专利名称：用双指示线免疫层析半定量诊断盐酸克伦特罗的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断盐酸克伦特罗的方法。
背景技术：
瘦肉精是一类动物用药的统称，任何能够促进动物瘦肉生长、抑制动物脂肪生长的化学药物均可叫做“瘦肉精”，主要包括盐酸盐酸克伦特罗、盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、特布他林等。将瘦肉精添加于饲料中，可以增加动物的瘦肉量，减少饲料使用量，促进肉品提早上市，降低成本。但因为考虑对人体会产生副作用，各国的开放使用标准不一。国内由于双汇瘦肉精事件，使得人们开始关注瘦肉精对于人体的危害。在我国所指的瘦肉精主要指的是盐酸克伦特罗。盐酸克伦特罗是一种平喘药，一类肾上腺类兴奋剂，20世纪80年代初，美国一家公司首先将其作为饲料添加剂使用，增加肉品的瘦肉率。但由于作为饲料添加剂的使用剂量为人用药剂量的10倍以上，才能达到提高瘦肉率的效果，用量大、使用时间长、代谢慢，在动物宰杀之前到上市，肉品残留量足以使人体积蓄中毒。如果一次摄入量过大，如烹食猪的肝脏或肺脏器官，就会产生异常生理反应的中毒现象，可导致心悸、心率失常、肌肉震颤、头疼、恶心、呕吐等症状，特别是对于高血压、心脏病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，严重的可导致死亡。任何国家及世界组织均禁止在饲料中添加盐酸克伦特罗。我国在2003年出台了动物性食品中的盐酸克伦特罗残留量测定标准，标准号为 GB/T5009. 192-2003。盐酸克伦特罗的主要检测方法为气相色谱-质谱法(GC-MQ、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、液相色谱-质谱/质谱法(HPLC-MS/MQ。我国将气相色谱-质谱法作为检测盐酸克伦特罗的确证性方法(NY/T468-2001)，其最低检测限为2ng/g。以上除ELISA外，均属于色谱法，主要是利用不同物质在不同相态的选择性分配，对混合物进行洗脱，混合物中的不同物质会以不同的速度沿固定相移动，已达到分离的效果。需要专门的高效液相色谱仪进行检验，价格昂贵且检测时间较长。而ELISA方法相较于色谱方法，仪器较为便宜，耗时类似，但操作步骤较为繁琐。免疫胶体金技术是20世纪70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。目前金标记技术常与膜载体配合，形成特定的免疫检测方式，如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊断的一个重要发展方向， 是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。近年来该技术发展迅速，已经在临床诊断特别是床边检测(POCT)中得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。免疫胶体金技术与ELISA技术同属于免疫学诊断方法， 均是依赖于抗原与抗体的特异性反应，但不需要专门的仪器设备，更适于现场及床旁快速检测。
利用竞争法免疫层析胶体金技术测定肉品中的盐酸克伦特罗的诊断试剂在市场上尚未有商品化的试剂盒，但已开发，但其仅为定性产品。本发明是运用双指示线检测方法，可对所检测肉品中的盐酸克伦特罗的含量进行定量检测，灰区因此，半定量胶体金试纸也是十分必要的。目前国内外均无相关的试纸条出售。
发明内容
本发明的目的开发简单、快速的盐酸克伦特罗方法具有十分重要的经济价值和社会价值。本实验采用胶体金免疫层析法，建立快速检测Clen的方法。并且能够半定量检测1. 5ng/mL 3ng/mL这一 Clen灰区范围。本发明是通过以下技术方案实现的采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗Clen单克隆抗体并均勻涂布于胶金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的Clen-BSA偶联物固定于两个检测线(即T线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即 C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。本发明方法包括如下步骤一、胶体金溶液配制1.配制氯金酸溶液；2.配制2%柠檬酸三钠溶液；3.将0. 02%的氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入2%的柠檬酸三钠2mL ；4.溶液由浅蓝色，深蓝，再加热出现酒红色，继续煮沸IOmin ；停止加热，继续搅拌至室温。二、胶体金标记物的制备1.取两个1. 5mL试管，分别加入ImL胶体金溶液；2.加入适量硼砂缓冲液把pH调整为7. 5 ；3.加入10 μ g/mL Clen单克隆抗体，使其达到最小蛋白浓度，混勻，振荡30min ；4.加入 20 μ L 的 10 % BSA,混勻，振荡 30min ；5. 12000rpm离心5min，轻轻吸除上清；6.用ImL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；7.重复5.步操作；8.重复6.步操作；9.重复5.步操作；10.用fix buffer配制在MOnm处OD (光密度)值为0. 5 1. 0的胶体金免疫复合物；11.玻璃纤维素膜点样，形成胶金垫，真空冻干3小时。三、在硝酸纤维素膜上划线1. Tl线用浓度为0. 7mg/mL的Clen-BSA偶联物划线，用于检出1. 5ng/mL的Clen ；2. T2线用浓度为1. 2mg/mL的Clen-BSA偶联物划线，用于检出3ng/mL的Clen ；3. C线用2. Omg/mL羊抗鼠多克隆抗体划线；
4.将硝酸纤维素膜置于40°C烘箱干燥3天。四、胶体金试纸条的组装1.将样品垫、胶金垫、NC膜和吸收垫4部分按顺序组装(见附图1)；2.将其组装好后用剪刀剪成4mm/条后进行检测。五、检测试纸平放，将样品加到检测条的样本垫上，由于毛细效应，液体的层析方向向前， 与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后，根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。C线与Tl线、T2线均出现红色指示线表明样本中Clen水平小于 1. 5ng/mL(见附图2)，C线与Tl线出现红色指示线，T2线不显色表明样本中的Clen水平在 1.5-3ng/mL之间(见附图3)。C线出现红色指示线，T1、T2线均不显色表明样本中的Clen 大于3ng/mL(见附图4)。本发明有益效果是提供一种用双指示线免疫层析半定量检测盐酸克伦特罗的新型试纸。检测速度快，所需时间短，只需5min ；能半定量检测样本中的Clen含量，给出样本更多的信息，灵敏度更高。不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测动物组织样本、尿液中盐酸克伦特罗(瘦肉精)的残留量，并且便于基层推广和运用。
图1为本发明实施例试纸条的图示图2为本发明实施例试纸条的阳性结果(盐酸克伦特罗水平小于1. 5ng/mL)图3为本发明实施例试纸条的阳性结果(盐酸克伦特罗水平为l-3ng/mL)图4为本发明实施例试纸条的阴性结果(盐酸克伦特罗水平大于3ng/mL)
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实例先用2%的柠檬酸三钠溶液制备20nm的金水，并标记Clen单克隆抗体喷金标垫，Clen-BSA偶联物、羊抗鼠多克隆抗体分别包被至检测线(T线)、质控线(C线)，然后组装成试纸条，置37°C烘箱烘干并裁成4mm/条，室温干燥保存备用。实施例1.准备Clen单克隆抗体和Clen-BSA偶联物。并清洗实验所需的玻璃器皿。2.胶体金的制备先将0. 02 %氯金酸溶液溶液加热煮沸，迅速加入2 %的柠檬酸三钠2mL ；溶液颜色由浅蓝色变为深蓝，继续加热出现酒红色，继续煮沸IOmin ；出现透明的酒红色，停止加热，继续搅拌至室温。这样就制备了 20nm的胶体金溶液。然后用电镜镜检， 确保制备的金颗粒尽量使其大小一致、均勻，颗粒直径在20nm左右，否则重新制作。3.胶体金标记物的制备
取两个1. 5mL试管，分别加入ImL胶体金溶液；向其中加入适量硼砂缓冲液把pH 调整为7. 5 ；加入10μ g/mL Clen单克隆抗体，使其达到最小蛋白浓度，混勻，于振荡仪上快速振荡30min ；加入20 μ L的10% BSA,混勻，振荡30min ；于离心机中12000rpm,离心5min， 轻轻吸除上清；用ImL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；于离心机中12000rpm， 离心5min，轻轻吸除上清；用ImL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；于离心机中12000rpm，离心5min，轻轻吸除上清；用fix buffer配制在MOnm处OD (光密度)值为 0. 5 1. 0的胶体金免疫复合物；在玻璃纤维素膜上点样，形成胶金垫，真空冻干3小时。4.胶体金试纸条的组装分别将0. 7mg/mL和1. 2mg/mL的Clen-BSA偶联物划在硝酸纤维素膜的检测线(T 线)上，将2.0mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划在质控线(C线)上。然后将硝酸纤维素膜置于烘箱中40°C干燥3天。然后将各个部分按附图1组装成试纸条。5.胶体金试纸条的使用及结果判读检测前，先提取被检者的血清样本。然后把试纸条试纸平放，将样品加到检测条的样本垫上，由于毛细效应，液体的层析方向向前，与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后，根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。C线与Tl线、T2线均出现红色指示线表明样本中Clen水平小于1.5ng/mL(见附图2)，C线与Tl线出现红色指示线，T2线不显色表明样本中的Clen 水平在1.5-3ng/mL之间(见附图3)。C线出现红色指示线，T1、T2线均不显色表明样本中的Clen大于3ng/mL(见附图4)。实施例可直接检测样品中的Clen，使用方法不需要专业培训，操作方便、快速， 5min即可获得结果，可达到快速、简便、及时地检测Clen的目的。
权利要求
1.一种用双指示线免疫层析半定量诊断盐酸克伦特罗的方法，其特征在于，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗Clen单克隆抗体并均勻涂布于胶体金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的偶联BSA的Clen抗原固定于两个检测线 (即T线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。
2.根据权利要求1所述的一种用双指示线免疫层析半定量诊断盐酸克伦特罗的方法， 其特征在于，抗体划线浓度为Tl线用浓度为0. 7mg/mL的盐酸克伦特罗-BSA偶联物划线，用于检出1. 5ng/mL的 Clen ；T2线用浓度为1. 2mg/mL的盐酸克伦特罗-BSA偶联物划线，用于检出3ng/mL的Clen ；C线用2. Omg/mL羊抗鼠多克隆载体划线；将硝酸纤维素膜置于40°C烘箱干燥3天。
3.根据权利要求1所述的一种用双指示线免疫层析半定量盐酸克伦特罗的方法，其特征在于，运用不同浓度的抗体溶液在相同的基质上划线，以胶体金方法检测多个不同浓度水平物质的方法。
全文摘要
本发明公开了一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断盐酸克伦特罗的方法。盐酸克伦特罗为我国瘦肉精的主要投用类型，为一种肾上腺素类兴奋剂，可导致人体心悸、肌肉震颤等症状，严重者可导致死亡。我国明令禁止使用盐酸克伦特罗作为饲料添加剂，且出台了相关检测标准。临床检测盐酸克伦特罗主要通过气相色谱法、高效液相色谱方法、液相色谱-质谱/质谱法及ELISA方法，但操作方法繁琐、耗时较长，并且需要昂贵的检测仪器设备及专门的检测操作人员。免疫胶体金技术近年来发展迅速，得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。本发明采用胶体金免疫层析法，建立快速检测盐酸克伦特罗的方法。并且能够通过两种T线以初步定量肉品中的盐酸克伦特罗的含量，满足市场需求。
文档编号G01N33/558GK102565407SQ20111043370
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者刘寅, 岳晓燕, 张有青, 王晶, 罗云萍, 霍五奎, 马雪明 申请人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司