倍体积的PBS缓冲液中透析过夜两次，以去除未反应的NHS-Biotin，测定蛋白浓度。
使用时，本发明的所公开的液相芯片试剂盒可以同时完成多种血清标志物的定量检测，从而达到对急性冠脉综合患者的危险分层和预后判断，还具有检测效率高，所需样本量少，特异性强，灵敏度高等优点，同时检测的血清标志物以ox-LDL、TF、s⑶40L为核心，通过与剩余的esRAGE、MMP-9和omentin进行不同搭配,可实现从损伤和修复两个角度全面综合评估患者的预后情况。同时本发明的制备方法简单易行，稳定性好，其技术方案中的各种工艺参数如微球和抗体的量、反应过程等均是在大量实验基础上得出的，为制备过程最佳的参数值。
图1为本发明正常对照人群和ACS患者外周血ox-LDL水平(μ g/ml)的对照表。
图2为本发明正常对照人群和ACS患者外周血s⑶40L水平(ng/ml)的对照表。
图3为本发明正常对照人群和ACS患者外周血TF水平(ng/ml)的对照表。
图4为本发明正常对照人群和ACS患者外周血MMP-9水平(ng/ml)的对照表。
图5为本发明正常对照人群和ACS患者外周血omentin水平(ng/ml)的对照表。
图6为本发明正常对照人群和ACS患者外周血esRAGE水平(ng/ml)的对照表。
图7为本发明依据血清标志物进行ACS患者的危险分层的图表。
具体实施方式
:下面结合图表和实施例对本发明作进一步的描述。本发明的一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒，其特征在于:所述的液相芯片试剂盒包括有以下组分:I)包被微球:微球主要包括两类,一种直径为5.6μηι的聚苯乙烯微球和另一种
6.5 μ m的磁性微球，上述两类微球分别包被了 ox-LDL捕获抗体的微球、包被了 s⑶40L捕获抗体的微球、包被了 MMP-9捕获抗体的微球、包被了 TF捕获抗体的微球、包被了 omentin捕获抗体的微球和包被了 esRAGE捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；2)生物素标记检测抗体:含有分别用生物素标记的ox-LDL、s⑶40L、MMP_9、TF、omentin及esRAGE的检测抗体；3)链亲合素藻红蛋白。每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为120-130个/ μ I ;每种生物素标记检测抗体的使用浓度为1-4 μ g/ml ο一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于:所述的制备方法包括有如下步骤:I)按照上述试剂盒的组成，制备相应的抗体包被微球:分别选取不同的微球，经涡旋或超声悬浮20-25秒；将50 μ I微球活化后，离心条件为彡8000g,离心1-2分钟；吸去上清，将微球重悬于250 μ I 50mM的MES的溶液中，涡旋25_30秒，超声25_30秒，离心收集活化后的微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟；重复该步骤一次；吸去上清，将微球重悬于100 μ I 50mM的MES的溶液中，涡旋25_30秒，超声25_30秒，加入I μ g的抗体，用50mM的MES的溶液将总体积补至500 μ I ;经涡旋震荡混匀，室温避光振荡3小时；
离心收集偶联抗体的微球，离心条件为> 8000g，离心2-3分钟；吸去上清，将微球重悬于500 μ I的PBS-TBN溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，室温避光震荡30分钟，离心收集微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟；吸去上清，将微球重悬于Iml的PBS-TBN溶液中，涡旋25_30秒，超声25_30秒，离心收集微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟重复该步骤一次；吸去上清，将微球重悬于600 μ 1的PBS-TBN溶液中，将包被好的微球送往Luminex仪器或流式细胞仪计数；包被好抗体的微球置于2-8度避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择等比例混合。2)进行每种检测抗体的生物素标记:依据蛋白浓度计算反应体系:计算将抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，为目标体积(V)，配制NHS-Biotin反应液(用DMSO溶解，终浓度为10mg/ml);按摩尔比I: 100的比例在反应管中分别加入检测抗体和N-Biotin反应液；加入1/10V的碳酸氢钠溶液(pH8.9)；加入PBS溶液补至目标体积；包上铝箔或放入避光暗盒中，将反应管或避光暗盒置于圆周震荡器上，于25度恒温箱中避光孵育5小时，转速为1000rpm ；将反应管中的液体转至透析卡中，于1000倍体积的PBS缓冲液中透析过夜两次，以去除未反应的NHS-Biotin，测定蛋白浓度。所述活化微球的步骤如下:用涡旋振荡器或者超声波悬浮微球；取50 μ I微球离心收集沉淀，离心条件为彡8000g,离心1-2分钟；去掉上清液，将微球悬于100 μ I的双蒸水中，用润旋振荡器或者超声波悬浮微球20-25秒，离心收集沉淀，离心条件为彡8000g，离心1-2分钟；吸弃上清，加入80 μ I的磷酸盐缓冲液(ρΗ6.2)，涡旋振荡20_25秒，超声波悬浮微球20-25秒； 加入10 μ 1 50mg/ml的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)，用涡旋振荡器轻轻地混匀；加入10μ1 50mg/ml的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用涡旋振荡器轻轻地混匀；室温避光静置20min，每10分钟使用涡旋振荡器轻轻地混匀。各种溶液的配方如下:50mM的MES缓冲液，pH5.0, 500ml配方如下:将购自Sigma公司的MES4.88g溶于450ml双蒸水中，加入事先配置好的0.1M的氢氧化钠溶液调节pH值至5.0,经0.22 μ m无菌滤器过滤后，4度冰箱备用；PBS配方:将购自Takara公司的PBS片剂10片，溶于IOOOml双蒸馏水中，再加入NaCl 8, 000mg, KCl 200mg, Na2HPO4 1150mg, KH2PO4 200mg，高压灭菌后常温备用。PBS-TBN配方，pH为7.4,将购自Amresco公司的BSAlg,购自Sigma公司的Tween-20,0.2ml和叠氮钠500mg,溶于购自takara公司的IL配好的PBS溶液,搅拌混勻。不同的微球指分别包被了ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin 及 esRAGE 捕获抗体的不同微球，上述不同的微球购置于美国Luminex公司。本发明根据大量的文献资料结合之前对三十多种血清标志物的筛选，从中确定了ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin和esRAGE这六种有助于ACS患者危险分层和预后判断的血清生物标志物，利用液相芯片平台进行这六种指标的同步并行检测。ox-LDL、sCD40L、MMP-9和TF是与ACS病程密切相关的几个介导血管损伤的血清生物学标志物，Omentin和esRAGE是近期新发现的两种介导保护作用的因子，大量研究表明其与ACS患者的血管病变的严重程度呈负相关，但现有的研究多采用上述的一种或两种因子进行相关实验，对于ACS患者的整体情况缺乏一个全方面的了解，因此我们拟采用上述因子联合应用于ACS患者的危险分层和临床预后判断，其中ox-LDL、sra40L、MMP-9和TF用于评估患者受致病因素的损伤情况，Omentin和esRAGE用于患者内在的自我保护机制激活情况，两者可以根据实际情况进行相互组合进行应用。目前，对于上述血清标志物的测定已有多种检测方法，包括免疫荧光分析、酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)等，但这些技术一次只能针对一个标志物进行检测，且操作繁琐、敏感度各异，不能真正满足临床的需要，此外由于各种血清标志物在ACS的病程中有不同的表达，上述问题使得各个指标在ACS患者的危险分层和预后判断中的价值各异，若能同时检测，则能大幅度提高ACS患者危险分层和预后判断的准确度。而固相生物芯片技术存在着重复性差、敏感度不高及操作繁琐的缺点。实施例1急性冠脉综合征患者危险分层和预后判断的液相芯片的制备及抗原的检测本发明所述的捕获抗体为分别能对应与ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin及esRAGE特异性结合的单克隆抗体；所述的检测抗体为分别能与OX-LDL、Sra40L、MMP_9、TF、omentin及esRAGE特异性结合的单克隆或多克隆抗体。本实施例中所用的“ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin 及 esRAGE” 的捕获抗体与检测抗体分别购自Abeam、Santa cruz、Invitrogen和Millipore公司。不同编号的微球(表面羧基修饰)、链霉亲和素-藻红蛋白均购置于美国Luminex公司。EDC、S-NHS 和 S-NHS-Biotin 均购置于 Pierce 公司。本实施例中，所述各种溶液的配方如下:l、50mM的MES缓冲液(ρΗ5.0)配方(500ml):将购自Sigma公司的MES(货号为M5287)4.88g溶于450ml双蒸水中，加入事先配置好的0.1M的氢氧化钠溶液调节pH值至
5.0，经0.22 μ m无菌滤器过滤后，4度冰箱备用。2、PBS配方:将购自Takara公司的PBS片剂(货号T900) 10片，溶于1000ml双蒸馏水中(NaCl 8，OOOmg, KCl 200mg, Na2HPO41150mg, KH2PO4 200mg)，高压灭菌后常温备用。3、PBS-TBN 配方(即 PBS 中含有 0.1 % 的 BSA，0.02 % 的 Tween_20，0.05 % 的叠氮钠，pH为7.4),将购自Amresco公司的BSA(货号为0903) Ig,购自Sigma公司的Tween-20 (货号为P2287)0.2ml和叠氮钠500mg(货号为S8032)，溶于IL实现配好的PBS溶液(购自takara公司，货号T900)搅拌混勻。4、急性冠脉综合征患者危险分层和预后判断的液相芯片试剂盒，包括有:1)包被微球:含有分别包被了 ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin及esRAGE捕获抗体的不同微球；2)生物素标记检测抗体:含有分别用生物素标记的ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin及esRAGE的检测抗体；3)链亲和素藻红蛋白(SA-PE，10 μ g/ml) ；4)配套的分析缓冲液；5)微球标准品；6)质控液一 ；7)质控液二 ；8)血清基质液；9)封口膜；10)滤板。5、制备上述液相芯片试剂盒，包括有如下步骤:I)按照上述试剂盒的组成，制备抗体包被微球，(每种捕获抗体包被微球的制备方法相同):分别选取不同的微球(购置于美国Luminex公司)，经润旋或超声悬浮20_25秒；取50 μ I微球于1.5ml离心管中，离心条件为彡8000g，离心1-2分钟；吸去上清液，将微球重悬于100 μ I的双蒸水中，用涡旋或超声悬浮20-25秒，离心收集沉淀，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟；先后加入各10 μ I 50mg/ml的S-NHS和EDC，经涡旋混匀；室温避光静置25-30分钟，每10分钟使用涡旋混匀一次；离心收集活化后的微球，离心条件为彡8000g,离心1-2分钟；吸去上清，将微球重悬于250 μ I 50mM的MES(pH5.0)的溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，离心收集活化后的微球，离心条件为> 8000g,离心1-2分钟；重复该步骤一次；吸去上清，将微球重悬于100 μ I 50mM的MES (pH5.0)的溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，加入I μ g的抗体，用50mM的MES (pH5.0)的溶液将总体积补至500 μ I ;经涡旋震荡混匀，室温避光 振荡3小时；离心收集偶联抗体的微球，离心条件为> 8000g，离心2-3分钟；吸去上清，将微球重悬于500 μ I的PBS-TBN溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，室温避光震荡30分钟，离心收集微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟；吸去上清，将微球重悬于Iml的PBS-TBN溶液中，涡旋25_30秒，超声25_30秒，离心收集微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟重复该步骤一次；吸去上清，将微球重悬于600 μ I的PBS-TBN溶液中，将包被好的微球送往Luminex仪器或流式细胞仪计数；包被好抗体的微球置于2-8度避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择等比例混合。2)按照上述试剂盒的组成，进行每种检测抗体的生物素标记:依据蛋白浓度计算反应体系:计算将抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，为目标体积(V)，配制NHS-Biotin反应液(用DMSO溶解，终浓度为10mg/ml);按摩尔比I: 100的比例在反应管中分别加入检测抗体和N-Biotin反应液；加入1/10V的碳酸氢钠溶液(pH8.9)；加入PBS溶液补至目标体积；包上铝箔或放入避光暗盒中，将反应管或避光暗盒置于圆周震荡器上，于25度恒温箱中避光孵育5小时，转速为IOOOrpm ；将反应管中的液体转至透析卡中，于1000倍体积的PBS缓冲液中透析过夜两次，以去除未反应的NHS-Biotin，测定蛋白浓度。6、进行检测，包括以下步骤:I)使用前取出所有试剂，放置平衡至室温15-30分钟；
2)标准品的稀释:每个标准品设置6个稀释度，然后等比例混合，使得各自的终浓度为所需的浓度，每个浓度的标准品在稀释完后须用涡旋彻底混匀三次后才可用于下一浓度的稀释，混匀过程中可使用高速离心以减少可能产生的泡沫对后续稀释的影响。各管的稀释方法及理论浓度:3)根据不同孔板(96或384孔滤孔板)的布局以及仪器读数的顺序确定标准品、质控品、待测样品及空白孔的位置；在设置好的孔板布局中，每孔加入25μ I的分析缓冲液，再分别加入25μ I的标准品、质控品和待测样品到各自孔中，空白孔加25μ I的分析缓冲液；4)分别取出上述制备的六种捕获抗体偶联微球，经涡旋和超声分别处理30秒后等比例混合，使得混合液中微球的浓度均为125个/μ I。往每孔中加入的六种捕获抗体偶联微球的混合悬液25μ I。微球应当在临用前混匀，且混匀后应即刻应用，避免微球沉淀；5)用封口膜封住所有加样孔，并用锡箔包住孔板或放入避光暗盒内以避光，25度放置在微孔板振荡器上以800转速度震荡，孵育I小时，然后通过真空抽滤装置吸去缓冲液，使用洗涤缓冲液洗涤两次，再加入缓冲液；6)随后每孔加入25μ I上述制备的生物素标记的检测抗体的混合液，用封口膜封住整块板，并用锡箔包裹避光，25度放置在微孔板振荡器上以800转速度震荡，再孵育I小时，孵育完成后通过真空抽滤装置吸去缓冲液，使用洗涤缓冲液洗涤两次，再加入缓冲液；7)每孔加入25μ I链亲和素藻红蛋白，用封口膜封住整块板，并用锡箔包裹，25度放置在微孔板振荡器上以800转速度震荡，再孵育半小时，孵育完成后通过真空抽滤装置吸去缓冲液，使用洗涤缓冲液洗涤两次，再加入缓冲液；8)于液相芯片分析仪上读取结果，绘制标准曲线并计算出待测样品的数值。
9)上述操作为配合聚苯乙烯微球，使用滤孔板和手动或自动真空抽吸装置实现整块板的快速洗涤操作，当配合的为磁性微球时，则既可使用上述操作流程，也可改用磁吸附板和自动或手动洗板装置完成快速洗涤操作。7、实验结果分析:具体参见表1-2和图1-图7。表1.正常对照组外周血清标志物浓度值
^~ox-LDL~IsCD40L^ TF |~ΜΜΡ-9~|~Omentin~|esRAGE~
正常对照组
(pg/ml) (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml)(ng/ml)
1440.0 0230.0 170.0 456.0046
2430.04~0220.0 160.0 480.0045
3410.04~5210.0 130.0 490.0044
4400.02 205.0 120.0 440.0043
5408.0Z5208.0 110.0 470.0042表2.ACS组外周血清标志物浓度值
权利要求
1.一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒，其特征在于:所述的液相芯片试剂盒包括有以下组分: 1)包被微球:微球主要包括两类，一种直径为5.6 μ m的聚苯乙烯微球和另一种6.5 μ m的磁性微球，上述两类微球分别包被了 ox-LDL捕获抗体的微球、包被了 SCD40L捕获抗体的微球、包被了 MMP-9捕获抗体的微球、包被了 TF捕获抗体的微球、包被了 omentin捕获抗体的微球和包被了 esRAGE捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码； 2 )生物素标记检测抗体:含有分别用生物素标记的ox-LDL、s⑶40L、MMP-9、TF、omentin及esRAGE的检测抗体；3)链亲合素藻红蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒，其特征在于:每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为120-130个/μ I ;每种生物素标记检测抗体的使用浓度为1-4 μ g/mL.
3.根据权利要求1所述的一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于:所述的制备方法包括有如下步骤: O按照上述试剂盒的组成，制备相应的抗体包被微球: 分别选取不同的微球，经涡旋或超声悬浮20-25秒；将50 μ I微球活化后，离心条件为^ 8000g， 离心1-2分钟； 吸去上清，将微球重悬于250 μ I 50mM的MES的溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，离心收集活化后的微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟；重复该步骤一次； 吸去上清，将微球重悬于100 μ I 50mM的MES的溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，加入I μ g的抗体,用50mM的MES的溶液将总体积补至500 μ I ; 经涡旋震荡混匀，室温避光振荡3小时；离心收集偶联抗体的微球，离心条件为^ 8000g，离心2-3分钟； 吸去上清，将微球重悬于500 μ I的PBS-TBN溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，室温避光震荡30分钟，离心收集微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟； 吸去上清，将微球重悬于Iml的PBS-TBN溶液中，涡旋25-30秒，超声25-30秒，离心收集微球，离心条件为> 8000g，离心1-2分钟重复该步骤一次； 吸去上清，将微球重悬于600 μ I的PBS-TBN溶液中，将包被好的微球送往Luminex仪器或流式细胞仪计数；包被好抗体的微球置于2-8度避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择等比例混合； 2)进行每种检测抗体的生物素标记:依据蛋白浓度计算反应体系:计算将抗体溶液稀释至lmg/ml的体积，为目标体积(V)，配制NHS-Biotin反应液(用DMSO溶解，终浓度为10mg/ml);按摩尔比1:100的比例在反应管中分别加入检测抗体和N-Biotin反应液；加入1/10V的碳酸氢钠溶液(pH8.9);加入PBS溶液补至目标体积； 包上铝箔或放入避光暗盒中，将反应管或避光暗盒置于圆周震荡器上，于25度恒温箱中避光孵育5小时，转速为IOOOrpm ； 将反应管中的液体转至透析卡中，于1000倍体积的PBS缓冲液中透析过夜两次，以去除未反应的NHS-Biotin，测定蛋白浓度。
4.根据权利要求3所述的一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于:所述活化微球的步骤如下:用涡旋振荡器或者超声波悬浮微球； 取50 μ I微球离心收集沉淀，离心条件为彡8000g，离心1-2分钟； 去掉上清液，将微球悬于100μ I的双蒸水中，用涡旋振荡器或者超声波悬浮微球20-25秒，离心收集沉淀，离心条件为彡8000g，离心1-2分钟； 吸弃上清，加入80 μ I的磷酸盐缓冲液(ρΗ6.2)，涡旋振荡20-25秒，超声波悬浮微球20-25 秒； 加入10μ I 50mg/ml的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)，用涡旋振荡器轻轻地混匀；加入10 μ I 50mg/ml的1-乙基_(3-二甲基氨基丙级)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用涡旋振荡器轻轻地混匀； 室温避光静置20min，每10分钟使用涡旋振荡器轻轻地混匀。
5.根据权利要求3所述的一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于:各种溶液的配方如下: 50mM的MES缓冲液，pH5.0，500ml配方如下:将购自Sigma公司的MES4.88g溶于450ml双蒸水中，加入事先配置好的0.1M的氢氧化钠溶液调节pH值至5.0，经0.22 μ m无菌滤器过滤后，4度冰箱备用； PBS配方:将购自Takara公司的PBS片剂10片，溶于IOOOml双蒸馏水中，再加入NaCl8,000mg, KCl 200 mg，Na2HPO4 1150 mg，KH2PO4 200 mg，高压灭菌后常温备用； PBS-TBN配方,pH为7.4,将购自Amresco公司的BSAlg,购自Sigma公司的Tween-20,0.2ml和叠氮钠500mg,溶于购自takara公司的IL配好的PBS溶液，搅拌混勻。
6.根据权利要求3所述的一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于:不同的微球指分别包被了 ox-LDL、sCD40L、MMP-9、TF、omentin及esRAGE捕获抗体的不同微球，上述不同的微球购置于美国Luminex公司。
全文摘要
本发明涉及一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒及其制备方法。液相芯片主要包括有分别包被了氧化性低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein,ox-LDL)、可溶性CD40配体(solubleCD40ligand,sCD40L)、基质金属蛋白酶9(matrixmetallopeptidase9,MMP-9)、组织因子(tissuefactor,TF)、网膜素(omentin)和内源性可溶性RAGE(endogenoussecretoryreceptorofadvancedglycationendproducts,esRAGE)捕获抗体的微球；生物素标记的检测抗体以及链亲和素藻红蛋白。本发明所提供的液相芯片具有检测效率高、所需样本量少、特异性强、灵敏度高、检测快速准确等优点。同时，该芯片同时反映了机体内保护性和损伤性因素水平的高低，以便更全面综合评估患者的危险分层和预后情况。同时本发明的制备方法简单易行，稳定性好，其技术方案中的各种工艺参数如微球和抗体的量、反应过程等均是在大量实验基础上得出的，为制备过程最佳的参数值。
文档编号G01N33/577GK103163295SQ20111040741
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者吴宗贵, 梁春, 贺治青, 张家友, 潘晓明, 樊民, 李玫, 丁茹, 甄奕, 伍锋, 朱琳, 王新, 刘焕波 申请人:吴宗贵, 梁春, 贺治青