专利名称：人巨细胞病毒感染的检测方法
技术领域：
本发明涉及人巨细胞病毒感染的检测方法。
背景技术：
在以人巨细胞病毒(HCMV)为病因的感染症的血清学诊断中，通常使用病毒抗原 (天然抗原)。但在天然抗原中，不可忽视因制备方法而产生的批间差异。另外，由于是处理病毒本身，因此在安全性或简便性上也存在问题。
为了实现HCMV血清学诊断的标准化，人们希望实现抗原的重组化，但在只使用重组抗原时，已知检查的灵敏度、特异性尚不充分。这是由于难以从多个病毒抗原中选择适合重组化的适当的抗原的缘故。除此之外，认为使用各抗原蛋白的部分表达片段也是一个原因。
例如，作为主要的抗原而已知的ppl50是分子量为约150kDa的蛋白，因此不可能使用大肠杆菌进行大量合成，且难以在检查中使用全长蛋白。因此，在市售的检查试剂盒中，是将PP150的片段(代表性的是30个残基 40个残基左右)与其他HCMV蛋白片段适当混合用作抗原。但 是，有报道称只使用部分表达片段时，检查的灵敏度为60%左右，并不充分。
但是，还已知在采用免疫测定的血清检查领域，虽然必需使用全长抗原，但检测灵敏度未必有所提高。例如，在非专利文献I中，对于HCMV的天然抗原(包含全长病毒蛋白)，研究HCMV阳性患者血清组的抗体反应性，并给出了对于每个蛋白评价其抗体反应性的结果，但能够达到接近100%的检测灵敏度的只有ppl50，根据蛋白的种类，检测灵敏度变得非常低，达到50%左右以下。
现有技术文献专利文献专利文献1:日本特表2000-514300号公报；非专利文献非专利文献1:Journal of Clinical Microbiology: 37(1)，第 179-188 页，1999。 发明内容
发明所要解决的课题本发明的目的在于提供可以高灵敏度地检测HCMV感染的实用性高的新方法。
解决课题的方法本发明人等合成了 15种HCMV蛋白的全长蛋白，并深入研究了其与HCMV感染患者血清的反应性，结果发现使用PP28全长蛋白作为抗原时，可以无遗漏地检测所有的感染患者， 还可以使用大肠杆菌以重组蛋白的形式大量合成、纯化PP28全长蛋白，并将其作为用于检查HCMV的抗原进行商业利用，从而完成了本发明。
S卩，本发明提供人巨细胞病毒感染的检测方法，该检测方法包括通过使用人工多肽作为抗原的免疫测定，测定从受试者中分离的样品中所能含有的抗PP28的抗体，所述人 工多肽由与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列构成、且具 有与针对人巨细胞病毒所产生的PP28而在生物体内诱导的抗体通过抗原抗体反应进行结 合的反应性。另外，本发明还提供人巨细胞病毒感染的检测试剂，其中包含人工多肽，所述 人工多肽由与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列构成、且 具有与针对人巨细胞病毒所产生的PP28而在生物体内诱导的抗体通过抗原抗体反应进行 结合的反应性。本发明还提供人巨细胞病毒感染的检测试剂盒，其中包含上述本发明的检 测试剂。
发明效果根据本发明，提供检测灵敏度极其优异的HCMV感染的检测方法。根据本发明，通过简 便的免疫测定，可以无遗漏地准确检测所有的HCMV感染患者。在公知的抗体检查方法中， 有使用PP28片段作为抗原的方法，例如非专利文献I中还记载着使用pp28的30个残基 左右的大小的片段检测血清中的抗HCMV抗体的方法。但是，根据非专利文献1，使用pp28 片段时，在一成以上的患者中出现假阴性。若出现假阴性，则漏掉了感染患者，因此在临床 检查中成为重大问题。根据本发明的方法，不会漏掉感染患者，可以准确地进行检测，可以 对临床检查作出重大贡献。
图1是通过蛋白质印迹确认使用抗体柱纯化在大肠杆菌中表达的PP28重组蛋白 的过程的结果。左部分是使用实施例中制备的抗PP28单克隆抗体进行检测的结果，右部分 是使用抗大肠杆菌抗原的抗体进行检测的结果。Ma :标记物、元柱添加前、pass :通过组 分、elute :洗脱组分、conc.:浓缩组分。
具体实施方式
pp28是作为HCMV的结构蛋白之一的28kDa的磷蛋白，由于其编码在UL99基因中， 所以有时还被称作UL99。SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列是HCMV AD169株所具有的pp28 的氨基酸序列，在GenBank中也以X17403(全基因组)等检索号注册。编码SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列的病毒DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO:1。
在本发明中，使用由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列构成的人工pp28作为抗原。 或者，使用人工多肽作为抗原，所述人工多肽由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列中有少数氨基 酸残基被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列构成、且具有与针对HCMV产生的 PP28而在生物体内诱导的抗体通过抗原抗体反应进行结合的反应性。后一种多肽与SEQ ID NO: 2的同源性为90%以上、优选为95%以上、更优选为98%以上。作为后一种多肽，还 优选由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列中有I个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或 添加而得到的氨基酸序列构成的多肽。
在实施例中，只使用由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列构成的pp28全长蛋白作 为抗原，可以检测所有的来自HCMV感染患者的100个检体。病毒的基因组突变频繁，关于 PP28的氨基酸序列，在临床分离株中就发现了各种各样的突变序列。因此，在采集了上述 检体的100名感染患者中，认为在HCMV的pp28的氨基酸序列上存在一部分差异。即使是针对由上述的各种氨基酸序列构成的天然的PP28而在生物体内诱导的抗体，也均与由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列构成的多肽反应而被检测出来，因此即使是以与SEQ ID NO: 2在氨基酸序列上存在一部分差异的多肽作为抗原的情形，认为也同样可以检测抗pp28的 抗体(抗pp28抗体)。当为与SEQ ID NO: 2的同源性足够高的多肽时，与在HCMV感染者 体内诱导的抗PP28抗体的反应性和由原始的SEQ ID NO: 2构成的pp28同等的几率高。
需要说明的是，由任意的氨基酸序列构成的多肽是否具有与针对HCMV所产生的 PP28而在生物体内诱导的抗体通过抗原抗体反应进行结合的反应性，这例如可以通过使由 已知的HCMV感染患者分离的血清等样品与该多肽反应而容易地进行确认。如果可以确认 存在于血清中的抗体与多肽结合，则可以判断该多肽具有上述的反应性。
这里，氨基酸序列的“同源性”是指，将应该进行比较的两个氨基酸序列排列整齐， 使这两个氨基酸序列的氨基酸残基尽可能多地一致，用一致的氨基酸残基数除以总氨基酸 残基数，所得的值用百分率表示，即为同源性的值。进行上述排比时，根据需要，在进行比 较的两个序列的一方或双方中插入适当的间隙。关于这样的序列的排比化，例如可以使用 BLAST、FASTA、CLUSTAL W等众所周知的程序容易地进行。插入间隙时，上述总氨基酸残基 数是指将I个间隙作为I个氨基酸残基来计数的残基数。如此计数的总氨基酸残基数在进 行比较的两个序列间不同时，同源性(%)用一致的氨基酸残基数除以长的序列的总氨基酸 残基数来计算。
需要说明的是，已知构成天然蛋白的20种氨基酸可以分成具有类似性质的组，如 具有低极性侧链的中性氨基酸(Gly、Ile、Val、Leu、Ala、Met、Pr0)、具有亲水性侧链的中性 氨基酸(Asn、Gln、Thr、Ser、Tyr、Cys)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、碱性氨基酸(Arg、Lys、His)、 芳族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)，当为这些组间的取代时，多肽的性质往往不会发生变化。因此， 当SEQ ID NO: 2的少数氨基酸残基在上述各组内被取代时，与针对HCMV所产生的pp28而 在生物体内诱导的抗体的反应性、与由原始的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列构成的多肽同等 的可能性特别高。在本发明中用作抗原的多肽中，由如此取代的氨基酸序列构成的多肽是 由不同于SEQ ID NO: 2的氨基酸序列构成的多肽的一个优选例子。
“人工多肽”是指，通过化学合成、基因工程学方法及其他方法人工制造的多肽，不 包含对在感染了 HCMV的细胞内由HCMV基因组表达产生的蛋白进行回收而得到的多肽。如 上所述，PP28的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列注册在数据库中并众所周 知，本申请序列表中也有记载。另外，编码各氨基酸的密码子是公知的，因此可以容易地鉴 定编码特定的氨基酸序列的多核苷酸的核苷酸序列。因此，即使是由不同于SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列构成的多肽，也可以容易地鉴定编码该多肽的多核苷酸的核苷酸序列。根据 上述序列信息，本发明中用作抗原的多肽可以通过任一种方法来制造。
作为化学合成法的具体例子，例如可以列举Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法 (叔丁氧羰基法)等。另外，还可以利用各种市售的肽合成仪按照常规方法进行合成。进行 化学合成时，只根据氨基酸序列，即可合成所期望的多肽。
利用基因工程学方法来制作多肽的方法也众所周知，简而言之，制备编码上述多 肽的多核苷酸，将该多核苷酸插入适当的表达载体中，再使用适当的表达系统使之表达并 回收、纯化，从而可以以重组多肽的形式得到目标抗原多肽。本发明中用作抗原的多肽具有 百数十残基以上的大小，因此为了以低成本进行大量合成，优选利用基因工程学方法，使用大肠杆菌等宿主细胞制作重组多肽。根据使用的宿主细胞的种类，重组多肽可以接受各种 翻译后修饰(N末端甲硫氨酸的脱离、N末端乙酰化、添加糖链、在细胞内利用蛋白酶进行的 有限分解、肉豆蘧酰化、异戊二烯化、磷酸化等)，但这样的翻译后被修饰的形态的多肽，只 要其具有与针对HCMV所产生的pp28而在生物体内诱导的抗体的反应性，在本发明的方法 中也可用作抗原。
通过基因工程学方法制作由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列构成的多肽时，编码 该多肽的多核苷酸(SEQ ID NO:1)可以如下制备用具有由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 构成的PP28的HCMV(AD169株等)感染适当的宿主细胞，从该感染细胞中提取病毒DNA，再 通过PCR合成DNA，即可制得。关于PCR中使用的引物，本领域技术人员根据SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列可以容易地进行设计、制备，例如可以使用实施例中使用的由SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列构成的引物。使用表达由其他的氨基酸序列构成 的pp28的HCMV株时，可以制备编码由不同于SEQ ID NO: 2的氨基酸序列构成的多肽的多 核苷酸。另外，关于编码由所期望的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，可以使用市售的核 酸合成仪、或者如上所述利用常规方法向已制备的DNA中导入适当的突变而得到。将制备 的多核苷酸插入适当的载体中，使其在适当的表达系统中表达，再将其回收、纯化，从而可 以得到所期望的多肽。使用的载体或各种表达系统(细菌表达系统、酵母细胞表达系统、哺 乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、无细胞表达系统等)也众所周知，各种载体或宿 主细胞、试剂类、试剂盒均有销售，所以本领域技术人员可以适当选择使用。HCMV株也有市 售，另外还可以从感染患者中分离得到，因此容易获取。病毒DNA的提取、PCR、向载体中插 入DNA、向宿主细胞中导入载体、所表达的多肽的回收、纯化等方法本身均为众所周知的常 规方法。
如下述实施例中具体所述，由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列构成的重组多肽可 以使用大肠杆菌表达系统进行表达，该已表达的多肽例如可以使用固定有与PP28特异性 结合的单克隆抗体的抗体柱简便地进行纯化。若使用如此操作而得到的重组多肽作为免疫 测定的抗原，则可以无遗漏地检测所有的HCMV感染患者。需要说明的是，单克隆抗体的制 作方法是众所周知的常规方法，本领域技术人员可以容易地进行制作。例如，如下述实施例 中也记载的那样，用灭活病毒对动物进行免疫，再从该动物中采集脾细胞等产生抗体的细 胞，使其与骨髓瘤细胞融合制作杂交瘤，再选择产生具有所期望的结合性的抗体的杂交瘤 使之增殖，从而可以从培养上清中回收与PP28进行特异性结合的单克隆抗体。
免疫测定本身在该领域众所周知。若将免疫测定按照反应方式进行分类，则分成 夹层法、竞争法、凝聚法、免疫层析法、蛋白质印迹法等；若按照标记进行分类，则分成放射 免疫测定、荧光免疫测定、酶免疫测定(EIA)、生物素免疫测定等。另外，使用抗原的抗体检 查方法也已知有各种方法，作为具体例子并不限于这些，可以列举EIA(ELISA、CLEIA(化 学发光酶免疫测定法)、蛋白质印迹等)、凝聚法(乳胶凝聚法等)、补体结合反应(CF)等。 按照本发明的方法测定样品中的抗PP28抗体时，可以采用公知的任一种免疫测定法。需要 说明的是，在本发明中，“测定” 一词包含检测、定量和半定量。
用于免疫测定时，上述的人工多肽抗原可以以在单末端或两末端添加有任意的氨 基酸序列的形态(作为由包含这样的添加序列的氨基酸序列构成的多肽)进行使用。在该 领域，即使是与不同的蛋白融合而得到的融合蛋白，也可以使用识别一方的蛋白的抗体进行检测，这是广为人知的事实。因此，即使以这样的形态使用上述人工多肽，也可以对样品 中的抗PP28抗体进行免疫测定。例如，即使是以与其他蛋白的融合蛋白的形态进行使用的 情形，在该融合蛋白中发挥抗PP28抗体的抗原的功能的也是上述的人工多肽部分，因此包 含在“使用人工多肽作为抗原”中。如上所述，将上述人工多肽抗原以在单末端或两末端添 加有任意的氨基酸序列的形态进行使用的情形也包含在本发明的方法中。上述人工多肽中 所添加的氨基酸序列可以是构成任何的功能性蛋白或其功能性片段的氨基酸序列，也可以 是接头等不具有生理活性的序列。当为重组多肽时，有时在制造步骤中添加GST或His等 标记序列，但即使是添加有这样的标记序列的状态，也可以直接用作抗原。
例如，进行ELISA或CLEIA时，将上述人工多肽抗原分别在板或颗粒等上固化，使 其与样品反应，将样品中的抗PP28抗体捕集到固相上，进行清洗，之后与酶标记的抗IgG抗 体和/或抗IgM抗体反应，再进行清洗，之后添加底物。根据酶反应量，可以测定捕集到固相 上的抗PP28抗体。进行蛋白质印迹时，将上述人工多肽抗原电泳后转移到薄膜上，使该薄 膜与样品反应，之后与上述同样地与酶标记的抗IgG抗体和/或抗IgM抗体反应即可。当 为凝聚法时，例如将上述人工多肽抗原固定在乳胶颗粒等上，使其与样品反应，再根据吸光 度等测定颗粒的凝聚量即可。
在生物体内针对HCMV而诱导的抗体主要是IgG和IgM。初感染时，首先IgM上升， 感染数天后达到最大值，之后减少，IgG在感染后I周左右开始上升，以后长期持续。因此， 当为可以将样品中的抗PP28抗体分为IgG和IgM进行检测的方法时(例如上述的ELISA 或蛋白质印迹等)，从准确检测HCMV感染的角度考虑，在用抗原补足的抗pp28抗体的检测 中，优选使用抗IgG抗体和抗IgM抗体两者。
本发明的方法所适用的样品为从受试者体内分离的样品，优选为血液样品(全 血、血浆、血清等)。
实施本发明的方法时，可以同时使用上述人工多肽以外的HCMV抗原蛋白或其片 段。例如，进行ELISA时，将所有的抗原混合固化在板上、或者分别固化在分开的孔中，使其 与样品反应即可。进行CLEIA时，将所有的抗原混合固化在颗粒上，使其与样品反应即可。 进行蛋白质印迹时，例如将所有的抗原混合进行电泳，之后转移到薄膜上，使其与样品反应 即可。进行凝聚法时，将已混合的抗原固定在颗粒上，或者将抗原各自单独固定的颗粒混 合，使该颗粒与样品反应即可。
上述的人工多肽可以作为HCMV感染的检测试剂来提供。该试剂可以仅含有上述 的多肽，也可以进一步含有PP28以外的一种以上的抗原蛋白或其片段。另外，还可以进一 步含有对这些多肽的稳定化等有用的其他成分。另外，还可以以抗原多肽被固定在板或颗 粒等固相上的形态来提供。
上述检测试剂可以与其他的试剂类等适当组合，以HCMV感染的检测试剂盒的形 式来提供。免疫测定所必需的其他试剂类众所周知。例如，在本发明的检测试剂盒中，除上 述的检测试剂外，还可以包含可用作样品稀释液或清洗液等的缓冲液、用于检测与抗原多 肽结合的抗体的标记抗免疫球蛋白抗体等。实施例
以下，根据实施例来更具体地说明本发明。但本发明并不限于下述实施例。
1.候选抗原的选择利用小麦胚芽无细胞表达系统合成HCMV蛋白中的15种(下述表I)蛋白的全长蛋白。 合成中使用七A 7 U一寸^工> 7公司的Protemist DT。载体中所插入的插入DNA可以如下获得用HCMV AD169株(从理研A 4才丨— 7七>夕一购入)感染MRC-5细胞，从该感染细胞中提取病毒DNA，通过使用市售试剂盒的PCR扩增编码各全长蛋白的DNA即可得到。将各DNA克隆到包含SP6启动子的质粒载体中，使用所得的质粒DNA，利用5mL的反应系统(25// g质粒DNA)进行37°C、6小时的转录反应和15°C、20小时的翻译，合成各全长蛋白。需要说明的是，在PP28的DNA的扩增中，使用由SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列构成的引物(分别包含BamHI识别序列和NotI识别序列)，并使用Pfu Ultra DNA聚合酶(Agilent Technologies公司)在95°C 2分钟的变性处理、30个循环的95°C 20秒一 55°C 20秒一 72°C I分钟、最后72°C 3分钟的反应条件下进行PCR。
[表 I]
权利要求
1.人巨细胞病毒感染的检测方法，该检测方法包括通过使用人工多肽作为抗原的免疫测定，测定从受试者中分离的样品中所能含有的抗PP28的抗体，所述人工多肽由与SEQID NO: 2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列构成、且具有与针对人巨细胞病毒所产生的PP28而在生物体内诱导的抗体通过抗原抗体反应进行结合的反应性。
2.权利要求1所述的方法，其中，上述人工多肽由SEQID NO: 2所示的氨基酸序列或该氨基酸序列中有I个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列构成。
3.权利要求2所述的方法，其中，上述人工多肽由SEQID NO: 2所示的氨基酸序列构成。
4.权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，上述人工多肽是利用基因工程学方法制作的重组多肽。
5.人巨细胞病毒感染的检测试剂，其中包含人工多肽，所述人工多肽由与SEQID NO:2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列构成、且具有与针对人巨细胞病毒所产生的PP28而在生物体内诱导的抗体通过抗原抗体反应进行结合的反应性。
6.人巨细胞病毒感染的检测试剂盒，其中包含权利要求5所述的检测试剂。
全文摘要
本发明公开了可以高灵敏度地检测HCMV感染的实用性高的新方法。本申请的发明人合成了15种HCMV蛋白的全长蛋白，对其与HCMV感染患者血清的反应性进行了深入研究，结果发现使用pp28全长蛋白作为抗原时，可以无遗漏地检测所有的感染患者。可以使用大肠杆菌以重组蛋白的形式大量合成、纯化pp28全长蛋白，并可以将其作为用于检查HCMV的抗原进行商业利用。
文档编号G01N33/53GK103003694SQ201180033738
公开日2013年3月27日 申请日期2011年7月5日 优先权日2010年7月7日
发明者藤井信之, 本多秀夫, 内田好昭, 小见和也 申请人:富士瑞必欧株式会社