使用薄层层析的样品检测方法、薄层层析板及其制造方法

专利名称：使用薄层层析的样品检测方法、薄层层析板及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种薄层层析板(下面也称为“TLC板”)，其具有对紫外线或着色剂的 光学响应不同的两种分离剂层、所述薄层层析板的制造方法及其使用方法。
技术背景
薄层层析法(下面也称为“TLC”)作为从混合物中分离或检测特定成分的方法为 人所知。例如，基于分离剂层与检测目标成分之间光学响应的差异，通过对由样品展开提供 的点曝露于紫外线或用着色剂的显色处理，而通过对TLC的成分分离进行检测。
另一方面，已知含有多糖衍生物例如多糖的苯基酯的的分离剂作为光学异构体的 分离剂。当这种含芳香环的分离剂用于TLC板的分离剂层时，通过曝露于紫外线或用着色 剂进行显色处理可能不能检测出检测目标成分。
此类TLC板已知是将用于光学拆分的填充剂层设置于平板上的支持体的一部分 表面上的TLC板的形式(例如，参照专利文件I)。用该TLC板，在单个支持体的表面上形成 用于光学拆分的填充剂层和基于硅胶的填充剂层，使在用于光学拆分的填充剂层上分离的 成分(点)另外展开到硅胶基填充剂层；通过使硅胶基填充剂层经受曝露于紫外线或者用 着色剂进行显色处理来检测出检测目标成分。
用该TLC板，容易被用于光学拆分的填充剂层吸附的萃取成分，与对用于光学拆 分的填充剂层的吸附有抵抗形的余液成分相比，不能令人满意地从用于光学拆分的填充剂 层向硅胶基填充剂层移动，因而不可能在硅胶基填充剂层中令人满意地进行检测，因而也 不可能确认通过用于光学拆分的填充剂层进行的分离的状态。因此，此TLC板当应用于使 用例如柱层析的其他类型的层析法进行的光学拆分的条件研究时不能提供必要的信息，因 此对于这一点尚有研究的余地。
专利文件1:日本专利公开第3140138号
发明内容
本发明提供一种能利用光学响应对样品中的成分的分离进行检测的TLC板及 TLC，所述样品已通过不能检测样品中成分的分离的分离剂层进行展开。
本发明人对于对紫外线或着色剂具有光学响应的分离剂组成TLC的使用进行了 努力研究，并发现了一种方法，其中，使在具有特定的此类光学响应的第一分离剂层中展开 的点在不同于此展开方向的方向上展开，并使点进一步展开到与第一分离剂层相邻接的且 不具有前述光学响应的第二分离剂层，由此发现在第二分离剂层中维持第一分离剂层中的 展开方向上的点的位置关系。基于此而完成了本发明。
因此，本发明提供一种利用具有第一分离剂层以及与第一分离剂层相邻接的第二 分离剂层的TLC板并检测样品中对紫外线或着色剂具有光学响应的成分的方法；该方法包括在第一分离剂层中使样品沿第一和第二分离剂层的边界的方向展开的步骤；使至少使 第二分离剂层中的流动相干燥的步骤；改变前述TLC板的方向和使第一分离剂层中的点展 开入第二分离剂层的步骤；通过曝露于紫外线或用着色剂进行显色处理来对移动入第二分 离剂层的点进行检测的步骤；其中，第一分离剂层是由具有光学响应的第一分离剂所形成， 第二分离剂层是由具有不同于第一分离剂的光学响应的第二分离剂所形成；成分的光学响 应与第一分离剂的光学响应性相同。
本发明还提供一种具有展开方向为第一方向的第一分离剂层以及在与第一方向 垂直的第二方向上的并与第一分离剂层相邻接的第二分离剂层的TLC板；其中，第一分离剂层是由对紫外线或着色剂具有光学响应的第一分离剂所形成；第二分离剂层是由具有不同于第一分离剂的前述光学响应的第二分离剂所形成；并且 当在第一分离剂层中使点在第一方向上展开时，在第一分离剂层中在第二方向上的点 的移动距离W2与在第一分离剂层中在第一方向上的点的移动距离Wl之比为不超过±0.5。
此外，本发明提供在各情况下第一分离剂为用于光学异构体的分离剂的前述方法 及前述TLC板。
此外，本发明还提供前述方法及前述TLC板，其中，在各情况下，用于光学异构体 的分离剂包含多糖衍生物，所述多糖衍生物包含多糖以及取代多糖的羟基或氨基的一部分 或全部的芳香族酯基、芳香族氨甲酰基、芳香族醚基、或羰基。
此外，本发明提供一种制造具有第一分离剂层及与该第一分离剂层相邻接的第二 分离剂层的TLC板的方法；该方法包括通过将含有对紫外线或着色剂具有光学响应的第 一分离剂及涂布溶剂的第一浆料涂布于支持体上来形成第一分离剂层的步骤；将含有具有 不同于第一分离剂的前述光学响应的第二分离剂及涂布溶剂的第二浆料涂布于支持体上 来形成与第一分离剂层相邻接的第二分离剂层的步骤；其中，在第一和第二浆料中使用相 同种类的涂布溶剂。
由于在维持第一方向上的点的位置关系的情况下使已在第一分离剂层中向第一 方向展开的点移动入第二分离剂层，因此，本发明可以利用光学性响应通过对不能检测样 品中成分的分离的分离剂层来对样品中的成分的分离进行检测。
此外，对于TLC板的第一分离剂层，将相对于展开方向所允许的点的移动宽度限 定在规定范围内，因此，本发明可以在第二分离剂层中准确地控制第一分离剂层中的成分 在展开方向的分离状态。
此外，由于本发明提供使用于第一和第二浆料的涂布溶剂的类型的一致，所以，本 发明提供从第一分离剂层向第二分离剂层的点移动性为良好的TLC板。


图1是显示当将样品溶液的点施加于本发明的TLC板的一个实例时的状态的图。
图2是显示当使样品在图1的TLC板的第一分离剂层I中展开时的状态的图。
图3是显示当在图1的TLC板上使在第一分离剂层I中展开的点向第二分离剂层 2展开时的状态的图。
图4是显示当在图1的TLC板的第一分离剂层I中的点向第二分离剂层2展开时 的状态的图示。
图5是显示当具有移动入第二分离剂层2的点的TLC板曝露于紫外线时图1的 TLC板的状态的图。
实施发明的最佳模式本发明的样品检测方法利用具有第一分离剂层以及与第一分离剂层相邻接的第二分 离剂层的TLC板并检测样品中对紫外线或着色剂具有光学响应的成分。本发明的检测方 法包括在第一分离剂层中使样品沿第一分离剂层与第二分离剂层的边界的方向展开的步 骤；使至少第二分离剂层中的流动相干燥的步骤；改变前述TLC板的方向并使第一分离剂 层中的点展开入第二分离剂层的步骤；通过曝露于紫外线或用着色剂进行显色处理对移动 入第二分离剂层的点进行检测的步骤。
在第一分离剂层中使样品沿第一分离剂层与第二分离剂层的边界的方向展开的 步骤(第一步骤)，除了仅在第一分离剂层内沿第二分离剂层展开样品以外，其余可以以与 普通的TLC同样的方式进行。即，可通过以下步骤实施第一步骤可以将样品点施加于第一 分离剂层上；必要时使样品的点干燥；使用沿第一分离剂层与第二分离剂层的边界的方向 (也称为“第一方向”)为纵向方向，将点样品的分离剂层的边缘放置在下方并将第一和第 二分离剂层的边缘浸入流动相中；并使样品在第一分离剂层中展开。
使至少第二分离剂层中的流动相干燥的步骤(第二步骤)，可以以与普通TLC中的 流动相干燥同样的方式进行。一旦在第二步骤中使第二分离剂层干燥后，则能够进行向第 二分离剂层的点的移动；但从防止在第一分离剂层中的点扩大或维持其位置关系的观点来 看，优选地是同时在第二分离剂层和第一分离剂层上进行流动相的干燥。在流动相含有可 燃性有机溶剂时，从防止燃烧或毒性的观点来看，优选的是在局部排气装置的附近通过风 干来进行第二步骤。也可在减压下实施第二步骤。
改变前述TLC板的方向并使第一分离剂层中的点展开入第二分离剂层的步骤(第 三步骤)，除了使第一分离剂层中的点向第二分离剂层展开以外，其余可以以与普通TLC同 样的方式进行。即，通过以下步骤来实施第三步骤，可以改变TLC板的方向以使流动相在与 第一分离剂与第二分离剂层的边界正交的方向(也称为“第二方向”)上展开；将该板的边 缘浸入流动相；用流动相实施展开以使第一分离剂层中的前述点越过前述边界而移动入第 二分离剂层中。
第二方向可以是从相对于第一方向大于0°且小于等于90°的范围中，从准确地 维持第一流动相中的点的位置关系的观点来看，优选为45至90°、更优选为60至90°、更 优选为90°。
第一步骤中的流动相与第三步骤中的流动相可以相同或不同。例如，，若在第三步 骤中使用的流动相极性高于第一步骤中的流动相，则可以更快速地实施点从第一分离剂层 向第二分离剂层的移动。
流动相(洗脱剂液)可以使用水、盐的水溶液、有机溶剂、及以上各项的混合的溶 剂。可以使用一种有机溶剂也可使用两种或两种以上有机溶剂。盐的水溶液，可列举硫酸铜 水溶液和过氯酸盐水溶液。有机溶剂，可列举例如例如甲醇、乙醇和异丙醇等的醇类；例 如丙酮、和乙基甲基酮等的酮类；例如四氢呋喃、二氧六环等的醚类；例如乙腈等的腈类； 例如二甲基亚砜等的亚砜类；例如环丁砜等的砜类；例如乙酸乙酯等的酯类；例如二甲基甲酰胺等的酰胺类；例如戊烷、己烷、石油醚等的烃类；例如苯、甲苯、二甲苯等的芳香族烃类；以及例如二氯甲烷、氯仿、溴仿、氯苯、溴苯等的含卤素化合物类。从使待检测的成分稳定的观点来看，可向流动相中加入适量的酸或碱。酸，可列举乙酸、丙酸和四氟乙酸；碱，可列举二乙胺、单乙醇胺和三乙胺。
通过曝露于紫外线或用着色剂进行显色处理来对移动入第二分离剂层的点进行检测的步骤(第四步骤)，除了将第二分离剂层中的点作为检测目标以外，其余以通过曝露于紫外线或用着色剂进行显色处理来检测TLC中的点的普通方法同样的方式进行。
第一分离剂层是由对紫外线或着色剂具有光学响应的第一分离剂所形成。这里， 对紫外线的光学响应是指由紫外线诱导的发光(例如荧光)、或者对紫外线的吸收。对着色剂的光学响应，是指由着色剂所诱导的显色。
第一分离剂层，除了由第一分离剂形成第一分离剂层以外，其余可以以与普通TLC 板的薄层相同的方式形成。
第一分离剂包含具有前述光学响应的分离剂成分。这种第一分离剂，可列举包含载体、由载体支承或结合于载体上的前述分离剂成分的载体支承型分离剂、或由前述分离剂成分所组成的粒子。本发明中第一分离剂优选的是用于光学异构体分离剂，关于此分离剂，由于分离剂的性能和性质而使通过TLC进行的样品的简单检测通常被视为很成问 题。
从提高分离性能的观点来考虑，前述载体优选地为多孔材料。前述载体可列举例如交联聚苯乙烯、交联丙烯酸类聚合物、环氧聚合物的合成高分子；纤维素或通过交联而强化纤维素的交联纤维素；多糖，例如交联琼脂糖、交联葡聚糖和交联甘露聚糖的交联材料; 以及例如氧化铝、硅胶、介孔硅胶，沸石、硅藻土、熔融二氧化硅、粘土矿物、氧化锆和金属的无机物质。
第一分离剂中的分离剂成分可以使用具有前述光学响应的低分子量分离剂或具有前述光学响应的高分子量分离剂中。所述低分子量分离剂，可列举配体交换型分离剂、 电荷转移型(η-η)分离剂、氢键合型分离剂、包合型(inclusion-type)分离剂、离子键合型分离剂、插层型分离剂、冠醚及其衍生物、以及环糊精及它们的衍生物。高分子量分离剂可列举多糖衍生物、聚酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、蛋白质和酒石酸衍生物。所述多糖衍生物可列举用于用于光学异构体的分离剂的并且包含多糖以及用于取代多糖的羟基或氨基中的一部分或全部的芳香族酯基、芳香族氨甲酰基、芳香族醚基和羰基的多糖衍生物。此处的实例是纤维素的氨基甲酸苯酯衍生物、纤维素的苯基酯衍生物、直链淀粉的氨基甲酸苯酯衍生物和直链淀粉的苯基酯衍生物。这些衍生物中的苯基可具有选自C1J烃及卤素的一个或一个以上的取代基。
第二分离剂层是由具有不同于第一分离剂不同的光学响应的第二分离剂所形成。 这种不同的光学响应表示由曝露于紫外线或者用着色剂显色处理诱导的一种光学响应区别于由曝露于紫外线或者用着色剂显色处理诱导的另一种光学响应的程度为基于颜色或亮度能进行光学区别。第二分离剂可具有分离样品中成分的能力，也可不具有该能力。从准确地检测第一分离剂层中的点的位置关系的观点来看，优选的是第二分离剂不具有分离样品中的成分的性能。这种第二分离剂可列举以上已描述的载体和分离剂，但优选载体。
可以根据本发明的检测方法的目的来决定第一和第二分离剂的粒径。例如，当目的是研究用于中等压力柱层析法的条件时，则从获得能够应用于中等压力层析法的结果的观点来看，粒径优选为至少10 μ m、更优选为10至100 μ m、更优选为20至100 μ m。个体分离剂的粒径可以相互相同或可以相互不同。各分离剂的粒径可以是目录值或采用由普通粒径分析仪所测定的平均粒径。
当利用曝露于紫外线引起的光学响应性来实施第四步骤中的成分检测时，从达到更准确的检测的观点来看，优选的是第二分离剂还含有荧光指示剂。这种荧光指示剂可以使用已知的荧光指示剂，例如钨酸镁、或含锰的硅酸锌。可以根据成分分离可能的范围来决定荧光指示剂的含量，一般而言每100质量份的第二分离剂，荧光指示剂的含量为O.1至5 质量份。
当利用着色剂引起的光学响应来实施第四步骤中的成分检测时，在着色剂及其显色处理方面可以采用已知的技术。这种着色剂可列举茴香醛溶液、磷钥酸溶液、碘、茚三酮溶液、高锰酸钾水溶液、DNPH溶液、氯化锰溶液、和溴甲酚绿溶液。显色处理可列举通过涂布、散布着色剂于TLC板上或使TLC板暴露于着色剂来施加着色剂于TLC板并且必要时加热TLC板而引起显色的处理。
样品成分的光学响应与本发明中的第一分离剂的光学响应相同。这里，所谓光学响应相同表不不能基于颜色和亮度从光学角度区别一种的光学响应与另一种的光学响应性。根据本发明的检测方法能够对样品中成分的通过第一分离剂进行的在TLC中的分离进行简便地检测，该样品至少利用第一分离剂来分离但在第一分离剂上不能以光学方式进行检测、的。
用于本发明的检测方法的TLC板，优选地使用下文所述的本发明的TLC板。
本发明的TLC板具有平板状的支持体、形成于该支持体表面上的第一分离剂层及与第一分离剂层相邻接的第二分离剂层。
支持体可以使用通常用于TLC板的平板。这种支持体可列举由玻璃、树脂、金属、 或纸制成的平板。对支持体的形状并无特别限制，但从在优选的方向上紧凑地进行在第一分离剂层中的样品展开及其后从第一分离剂层向第二分离剂层的点展开的观点来看，支持体的形状优选矩形或正方形。此外，对于平板的尺寸并无特别限制，但从操作简单性、展开时间和经济的方面来看，优选为I至6，000 cm2、更优选为2至410 cm2、更优选为5至75 cm2。，在允许用于本发明的检测方法的范围内，对平板的厚度并无特别限制。
前述第一和第二分离剂可以使用光学响应不同的并且选自上述粒径至少为10 μm的粒子分离剂的二种或两种以上分离剂。第一分离剂层可以通过将含有第一分离剂和涂布溶剂的第一浆料涂布于支持体上、必要时使由此所形成的涂层干燥来形成。第二分离剂层可以通过将含有第二分离剂和涂布溶剂的第二浆料涂布于支持体上、必要时使由此形成的涂层干燥来形成。
可以利用已知的制造TLC板的方法来形成第一和第二分离剂层。因此，第一和第二分离剂层可以通过使用涂布器将第一和第二浆料涂布于支持体的表面上、或者将第一和第二浆料喷雾至支持体的表面上来形成。对于形成第一和第二分离剂层的顺序并无特别限制，可在形成一层之后形成另一层或者同时形成这两种分离剂层。
前述涂布用溶剂可以使用水、有机溶剂及前两项的混合溶剂。有机溶剂可列举例如甲醇、乙醇和异丙醇的醇类；例如丙酮和乙基甲基酮的酮类；例如四氢呋喃、二氧六环的醚类；例如乙腈的腈类；例如二甲基亚砜的亚砜类；例如环丁砜的砜类；例如乙酸乙酯的酯类；例如二甲基甲酰胺的酰胺类；例如戊烷、己烷和石油醚的烃类；例如苯、甲苯和二甲苯 的芳香烃类；例如二氯甲烷、氯仿、溴仿、氯苯和溴苯的含卤素化合物。
涂布用溶剂优选水溶性有机溶剂与水的混合溶剂、更优选醇与水的混合溶剂、更 优选乙醇与水的混合溶剂。前述混合溶剂中的醇的含量，优选为O.1至50质量％、更优选为 10至40质量％、更优选为20至30质量％。从防止第一和第二分离层的边界混乱且实现从 第一分离剂层向第二分离剂层点的良好的移动的观点来看，优选的是第一和第二浆料使用 相同种类的涂布溶剂、更优选的是使用相同的涂布溶剂组成。
可以基于有待形成的分离剂层的均匀性、层厚度、和经济的考虑来决定第一和第 二浆料中的涂布溶剂的含量，表示为每100质量份的第一或第二分离剂，优选为10至5000 质量份、更优选为50至1000质量份、更优选为100至300质量份，同时对于第一和第二浆 料而言。
为了提高有待形成的分离剂层的强度，优选的是第一和第二浆料还含有粘合剂。 前述粘合剂可以使用获得在支持体表面上形成分离剂层的显示粘合性能的成分。这种粘合 剂可列举例如石膏或胶体二氧化硅的无机粘合剂；例如微纤化纤维素的有机纤维；例如 碱性水溶性共聚物、羟乙基纤维素、和羧甲基纤维素的增稠剂；例如聚乙烯醇和丙烯酸的有 机粘合剂。粘合剂可使用单种或两种或更多种。
可以从有待形成的分离剂层的强度的考虑、以及流动相在第一或第二分离剂层中 的展开的速度的考虑来决定第一和第二浆料中的粘合剂含量。为了提高有待形成的分离 剂层的强度，优选的是粘合剂的量较多，但一般而言流动相在分离剂层中的展开速度的变 慢与粘合剂添加量的增加成正比。当在前述第一步骤中，流动相在第二分离剂层中的展开 速度相对于流动相在第一分离剂层中的展开速度明显更慢时，发生样品的点在展开时相对 于第一方向转向第二分离剂层的现象，因而不能对第一分离剂层的样品分离进行准确的分 析。相反，当在流动相在第二分离剂层中的展开速度相对于流动相在第一分离剂层中的展 开速度明显较大时，发生样品点展开时相对于第一方向远离第二分离剂层的现象，因此不 能对第一分离剂层的样品分离分析进行准确的分析。从准确地控制由第一分离剂层进行的 分离的状态的观点来看，在使样品在第一分离剂层中展开时，优选的是最大可能地使样品 的点向第一方向(例如垂直地)展开。
另一方面，当在前述第三步骤中，在当点横穿第一分离剂层与第二分离剂层的边 界时，流动相在第二分离剂层中的展开速度明显大于流动相在第一分离剂层中的展开速度 时，发生点的拖尾，第二分离剂层中的成分检测变得成问题。从抑制这种现象且在第二分离 剂层中仍保持在第一分离剂层中的展开方向上的点的位置关系和形状的观点来看，优选的 是使流动相在第一分离剂层中的展开速度与流动相在第二分离剂层中的展开速度相同，或 者使流动相在第二分离剂层中的展开速度在一定程度上小于流动相在第一分离剂层中的 展开速度。
考虑到前述观点，在使点在第一分离剂层中向第一方向展开时，在本发明的TLC 板中，第一分离剂层中在第二方向上的点移动距离W2与第一分离剂层中在第一方向上的 点移动距离Wl之比(W2/W1)为不大于O. 5。Wl表不在第一分离剂层中从样品点施加位置 到点前沿的距离。W2表示沿第二方向从点施加位置到点的前沿的距离。从准确地控制第一 分离剂层中的分离状态的观点来看，W2/W1优选为不超过±0. 3，从抑制拖尾的观点来看，更优选为正值；更优选为不超过O.1。另外，就W2而言，将样品点施加位置设为0，将从点施 加位置的第二分离剂层的一侧表示为正值，将点施加位置的与第二分离剂层的相反侧表示 为负值。
前述粘合剂中，从增加层的强度和控制流动相的展开速度的观点来看，优选的是 在第一和第二浆料两者中同时组合地使用无机粘合剂与有机粘合剂。无机粘合剂优选使用 石膏；有机类粘合剂优选使用羧甲基纤维素。
可考虑待形成的层的强度和产生适当范围的前述W2/W1来决定第一和第二浆料 中的粘合剂含量。例如，第一衆料中的石膏含量，表不为每100质量份的第一分离剂,优选 为O.1至50质量份、更优选为5至30质量份、甚至更优选为10至20质量份。第一浆料中 的有机粘合剂的含量，表示为每100质量份的第一分离剂，优选为O.1至50质量份、更优选 为O. 5至10质量份、甚至更优选为I至3质量份。
作为实例，第二浆料中的石膏含量，表示为每100质量份的第二分离剂，优选为 O.1至50质量份、更优选为I至30质量份、甚至更优选为2至8质量份。第二浆料中的有 机粘合剂的含量，表示为每100质量份的第二分离剂，优选为O.1至50质量份、更优选为 O. 5至10质量份、甚至更优选为2至4质量份。
第一和第二分离剂层的强度应该足以经受与TLC相关的保存和使用，例如在保存 和使用时足以防止分离剂层的剥离或崩解的强度。例如，可以通过将有色样品进行点样并 展开来确定在第一分离剂层中的W2/W1。而且，因为当分离剂层变得较厚时流动相的展开速 度变慢、当分离剂层变得较薄时流动相的展开速度加快，所以，可以利用第一和第二分离剂 层的厚度以及通过粘合剂的种类和粘合剂的加入量来调整W2/W1。
从使粘合剂均匀地分散于分散剂表面上的观点来看，第一和第二浆料中还可含有 分散剂。这种分散剂可列举苯乙烯/顺丁烯二酸酐聚合物。
可以根据TLC板的目标用途适当地设定第一和第二分离剂层的厚度。例如，若从 将所得结果应用于中等压力柱层析法、或者将所得结果应用于不对称合成反应中的反应监 测或化合物分离的观点来看，分离剂层的厚度优选为O. 01至100 mm、更优选为O. 03至10 mm、甚至更优选为O. 05至2 mm。
对于TLC板的尺寸并无特别限制，可以根据分离剂、样品、及流动相来适当地决定 TLC板的尺寸。基于成分分离的考虑，TLC板的尺寸以大为好，基于操作的容易性或检测的 简便性的考虑，TLC板的尺寸不希望太大。可以基于这些考虑来适当地决定第一和第二分 离剂层的尺寸。
例如,第一分离剂层在第一方向上的长度(B)应足够长以引起样品在第一方向上 的展开，可以考虑第一分离剂、样品、及流动相而适当地决定该长度。考虑到提供可靠的可 操作性和检测的观点，第一分离剂层在第一方向上的长度B优选为I至30 cm、更优选为3 至20 cm、更优选为5至12 cm。
考虑到提供可靠的可操作性或检测的观点，第一分离剂层在第二方向上的长度 (Al)优选为O. 01至200 cm、更优选为O. 01至20 cm、更优选为O. 02至5 cm。
考虑到提供可靠的可操作性或检测的观点，第二分离剂层在第二方向上的长度 (A2)优选为O.1至30 cm、更优选为O. 5至20 cm、甚至更优选为I至5 cm。
A2与Al (A2/A1)之比，基于通过用流动相展开使点从第一分离剂层向第二分离剂层移动的的考虑，希望较大，但基于操作容易性或检测的简便性的考虑，希望较小。基于这些考虑，A2/A1的比率优选为O.1至20、更优选为O.1至10、更优选为O.1至5。
此外，B与Al之比(B/A1)，基于样品中的成分在第一分离剂层中分离的考虑，以较大为好，基于可操作性的考虑，希望为某种程度的较小值。基于这些考虑，B/A1优选为O. 01 至9，000、更优选为O. 2至4，000、更优选为I至600。
此外，B与Al和A2的和之比(B/ (Al + A2))，基于样品中的成分在第一分离剂层中分离的考虑，希望较大，基于点从第一分离剂层向第二分离剂层的移动、特别是从萃取成分的点的移动的和可操作性的考虑，希望较小值。基于这些考虑，B/(A1+A2)优选为O. 01至 30、更优选为O.1至30、更优选为O. 8至12。
对第一分离剂层或第二分离剂层的形状无特别限制，只要这些层相互邻接且满足前述长度条件。第一和第二分离剂层优选各自具有矩形形状，这是从可操作性、第一分离剂层中的点的位置关系的清晰、明确的显示、及个体层的形成容易性的观点来看。更优选地， 第一分离剂具有矩形形状，其中，长度方向为第一方向，第二分离剂层具有矩形形状，该矩形在第一方向上具有与第一分离剂层的长度相同的长度并且具有满足前述A2/A1之比的尺寸。
下面将参照附图进一步说明本发明。在下文中，以光学异构体的分离、检测的构造 (configuration)为例来说明本发明。
如图1中所示，本发明的TLC板具有相邻地设置在四边形支持体(未图示)的表面上的第一分离剂层I和第二分离剂层2。例如，使用玻璃板为支持体；构成第一分离剂层I的第一分离剂使用对样品中成分具有分离能力的分离剂，例如使直链淀粉的氨基甲酸3，5-二甲基苯酯衍生物支持或化学结合于硅胶上而成的用于光学异构体的分离剂；构成第二分离剂层2的第二分离剂使用具有不同于第一分离剂的光学响应的分离剂，例如硅胶、纤维素、或者用十八烷基修饰硅胶表面提供的十八烷基硅烷基化硅胶。
通过将包含第一分离剂、乙醇水溶液、石膏和羧甲基纤维素的第一浆料涂布于支持体表面上，而形成第一分离剂层I。通过将包含第二分离剂、乙醇水溶液、石膏和羧甲基纤维素、荧光指示剂的第二浆料涂布于支持体表面上邻接第一分离剂层I的位置，而形成第二分离剂层2。调整第一和第二浆料中的粘合剂的掺合比(掺合的石膏和羧甲基纤维素的量)以便提供(当在已将苏丹红和/或1，4-氨基偶氮苯用作标准样品进行展开时)在第一分离剂层I中不超过±0. 5的比率(W2/W1)，该比率为，在第二方向上从点施加位置到提余液成分的点前沿的距离W2与在第一方向上从点施加位置到提余液成分的点的前沿的距离 Wl之比。标准样品，除了苏丹红和1，4-氨基偶氮苯以外，还可以适当地从已知物质中选择具有与成为TCL板分析目标的样品类似的结构特征或同样的结构特征(例如骨架相同或类似的结构)的有色化合物。
第一分离剂和第二分离剂的粒径各自为20 μ m，第一和第二分离剂层的厚度各自为150 ym。该TLC板的第一方向是沿第一分离剂层I与第二分离剂层2的边界的方向(图1中由箭头X所指的方向)，第二方向是垂直于X方向的方向(图1中由箭头Y所指方向)。
将第一分离剂层I形成为将X方向设定为长度方向的矩形。将第二分离剂层2形成为与第一分离剂层I共有一长边的矩形。第一分离剂层I和第二分离剂层2在X方向上的长度B为10 cm ;第一分离剂层I在Y方向上的长度Al为2 cm ;第二分离剂层2在Y方向上的长度A2为2. 5 cm。
首先，将X方向设定为前述TLC板的纵方向，将样品溶液点施加于第一分离剂层I 的下部。样品溶液例如是具有吸收紫外线能力的的光学异构体的外消旋体在挥发性溶剂中 的溶液。例如，在距离TLC板下侧缘1. 5 cm及距离TLC板上不与第二分离剂层2相邻接的 第一分离剂层I的侧缘1. 5 cm的位置，点的直径不超过2 _，使用毛细管或微量吸管施加 样品溶液的点。施加后，使样品溶液的点3干燥。
将用样品溶液进行点样后的TLC板放置在可以容纳TLC板的并且可以以小于 I cm的深度容纳流动相(洗脱液)的容器(洗脱液槽)中。例如，流动相可使用正己烷/ 乙醇混合的溶剂、或者正己烷/乙酸乙酯混合的溶剂。流动相在第一分离剂层I和第二分 离剂层2中向X方向被上吸，随着流动相的展开，样品溶液中的提余液成分和萃取成分在第 一分离剂层I中展开。如图2中所示，尽管不能以目视检查确认，但形成了提余液成分的点 R和萃取成分的点E。
如图2中所示，当流动相在X方向上已到达TLC板的上端部时，将TLC板从前述密 闭容器中取出，利用冷空气流使第一分离剂层I和第二分离剂层2的流动相干燥。如图2 中所示，Wl为第一分离剂层I中在第一方向X上点的移动距离，用第一方向上点的前沿与样 品溶液点的施加位置之间的距离来表示Wl。如图2中所示，W2为第一分离剂层I中在第二 方向Y上点的移动距离，用第二方向上前述点的前沿与点施加位置之间的距离来表示W2。
然后，如图3中所示，使第一分离层I在下方且将Y方向设定为TLC板的纵方向， 将TLC板放置于前述密闭容器内。此时，流动相可以与前面样品展开中所使用的流动相相 同，也可以不同。流动相向Y方向从第一分离剂层I向第二分离剂层2被上吸，伴随该流动 相的展开，如图4中所示，第一分离剂层I的提余液成分和萃取成分移动入第二分离剂层2。 虽然不能以目视检查确认，但在第二分离剂层2中形成提余液成分的点R和萃取成分的点 E0
如图4中所示，当流动相在Y方向上已到达TLC板的上端部时，将TLC板从前述密 闭容器中取出，利用冷空气流使第一分离剂层I和第二分离剂层2的流动相干燥，从而使第 二分离剂层2中的点R和点E固定。使该TLC板曝露于紫外线或者向其施加着色剂、按需 要进行加热，由此，如图5中所示，基于相同的光学响应来鉴定点R、点E、及第一分离剂层 I (例如，由于紫外线吸收所形成的暗区、或由于用着色剂显色所形成的有色区域)。
在第二分离剂层中维持或反映第一分离剂层中样品中成分的分离状态的情况下， 通过在前述第三步骤中在不改变TLC板的方向的情况下使第一分离剂层的点展开入第二 分离剂层(即，在第三步骤中，采用相对于前述第一方向大于或等于0°至小于或等于90° 的范围内的第二方向，使第一分离剂层的点展开入第二分离剂层)，也能够通过光学响应性 对不能检测样品中成分分离的由第一分离剂层进行的样品中成分的分离进行检测。在这种 情况下可以省略前述第二步骤，本发明也包含这种情况。
实施例
实施例1:TLC板的制作 (第一分离剂层的制作)将6 g填充剂CHIRALPAK IA (Daicel化学工业有限公司制造，相同公司的注册商标) (也称为“填充剂ΙΑ”)、0. 89 g石膏、和6 g CMC (羧甲基纤维素)1110 (Daicel化学工业有限公司)的2%水溶液添加入3. 03 g水与3. 01 g乙醇的混合溶液中，一边充分搅拌一边接受超声波中，而获得浆料。
(第二分离剂层的制作)将10. 01 g硅胶(来自Daiso有限公司的液相层析用IR-60-5/20-U)、0· 50 g石膏、 14.99 g CMC(羧甲基纤维素)1110 (Daicel化学工业有限公司)的2%水溶液、和O.1 g含锰的硅酸锌添加入4. 79 g水与6. 51 g乙醇的混合溶液中，一边接受超声波一边充分搅拌， 而获得浆料。
(涂布)使用安装有隔板的TLC板制作用涂布器，将这些浆料均匀地涂布于玻璃平板的表面上，形成分离剂层，其中，图1中的Al为2 cm、A2为2. 5 cm、B为10 cm、各层的厚度为150 μ m。填充剂IA的平均粒径为20 μ m。硅胶的平均粒径为14. 4 μ m。
(干燥)在空气流中使已涂布浆料的TLC板干燥，然后用真空泵在抽吸下在60°C进行3小时真空干燥，获得TLC板，其中，将填充剂IA层是第一分离剂层且硅胶层是第二分离剂层。
实施例2 :反式均二苯乙烯氧化物(stilbenzene oxide)的光学拆分的例子当将实施例1中所制作的TLC板的长度方向设定为纵方向时，将约I μ L的反式氧化二苯乙烯(t-SO)的1%乙酸乙酯溶液点样于离底部约1.5 cm的位置。以样品的点朝下的方式将TLC板放置于容纳含有正己烷和乙醇(体积比9:1)的混合溶剂的洗脱液槽内，使样品在IA分离剂层的长度方向上展开。
在此第一次展开后，用冷空气流暂时干燥TLC板后，使TLC板旋转90°以使IA分离剂层在底部。将TLC板放置于前述洗脱剂槽内，利用乙醇使样品从IA分离剂层进一步向娃月父层展开。
在此第二次展开后，用冷空气流干燥TLC板并使TLC板曝露于紫外线，从而在硅胶层中确认提余液成分和萃取成分的点的位置。基于第一分离剂层中从点施加位置到洗脱液到达的位置之间的距离、第二分离剂层中在第一展开方向上从样品点施加位置到特定的点的中心之间的距离，计算出各点的Rf值。此时，t-SO的提余液成分的Rf值为O. 67，萃取成分的Rf值为O. 58。
实施例3 :黄烷酮的光学拆分的例子将约I μ L黄烷酮(FLV)的1%乙酸乙酯溶液点样于实施例1中制作的TLC板上，使用与实施例2相同的方法进行展开。
第二次展开后，用冷空气流干燥TLC板，并使板曝露于紫外线，从而在硅胶层中确认提余液成分和萃取成分的点的位置。如实施例2 —样计算Rf值，得到FLV的提余液成分的Rf值为O. 40，萃取成分的Rf值为O. 29。
实施例4 :安息香乙醚的光学拆分的例子将约I μ L安息香乙醚的1%乙酸乙酯溶液点样于实施例1中制作的TLC板上，将含有正己烷和乙酸乙酯(体积比9:1)的混合溶剂用作第一次展开中的洗脱液，将乙酸乙酯用作第二次展开中的洗脱液，除此以外使用与实施例2中相同的方法进行展开。
第二次展开后，用冷空气流干燥TLC板，并使TLC板曝露于紫外线，从而在硅胶层中确认提余液成分和萃取成分的点位置。如实施例2 —样计算Rf值，得到安息香乙醚的提余液成分的Rf值为O. 57，萃取成分的Rf值为O. 30。
实施例5 :环己烯巴比妥的光学拆分的例子将约I μ L环己烯巴比妥的1%乙酸乙酯溶液点样于如实施例1中制作的TLC板上，将含有正己烷和异丙醇(9:1的体积比)的混合溶剂用作第一次展开中的洗脱剂，将异丙醇用作第二次展开中的洗脱剂，除此以外以与实施例2的方法相同的方法进行展开。
在第二次展开后，用冷空气流干燥TLC板并使板曝露于紫外线，从而在硅胶层中确认提余液成分和萃取成分的点的位置。如实施例中的方式计算Rf值，得到环己烯巴比妥的提余液成分的Rf值为O. 33，萃取成分的Rf值为O. 21。
实施例6 :朝格尔碱(Tr5ger’ s base)的光学拆分的例子将约I μ L朝格尔碱(Tr0ger’ s base) (TB)的1%乙酸乙酯溶液点样于如实施例1中一样制作的TLC板上，使用与实施例2相同的方法进行展开。
第二次展开后，用冷空气流干燥TLC板并使板曝露于紫外线，从而在硅胶层中确认提余液成分和萃取成分的点的位置。如实施例2中一样计算Rf值，得到TB的提余液成分的Rf值为O. 56 ，萃取成分的Rf值为O. 41。
实验实施例对粘合剂的添加量的研究以每100质量份填充剂CHIRALPAK AD (来自Daicel化学工业有限公司，相同公司的注册商标)(也称为“填充剂AD”)和前述硅胶，基于下述表I中所记载的质量份数来使用石膏和CMC 1110。使用不同的粘合剂添加量来制作TLC板I至6。使用由此制作的TLC板I 至6，将约I μ L各样品(即苏丹红I和对氨基偶氮苯)的1%乙酸乙酯溶液点样于当将TLC 板长度方向设定为纵方向时离底部约1. 5 cm的位置。以样品点朝下的方式将TCL板放置于容纳乙腈的洗脱剂槽内，使样品在TLC板的长度方向上展开；测定TLC板长度方向上从点施加位置到点前沿的距离Wl、以及在与前述长度方向垂直的方向上从点施加位置到前述点前沿的距离W2 ;并确定W2与Wl之比(W2/W1)。就W2而言，将点施加位置设定为零；将朝第二分离剂层的一侧设为正值；将第一分离剂层的相反的TLC板的端侧设为负值。基于这一事实苏丹红和对氨基偶氮苯具有其特征性固有的颜色，所以，可通过视觉检查来进行第一分离剂层中的点检测。将结果示于表I。表I中的结果证明，通过改变石膏和CMC1110的添加量，可以控制W2/W1。
表I
权利要求
1.一种样品检测方法，其使用具有第一分离剂层以及与第一分离剂层相邻接的第二分离剂层的薄层层析板，并检测对紫外线或着色剂具有光学响应性的样品中的成分； 所述方法包括 在第一分离剂层中使样品朝向沿第一分离剂层与第二分离剂层的边界的方向展开的步骤； 在至少第二分离剂层中使流动相干燥的步骤； 改变所述薄层层析板的方向并使第一分离剂层中的点展开入第二分离剂层的步骤；和 利用曝露于紫外线或用着色剂进行显色处理来检测移动入第二分离剂层的点的步骤； 其中 第一分离剂层由具有所述光学响应的第一分离剂所形成， 第二分离剂层是由具有不同于所述第一分离剂层的所述光学响应的光学响应的第二分离剂所形成，和 所述成分的光学响应与所述第一分离剂的光学响应相同。
2.如权利要求1所述的样品检测方法，其中，第一分离剂为用于光学异构体的分离剂。
3.如权利要求2所述的样品检测方法，其中，所述用于光学异构体的分离剂含有包含多糖以及用于取代多糖的羟基或氨基的全部或一部分的芳香族酯基、芳香族氨甲酰基、芳香族醚基或羰基的多糖衍生物。
4.一种薄层层析板，其具有第一分离剂层，所述第一分离剂层的展开方向为第一方向，和在与所述第一方向垂直的第二方向上的第二分离剂层，所述第二分离剂层与第一分离剂层相邻接，其中 所述第一分离剂层是由对紫外线或着色剂具有光学响应的第一分离剂所形成； 所述第二分离剂层由具有不同于所述第一分离剂的光学响应的光学响应的第二分离剂所形成；和 当在第一分离剂层中使点在第一方向上展开时，第一分离剂层中在第二方向上的点移动距离W2与第一分离剂层中在第一方向上的点移动距离Wl之比为不超过±0. 5。
5.如权利要求4所述的薄层层析板，其中，所述第一分离剂为用于光学异构体的分离剂。
6.如权利要求5所述的薄层层析板，其中，所述光学异构体的分离剂含有多糖以及用于取代多糖的羟基或氨基的一部分或全部的芳香族酯基、芳香族氨甲酰基、芳香族醚基或擬基。
7.一种制作薄层层析板的方法，所述薄层层析板具有第一分离剂层以及与第一分离剂层相邻接的第二分离剂层， 所述方法包括 通过将含有涂布溶剂和对紫外线或着色剂具有光学响应的第一分离剂的第一浆料涂布于支持体上来形成第一分离剂层的步骤；和 通过将含有涂布溶剂和具有不同于第一分离剂的所述光学响应的光学响应的第二分离剂的第二浆料涂布于支持体上来形成与所述第一分离剂层相邻接的第二分离剂层的步骤，其中 对于第一和第二浆料，使用相同种类的涂布溶剂。
全文摘要
本发明提供一种能够通过光学性响应通过分离剂层来检测样品中的成分的分离的薄层层析板及薄层层析法，所述分离剂层不能检测样品中成分的分离。对于对紫外线或着色剂具有光学响应性的样品，本发明使用具有与样品相同的光学响应性的第一分离剂层以及与第一分离剂层相邻接而并列设置的、具有不同于前述光学响应性的光学响应性的第二分离剂层的薄层层析板；实施样品在第一分离剂层中的展开；然后实施点从第一分离剂层向第二分离剂层的进一步展开，通过曝露于紫外线辐射或用着色剂显色处理在第二分离剂层中对点进行检测。此外，使第一分离剂层中的展开轴保持大致垂直，并且通过调整粘合剂的混合比来防止发生边界面处的点变宽现象。
文档编号G01N30/93GK103026224SQ20118002630
公开日2013年4月3日 申请日期2011年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者蓑田稔治, 池田勇, 能势悟, 竹谷德朗, 冈本一郎 申请人:株式会社大赛璐