专利名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒ppa-elisa抗体检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物技术领域，涉及ー种病毒抗体的快速诊断器具，具体是猪繁殖与呼吸综合征病毒PPA-ELISA抗体检测试剂盒。
背景技术：
猪繁通与呼吸综合征(Porcine!^productive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁通与呼吸综合征病毒病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus, PRRSV)引起猪的ー种急性、高度传染的病毒性疾病，是目前引起猪场繁殖障碍的主要疫病之一。临床上以母猪发热、厌食、早产、流产、木乃伊胎、死胎、产弱仔等繁殖障碍及各种年龄猪的呼吸困难和仔猪的高死亡率为特征。PRRSV主要侵害猪的单核巨噬细胞系统和淋巴系统，使得全身巨噬细胞、淋巴细胞的数量明显降低，机体防御机制受到破坏，使感染猪的免疫力降低，引发免疫抑制，易继发感染。本病最早在1987年爆发于美国，我国于1996年在北京某猪场首次发生此病，并分离出第一株PRRSV毒株。目前，该病毒几乎已传播到世界上所有养猪的国家，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。2006年夏季我国南方多个省份暴发猪无名高热病，并持续流行，其中变异的PRRSV是最主要病原。目前，猪繁殖与呼吸综合征病毒的诊断方法主要包括病毒的分离与鉴定、血清学方法及分子生物学检测方法。目前，尽管血清学方法不能有效区分疫苗毒与野毒产生的抗体，但由于其具有使用方便、一次检测量大和血清容易保存等优点而被广泛应用，在PRRSV的早期检测、流行病学调查和监测等方面有着重要的作用，也是免疫猪群抗体水平监测的主要方法。PRRSV抗体血清学方法主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、过氧化物酶单层试验(IPMA)、中和试验(SN)和间接免疫荧光试验(IFA)。IPMA、SN和IFA在检测时因为操作活毒而产生实验室安全隐患，且试验周期长、操作繁琐和不适于大批量样品检测，而ELISA诊断方法具有敏感性和特异性强、操作简单、检测快速、重复性好、高通量、无辐射、价格低廉等特点，是当前动物传染病检疫、流行病学调查、免疫抗体水平监测和实验室疫苗免疫效力评价广泛采用的血清学诊断技木。但目前PRRSV ELISA检测所用的抗原多为细胞培养的病毒，全病毒抗原由于受病毒培养和纯化等方面的技术限制，存在纯度有限、稳定性差、不易大批生产、容易散毒等缺点，难以满足国内PRRSV诊断和免疫检测的需要。PRRSV N蛋白具有很高的保守性，不同型N蛋白之间具有很高的同源性，具有良好的免疫原性和反应原性，是感染细胞内含量最丰富、免疫原性最強的蛋白，能激发机体产生较强的免疫应答，猪感染PRRSV后7d即可检出抗N蛋白抗体且维持时间可长达数月，因而纯化的重组N蛋白可以用来代替全病毒作为ELISA诊断抗原。以重组N蛋白作为诊断抗原建立的ELISA试剂盒，其生物安全性好，不存在散毒的危险，而且生产成本低，易于规模化生产。
发明内容本实用新型的目的是提供ー种简便、快速、敏感、特异、高通量的新型猪繁殖与呼吸综合征病毒PPA-ELISA抗体检测试剂盒，可有效检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平，用于猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗免疫的抗体水平监测和猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的血清学诊断以及流行病学调查。本实用新型的目的是这样实现的本设计的猪繁殖与呼吸综合征病毒PPA-ELISA抗体检测试剂盒为ー个盒体，盒体内含有ー个向上开ロ的泡沫存物槽，2块抗原包被板和I份使用说明书。该存物槽含有先后两排，前排依次为IOX样品稀释液存物槽、TMB底物溶液存物槽、终止液存物槽；后排依次为20X浓缩洗涤液存物槽、阳性对照血清存物槽、阴性对照血清存物槽、10X SPA酶标抗体存物槽。在泡沫存物槽的上面存放2块抗原包被板，在抗原包被板的上面存放使用说明书。与现有技术相比，本实用新型具有以下优点本实用新型抗原包被板所用的抗原为基因工程方法表达出的重组抗原，该重组蛋白只与猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清发生反应，与猪的其它疫病阳性血清不存在交叉反应，具有很强的特异性，能真实准确地反应猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗体水平。重组抗原表达所用的表达载体为pET30a (+)高效原核表达载体，该表达载体具有His标签，易于融合表达后重组蛋白的分离纯化。所用的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，表达性能稳定，且具有成本低廉，操作简单，易于培养，生产周期短等优点。本实用新型10XSPA酶标抗体为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)，SPA能与人、猪、兔等多种哺乳动物血清IgG的Fe段结合，使本试剂盒的应用范围更广。本实用新型可局限性的诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒野毒感染。出生后超过50日龄，未免疫过猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗，用本发明中的试剂盒检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性可诊断为猪繁殖与呼吸综合征病毒野毒感染。本实用新型具有操作简单，检测快速、成本低廉等特点，适合于大批量动物血清的普查，可在实际生产中广泛推广使用。
图I为猪繁殖与呼吸综合征病毒PPA-ELISA抗体检测试剂盒的外观主视图。图2为猪繁殖与呼吸综合征病毒PPA-ELISA抗体检测试剂盒横切面剖视图，即盒内设置的组成及位置示意图。图中，2块密封包装的抗原包被板1，30ml 20X浓缩洗涤液2,1ml阳性对照血3，Iml阴性对照血清4，2ml 10X SPA酶标抗5，IOml IOX样品稀释液6，20ml TMB底物溶液7，20ml终止液8，I份使用说明书9，盒体10。图3为抗原包被板结构图。
具体实施方式
①在Al和A2孔中分别加入100μ I阴性对照血清；在A3和Α4孔中分别加入100 μ I阳性对照血清；②将待检样品用样品稀释液(试剂盒内IOX样品稀释液需用蒸馏水或去离子水稀释后方可使用。如有结晶，需先溶解后，方可进行稀释)I : 100稀释后,取100 μ I加入相应孔中，并做好记录，室温或37°C孵育Ih ；③将各孔的液体弃入废液桶。每孔再加约300 μ I的洗涤液(试剂盒内20X浓缩洗涤液需用蒸馏水或去离子水稀释后方可使用。如有结晶，需先溶解后，方可进行稀释。)进行洗板，重复3 5次，每次2 3min ；④将10XSPA酶标抗体用样品稀释液(试剂盒内IOX样品稀释液需用蒸馏水或去离子水稀释后方可使用。如有结晶，需先溶解后，方可进行稀释)1 10稀释后，取ιοομ 加入相应孔中，室温或37 C鮮育Ih ；⑤重复步骤③；⑥每孔加100 μ I TMB底物溶液； ⑦室温孵育5min (尽量避开强光照射);⑧每孔加100 μ I终止液；立刻于450nm波长处测定各孔的吸光度值，即OD45tol值。⑨结果判定当阳性对照孔OD45tl值彡O. 4，阴性对照孔OD45tl值彡O. 2，且阳性对照孔 OD450值/阴性对照孔OD45tl值彡2. 1，试验结果有效。此时，检测样品OD45tl值彡O. 363时判为阳性，OD450值< O. 318时判为阴性；当O. 318彡OD450nm < O. 363时判为可疑。对可疑样本须重新检测，重检时，OD450nm彡O. 318为阳性，OD450nm < 0.318为阴性。备注试剂盒保存方式，试剂盒应置于2 8避光保存，开封后，应在6个月内用完。
权利要求1.猪繁殖与呼吸综合征病毒PPA-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于该检测试剂盒有ー个盒体，盒体内有基因工程表达的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白为包被抗原的密封检测板，洗涤用的20X浓缩洗涤液，阳性对照血清，阴性对照血清，IOXSPA酶标抗，IOX样品稀释液，TMB底物溶液，终止液，使用说明书。
2.根据权利要求I所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒PPA-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所用的包被抗原为pET30a(+)高效原核表达载体表达的重组N蛋白。
3.根据权利要求I所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒PPA-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所用的酶标抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白。
专利摘要本实用新型涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒PPA-ELISA抗体检测试剂盒。它包括一个盒体(10)，盒体内装有密封的抗原包被板(1)，20×浓缩洗涤液(2)，阳性对照血清(3)，阴性对照血清(4)，10×SPA酶标抗体(5)，10×样品稀释液(6)，TMB底物溶液(7)，终止液(8)，使用说明书(9)。抗原包被板所用的包被抗原为pET30a(+)高效原核表达载体表达的重组N蛋白。所用的酶标二抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)。使用说明书印制了猪繁殖与呼吸综合征病毒PPA-ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤和判定标准。本实用新型可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗免疫的抗体水平监测和猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的血清学诊断。本实用新型具有操作简单，检测快速、成本低廉等特点，适合于大批量动物血清的普查，可在实际生产中广泛推广使用。
文档编号G01N33/569GK202614765SQ20112055781
公开日2012年12月19日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者吴忆春, 李明, 刘治刚 申请人:滨州职业学院