专利名称：甘油磷脂的稳定化方法及使用该方法的试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗磷脂抗体等被测物的免疫测定试剂及该试剂中所使用的使甘油磷脂稳定化的方法。
背景技术：
抗磷脂抗体因下面二种疾病而在生物体内产生。一种是在感染了梅毒的病原体即梅毒螺旋体(Treponema Pallidum)的情况下,另一种是在一种叫抗磷脂抗体综合征的自身免疫疾病发病的情况下。任何抗磷脂抗体均为针对以磷脂类中的心磷脂为主要成分的磷脂抗原而产生的抗体，其诊断中所使用的检查试剂含有心磷脂。目前，作为使用上述磷脂的梅毒检查方法，正在使用的有以碳或高岭土粉末为载体的VDRL (性病研究实验室)法、RPR (快速血迹反应素)卡片试验法(非专利文献I)、以由聚苯乙烯共聚物等形成的乳胶为载体、用生化自动分析仪进行测定的乳胶凝集法(专利文献I)等。另一方面，作为磷脂抗体综合征的检查方法，用ELISA法进行测定(专利文献2)。作为用这些检查方法测定的检体，使用血清、血浆、脑脊液等。专利文献专利文献1:日本特开平7-103980号公报专利文献2:日本特开平6-148193号公报专利文献3:日本特开平10-282096号公报非专利文献非专利文献I:Public Health Reports Vol.75 (1960)，985-988
发明内容
一般情况下，通过对用抗原抗体反应进行的免疫凝集反应进行光学测定来诊断是否患有疾病的试剂有时会受到检体中的干扰成分的影响，测定值出现不规则降低。这种现象通过将被测物添加到生理盐水、缓冲液等不受检体中的干扰成分影响的溶液中时和在含有血清及血浆等干扰成分时测定值会有很大不同而变得明显。作为由发生这种现象所引发的问题，可以列举以下两点。(I)检体中的抗体量或抗原量少时，存在由于干扰成分的影响，免疫凝集反应不充分，虽然罹患疾病，但仍漏检的可能性。(2)为了测定含有测定试剂的测定范围以上的抗体量或抗原量的检体的准确的抗体量或抗原量，通常用生理盐水或血清等对该检体进行稀释，使抗体量或抗原量减少至测定范围内进行测定，之后乘以稀释倍数，算出准确的抗体量或抗原量。然而，由于生理盐水中不含上述干扰成分，用不含抗体的血清对检体进行稀释时和用生理盐水进行稀释时的测定结果会背离，不能准确测定抗体量或抗原量。
为了弄清这种血清、血浆中的干扰成分，本发明者进行了研究，结果发现，该干扰成分为内源性脂蛋白。进一步研究发现，只要向免疫反应的反应系中添加甘油磷脂即可回避该内源性脂蛋白对测定值的影响，可以更准确地测出检体中的抗体或抗原。通常，在测定抗磷脂抗体时，作为致敏剂而添加水溶性高分子，然而，已经发现，在试剂含有甘油磷脂的情况下，若添加一般使用的聚乙二醇等，则长期保存稳定性会出现问题。因此，本发明的课题在于提供一种使用甘油磷脂、用于准确稳定的免疫测定的试剂及其稳定化方法。因此，为了使使用甘油磷脂的免疫测定用试剂兼具稳定性和准确的测定值，本发明者做了各种研究，结果发现，未能通过添加聚乙二醇、普鲁兰多糖、含2 -甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的聚合物等而解决的长期保存稳定性在添加聚乙烯吡咯烷酮后得到显著改善，且可以准确测定被测物，由此完成了本发明。gp，本发明具有以下构成。(I) 一种试剂，其中，被测物为血中的抗体或抗原，在被测物为抗体时通过与抗原的免疫反应、在被测物为抗原时通过与抗体的免疫反应来测定被测物，其特征在于，在免疫反应的反应系中添加甘油磷脂及聚乙烯吡咯烷酮。(2) (I)所述的试剂，其中，甘油磷脂为选自磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺及磷脂酰丝氨酸中的一种以上。(3) (I)或(2)所述的试剂，其中，被测物为抗磷脂抗体，通过与磷脂抗原的免疫反应来测定前述抗体。(4) (3)所述的试剂，其中，磷脂抗原负载在不溶性载体上。(5) (3)或(4)所述的试剂，其中，被测物抗磷脂抗体为因梅毒感染而在血中出现的抗梅毒磷脂抗体。( 6 ) ( 3 )或(4 )所述的试剂，其中，被测物抗磷脂抗体为因自身免疫疾病抗磷脂抗体综合征而在血中出现的抗磷脂抗体。(7) 一种测定方法，其中，被测物为血中的抗体或抗原，在被测物为抗体时通过与抗原的免疫反应、在被测物为抗原时通过与抗体的免疫反应来测定被测物，其特征在于，在免疫反应的反应系中添加甘油磷脂及聚乙烯吡咯烷酮。(8) (7)所述的测定方法，其中，甘油磷脂为选自磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺及磷脂酰丝氨酸中的一种以上。(9) (7)或(8)所述的测定方法，其中，被测物为抗磷脂抗体，通过与磷脂抗原的免疫反应测定前述抗体。(10) (9)所述的测定方法，其中，磷脂抗原负载在不溶性载体上。(11) (9)或(10)所述的测定方法，其中，被测物抗磷脂抗体为因梅毒感染而在血中出现的抗梅毒磷脂抗体。(12) (9)或(10)所述的测定方法，其中，被测物抗磷脂抗体为因自身免疫疾病抗磷脂抗体综合征而在血中出现的抗磷脂抗体。(13) 一种含有甘油磷脂的液体的稳定化方法，其特征在于，向含有甘油磷脂的液体中添加聚乙烯吡咯烷酮。
(14) 一种使含有甘油磷脂的液体稳定化的试剂，其特征在于，以聚乙烯吡咯烷酮为有效成分。根据本发明，能提供一种在用免疫反应测定被测物时，可以回避内源性脂蛋白对免疫反应的影响且保存稳定性良好、能长时间发挥性能的试剂。
图1是研究I中的比较参考例I的结果，反应系中不含甘油磷脂。图2是研究I中的参考例2的结果，是反应系中含有0.06重量％鸡蛋黄来源的磷脂酰甘油时的结果。图3是研究2中的参考例I的结果，是反应系中含有0.12重量％鸡蛋黄来源的磷脂酰甘油时的结果。图4是研究2中的参考例2的结果，是反应系中含有0.06重量％鸡蛋黄来源的磷脂酰甘油时的结果。图5是研究2中的参考例3的结果，是反应系中含有0.03重量％鸡蛋黄来源的磷脂酰甘油时的结果。图6是研究2中的参考例4的结果，是反应系中含有0.03重量％的为合成磷脂酰甘油的1，2 一二肉豆蘧酰一 sn —甘油一 3 —磷酰甘油钠盐时的结果。图7是研究2中的参考例5的结果，是反应系中含有0.06重量％鸡蛋黄来源的磷脂酰乙醇胺时的结果。图8是研究2中的参考例6的结果，是反应系中含有0.03重量％的为合成磷脂酰胆碱的1，2 一二肉豆蘧酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱时的结果。图9是研究2中的参考例7的结果，是反应系中含有0.03重量％的为合成磷脂酰胆碱的I 一棕榈酰一 2 —硬脂酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱时的结果。图10是研究2中的参考例8的结果，是反应系中含有鸡蛋黄来源的磷脂酰甘油0.015重量％及鸡蛋黄来源的磷脂酰乙醇胺0.015重量％时的结果。图11是研究2中的比较参考例I的结果，是反应系中不含甘油磷脂时的结果。图12是实施例1的结果，是检体稀释液中含有0.43mg/mL鸡蛋黄来源的磷脂酰甘油且含有0.5重量％聚乙烯吡咯烷酮时的结果。图13是实施例2的结果，是检体稀释液中含有0.55mg/mL鸡蛋黄来源的磷脂酰甘油且含有0.5重量％聚乙烯吡咯烷酮时的结果。图14是实施例3的结果，是检体稀释液中含有0.64mg/mL鸡蛋黄来源的磷脂酰甘油且含有0.5重量％聚乙烯吡咯烷酮时的结果。图15是比较例I的结果，是检体稀释液中含有0.43mg/mL鸡蛋黄来源的磷脂酰甘油且含有0.8重量％普鲁兰多糖时的结果。图16是比较例2的结果，是检体稀释液中含有0.43mg/mL鸡蛋黄来源的磷脂酰甘油且含有0.5重量％磷脂质聚合物(Iipidure)时的结果。图17是比较例3的结果，是检体稀释液中含有0.43mg/mL鸡蛋黄来源的磷脂酰甘油且含有0.6重量％聚乙二醇时的结果。
具体实施例方式本发明为一种试剂，它是一种被测物为血中的抗体或抗原，在被测物为抗体时通过与抗原的免疫反应、在被测物为抗原时通过与抗体的免疫反应来测定被测物的试剂，其特征在于，向免疫反应的反应系中添加甘油磷脂及聚乙烯吡咯烷酮。本发明还为一种使用所述试剂的被测物测定方法。本发明的试剂中含有用于回避内源性脂蛋白的影响的甘油磷脂和提高含有该甘油磷脂的液体的保存稳定性的聚乙烯吡咯烷酮。作为上述甘油磷脂，可以是磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸等。其中，优选磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸。添加的甘油磷脂的浓度优选为在反应系中含有0.005 0.20重量％。更优选为0.015 0.12重量％，但由于添加量需要根据测定中使用的检体量做适当调节，因而并不局限于此范围。此外，可将甘油磷脂添加到反应体系中，也可添加到检体稀释液中，还可添加到含有抗体、抗原的试剂中，但从回避内源性脂蛋白的影响的效果的角度考虑，优选添加到检体稀释液中。上述磷脂酸不问其来源动物或植物。磷脂酸一般通过用磷脂酶A2分解磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油而得到。对上述磷脂酸中所含的二个酰基的碳数及不饱和度无限制。一般为碳数10 18、含有O 2个不饱和键的酰基。此外，二个酰基各自的碳数及不饱和键的数目不必相同，可以是不同碳数的酰基的组合、饱和与饱和、饱和与不饱和或不饱和与不饱和的酰基的组合。一般地，动物、植物来源的的磷脂酸是具有不同碳数的酰基的磷脂酸及具有不同不饱和键数的酰基的磷脂酸组合而成的混合物。上述磷脂酸可以是化学合成物。实际市售的有1，2 一二肉豆蘧酰一 sn —甘油一3 一磷脂酸钠盐、1，2 一二棕榈酰一 sn —甘油一 3 —磷脂酸钠盐、1，2 一二硬脂酰一 sn —甘油一 3 —磷脂酸钠盐等。上述磷脂酰胆碱不问其来源动物或植物。常用的为由大豆、鸡蛋黄精制而成的磷脂酰胆碱。对上述磷脂酰胆碱中所含的二个酰基的碳数和不饱和度无限制。一般为碳数10 22、含有O 2个不饱和键的酰基。此外，二个酰基各自的碳数及不饱和键的数目不必相同，可以是不同碳数的酰基的组合、饱和与饱和、饱和与不饱和或不饱和与不饱和的酰基的组合。一般地，动物、植物来源的磷脂酰胆碱是具有不同碳数的酰基的磷脂酰胆碱及具有不同不饱和键数的酰基的磷脂酰胆碱组合而成的混合物。上述磷脂酰胆碱可以是化学合成物。实际市售的有1，2 一二癸酰一 sn —甘油一
3一磷酰胆碱、1，2 一二肉豆蘧酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱、1，2 一二棕榈酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱、1，2 一二硬脂酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱、1，2 一二油酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱、1，2 一二亚油酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱、1，2 一二芥酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱、I 一肉豆蘧酰一 2 —棕榈酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱、I 一肉豆蘧酰一 2 —硬脂酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱、I 一肉豆蘧酰一 2 —油酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱、I 一棕榈酰一 2 —油酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱、I 一硬脂酰一 2 —油酰一sn 一甘油一 3 —磷酰胆碱、I 一棕榈酰一 2 —肉豆蘧酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱、I 一棕榈酰一 2 —硬脂酰一 sn —甘油一 3 —磷酰胆碱等。上述磷脂酰甘油不问其来源动物或植物。常用的为由大豆、鸡蛋黄精制而成的磷脂酰甘油。对上述磷脂酰甘油中所含的二个酰基的碳数和不饱和度无限制。一般为碳数10 22、含有O 2个不饱和键的酰基。此外，二个酰基各自的碳数及不饱和键的数目不必相同，可以是不同碳数的酰基的组合、饱和与饱和、饱和与不饱和或不饱和与不饱和的酰基的组合。一般地，动物、植物来源的磷脂酰甘油是具有不同碳数的酰基的磷脂酰甘油及具有不同不饱和键数的酰基的磷脂酰甘油组合而成的混合物。上述磷脂酰甘油可以是化学合成物。实际市售的有1，2 一二肉豆蘧酰一 sn —甘油一 3 —磷酰甘油钠盐、1，2 一二肉豆蘧酰一 sn —甘油一 3 —磷酰甘油铵盐、1，2 一二棕榈酰一 sn —甘油一 3 —磷酰甘油钠盐、1，2 一二棕榈酰一 sn —甘油一 3 —磷酰甘油铵盐、1，2 一二硬脂酰一 sn —甘油一 3 —磷酰甘油钠盐、1，2 一二硬脂酰一 sn —甘油一 3 —磷酰甘油铵盐、1，2 一二油酰一 sn —甘油一 3 —磷酰甘油钠盐、1，2 一二芥酰一 sn —甘油一 3 —磷酰甘油钠盐、I 一棕榈酰一 2 —油酰一 sn —甘油一 3 —磷酰甘油钠盐等。上述磷脂酰乙醇胺不问其来源动物或植物。常用的为由大豆、鸡蛋黄精制而成的磷脂酰乙醇胺。对上述磷脂酰乙醇胺中所含的二个酰基的碳数和不饱和度无限制。一般为碳数10 22、含有O 2个不饱和键的酰基。此外，二个酰基各自的碳数及不饱和键的数目不必相同，可以是不同碳数的酰基的组合、饱和与饱和、饱和与不饱和或不饱和与不饱和的酰基的组合。一般地，动物、植物的磷脂酰乙醇胺是具有不同碳数的酰基的磷脂酰乙醇胺及具有不同不饱和键数的酰基的磷脂酰乙醇胺组合而成的混合物。上述磷脂酰乙醇胺可以是化学合成物。实际市售的有1，2 一二肉豆蘧酰一 sn —甘油一 3 —磷酰乙醇胺、1，2 一二棕榈酰一 sn —甘油一 3 —磷酰乙醇胺、1，2 一二硬脂酰一sn 一甘油一 3 —磷酰乙醇胺、1，2 一二亚油酰一 sn —甘油一 3 —磷酰乙醇胺、1，2 一二芥酰一 sn —甘油一 3 —磷酰乙醇胺等。上述磷脂酰丝氨酸不问其来源动物或植物。常用的为由大豆、鸡蛋黄精制而成的磷脂酰丝氨酸。对上述磷脂酰丝氨酸中所含的二个酰基的碳数和不饱和度无限制。一般为碳数10 22、含有O 2个不饱和键的酰基。此外，二个酰基各自的碳数及不饱和键的数目不必相同，可以是不同碳数的酰基的组合、饱和与饱和、饱和与不饱和或不饱和与不饱和的酰基的组合。一般地，动物、植物来源的的磷脂酰丝氨酸是具有不同碳数的酰基的磷脂酰丝氨酸及具有不同不饱和键数的酰基的磷脂酰丝氨酸组合而成的混合物。上述磷脂酰丝氨酸可以是化学合成物。实际市售的有1，2 一二肉豆蘧酰一 sn —甘油一 3 —磷酰一 L 一丝氨酸钠盐、1，2 一二棕榈酰一 sn —甘油一 3 —磷酰一 L 一丝氨酸钠盐、1，2 一二硬脂酰一 sn —甘油一 3 —磷酰一 L 一丝氨酸钠盐、1，2 一二油酰一 sn —甘油一 3 —磷酰一 L 一丝氨酸钠盐等。上述甘油磷脂优选以溶解或分散在反应系的缓冲液中的状态存在。对于难溶的甘油磷脂，可以用超声波处理进行分散或溶解。此外，也可通过添加表面活性剂使其溶解。
作为上述表面活性剂，一般地，只要是能增溶脂质的表面活性剂即可使用，优选蔗糖单月桂酸酯等蔗糖脂肪酸酯、溶血磷脂酰胆碱、辛基葡糖苷、十二烷基麦芽糖苷等烷基糖苷、硫酸葡聚糖等。本发明中使用的聚乙烯吡咯烷酮可以使用工业合成的分子量I万到36万左右的聚乙烯吡咯烷酮，但以聚乙烯吡咯烷酮的粘度指标K值计在30以上者为宜，K值在60以上
者更佳。这里，K值是就聚乙烯吡咯烷酮而言，作为分子量的尺度而通常使用的数值，具体地，对聚乙烯吡咯烷酮的I重量％水溶液，在25°C下用毛细管粘度计测定相对粘度，代入下述Fikentscher粘度公式〔公式I〕
权利要求
1.剂，其中，被测物为血中的抗体或抗原，在被测物为抗体时通过与抗原的免疫反应、在被测物为抗原时通过与抗体的免疫反应来测定被测物，其特征在于，在免疫反应的反应系中添加甘油磷脂以及聚乙烯吡咯烷酮。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，甘油磷脂为选自磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸中的一种以上。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，被测物为抗磷脂抗体，通过与磷脂抗原的免疫反应来测定所述抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，磷脂抗原负载在不溶性载体上。
5.根据权利要求3或4所述的试剂，其特征在于，被测物抗磷脂抗体为由于梅毒感染而在血中出现的抗梅毒磷脂抗体。
6.根据权利要求3或4所述的试剂，其特征在于，被测物抗磷脂抗体为由于属于自身免疫疾病的抗磷脂抗体综合征而在血中出现的抗磷脂抗体。
7.定方法，其中，被测物为血中的抗体或抗原，在被测物为抗体时通过与抗原的免疫反应、在被测物为抗原时通过与抗体的免疫反应来测定被测物，其特征在于，在免疫反应的反应系中添加甘油磷脂以及聚乙烯吡咯烷酮。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，甘油磷脂为选自磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸中的一种以上。
9.根据权利要求7或8所述的测定方法，其特征在于，被测物为抗磷脂抗体，通过与磷脂抗原的免疫反应来测定所述抗体。
10.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，磷脂抗原负载在不溶性载体上。
11.根据权利要求9或10所述的测定方法，其特征在于，被测物抗磷脂抗体为由于梅毒感染而在血中出现的抗梅毒磷脂抗体。
12.根据权利要求9或10所述的测定方法，其特征在于，被测物抗磷脂抗体为由于属于自身免疫疾病的抗磷脂抗体综合征而在血中出现的抗磷脂抗体。
13.有甘油磷脂的液体的稳定化方法，其特征在于，在含有甘油磷脂的液体中添加聚乙烯吡咯烷酮。
14.包含有甘油磷脂的液体稳定化的试剂，其中，以聚乙烯吡咯烷酮为有效成分。
全文摘要
本发明提供一种使用甘油磷脂、用于准确稳定的免疫测定的试剂及其稳定化方法。其中，被测物为血中的抗体或抗原，在被测物为抗体时通过与抗原的免疫反应、在被测物为抗原时通过与抗体的免疫反应来测定被测物，其特征在于，在免疫反应的反应系中添加甘油磷脂以及聚乙烯吡咯烷酮。
文档编号G01N33/543GK103097893SQ20118001711
公开日2013年5月8日 申请日期2011年3月31日 优先权日2010年3月31日
发明者阿部孝行, 大田哲也 申请人:积水医疗株式会社