磁免疫传感器和使用方法

专利名称：磁免疫传感器和使用方法
技术领域：
本发明一般涉及用于通过传感器上并入磁捕获微珠的免疫测定快速测定液体样本中的分析物的设备和方法，所述设备和方法能够在医疗点诊断现场使用，包括例如在事故所在地点、急症室，在手术中、重症监护室中使用以及还有在非医疗环境中使用。
_4]
背景技术：
对生物样本执行针对所关注的分析物的多种实验室免疫测定测试，以便尤其进行诊断、筛检、疾病分期、法医分析、验孕和药物测试。虽然几种定性测试(如验孕)已简化到患者家用的简单试剂盒，但是大多数定量测试仍需要受过技能训练的专家在实验室环境中使用精细的仪器来进行。实验室测试增加了分析的成本和拖延患者接收结果。在许多情况中，这种拖延对于患者的状况或预后是有害的，例如对指示心肌梗塞和心力衰竭的标记物的分析。在这些和类似紧急情况中，在医疗点准确、低成本且最小延迟地执行此类分析是有利的。已描述了多种类型的免疫测定装置和过程。例如，Davis等在美国专利号7，419，821中公开一种用于通过在血液中进行免疫测定来测量分析物的一次性感测装置。此装置采用读数设备和配装在读数设备中以用于测量分析物浓度的容器盒。此类一次性装置的潜在问题是，由于制造容差或机器磨耗导致不同容器盒之间的液体测试参数的变动性。Zelin的美国专利号5，821，399公开了克服此问题的多种方法，其使用读数设备控制的自动流动补偿，该读数设备具有设在容器盒内的电导测定传感器。这些专利中的每个各自通过引用全部并入本文。电化学检测也已被应用于免疫测定，在该电化学检测中，分析物的结合直接或间接地导致与电极邻近的电活性物质的活性变化。有关电化学免疫测定的早期评述，参见Laurell 等，Methods in Enzymology, vol.73, “Electroimmunoassay，，，Academic Press,New York，339，340，346-348 (1981)。在电化学免疫传感器中，分析物与其同源抗体的结合导致电极处的电活性物质的活性变化，对电极施加适合的电化电势导致电活性物质的氧化或还原。有许多满足这些条件的布置。例如，可以将电活性物质直接连接到分析物，或可以将抗体通过共价键连接到酶，这由无电活性基质产生电活性物质或破坏电活性基质。有关电化学免疫传感器的评述，参见 M.J.Green (1987)Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sc1.316:135-142。已将磁组件与电化学免疫测定集成。参见例如Forrest等的美国专利号4，945，045,4, 978，610和5，149,630。再者，参见Davis等的共同拥有的美国专利号7，419，821 (如上文引用)和Miller等的7，682，833和7，723，099论述利用磁颗粒的免疫感测。微制造技术(例如，光刻和等离子沉积)对于在受限空间中构造多层化传感器结构是具有吸引力的。在Cozette等的美国专利号5，200，051中公开用于在例如硅基质上微制造电化学免疫传感器的方法，所述专利通过引用全部并入本文。这些包括分配方法，用于将生物试剂(例如，抗体)附着于包含光形成层和微粒乳胶的表面的方法，以及用于执行电化学测定的方法。Mirkin等的美国专利号7，223，438描述一种形成磁纳米结构的方法,其方式是使用纳米级尖头(nanoscopic tip)将前体沉积到基质上,然后转换前体以形成磁纳米结构。Prins等的美国专利号7，106，051描述一种用于确定液体中磁颗粒的密度的磁阻感测装置。Deetz等的美国专利申请公开2009/0191401涉及使磁体能够粘附到涂覆表面的磁接受漆料和涂料。这些漆料和涂料组合物包含多种尺寸的铁磁颗粒和含有最少填充物或没有填充物的基底树脂，并在基质上提供极其平滑的光洁度。Stern等的美国专利号5，587，102公开了一种含铁颗粒的乳胶漆组合物，以及Deetz的美国专利号5，843，329提供用于将磁接受颗粒混合到溶液中以用于制成磁性涂料的技术。Rohr等的共同拥有的美国专利号5，998，224和6，294，342公开了利用磁响应试剂的响应影响磁场来定性或定量地测量特异性结合对成员之间的结合的测定方法。这些专利中的每个均通过引用全部并入本文。用于基于激励式磁纳米颗粒的复用式免疫测定的集成生物传感器和用于基于光磁生物传感器的心肌肌钙蛋白的高灵敏性医疗点测试都有所描述。分别参见Bruls等，Lab Chip9, 3504-3510 (2009)和 Dittmer 等，Clin.Chim.Acta (2010), doi:10.1016/j.cca.2010.03.001。还有使用易感磁颗粒(magnetically susceptible particle)的大量公开内容，例如Senyei等的美国专利号4，230, 685,Whitehead等的美国专利号4，554，088和Chagnon等的美国专利号4，628，037。在测定中使用这些颗粒的一个重要因素是高效混合，从而相对使用主要依赖于扩散的大量结合(maciO-binding)表面而言，增强了目标分析物与颗粒表面之间的反应率。Siddiqi的美国专利号6，231，760和Kreuwel等的美国专利号6，764, 859中公开了磁混合系统。尽管有上面的文献，但是本领域中仍需要改良的免疫感测装置，其对于分析物(包括例如心肌梗塞的早期检测的心肌肌钙蛋白I)检测具有更大灵敏度。这些和其他需要通过本发明予以满足，这将在本发明所属领域的技术人员阅读以下公开内容后变得更加清晰。

发明内容
本发明涉及磁免疫感测装置和利用磁免疫传感器执行免疫测定来提供分析物的多种实时或准实时分析的方法。在一个实施方案中，本发明涉及一种磁免疫感测装置，其包括:大致平整芯片上的感测电极，其中该电极定位于用于接收与抗体标记的易感磁微珠混合的样本的导管中；以及芯片上集成的高场永磁层，其中该磁层相对于电极定位，从而吸引大致接近电极的微珠，并在移除未结合的样本和清洗电极期间将微珠大致保持在电极表面处。本发明的另一个实施方案涉及大致平整表面上的微制造的磁层，其包括:高场永磁颗粒，其中所述颗粒散布在以热、化学或光形成方式固化的固定化基质中；以及微制造的感测电极。
在另一个实施方案中，提供一种利用磁免疫传感器对样本中的分析物执行夹心免疫测定的方法，其中所述免疫传感器包括大致平整芯片上的感测电极和所述芯片上磁化并大致接近电极定位的集成层。此方法包括(a)将涂覆有分析物的捕获抗体的易感磁微珠与含分析物和信号抗体的样本混合，以在所述微珠上形成夹心；(b)将混合物施加到免疫传感器；(C)将所述微珠的至少一部分通过磁性局部定位和保持在电极上；(d)从电极上冲洗未结合的样本；(e)将夹心的信号抗体暴露于信号生成试剂；以及⑴测量来自电极处的试剂的信号。在又一个实施方案中，本发明涉及一种利用磁免疫传感器对样本中的分析物执行竞争性免疫测定的方法，其中所述免疫传感器包括大致平整芯片上的感测电极和所述芯片上磁化并大致接近所述电极定位的集成层。此方法包括(a)将涂覆有捕获抗体的易感磁微珠与含第一分析物和第二分析物的样本混合，其中标记所述第二分析物，以允许在所述微珠上结合；(b)将混合物施加到免疫传感器；(C)将微珠的至少一部分通过磁性局部定位和保持在电极上；(d)从电极上冲洗未结合的样本；(e)将第二分析物暴露于信号生成试剂；以及(f)测量来自电极处的所述试剂的信号。本发明的上述概述不旨在描述本发明的每个图示的实施方案或每种实施。以下的附图和详细描述更具体地例证了这些实施方案。附图简沭在特定实施方案的以下详说明述中描述了以及在以下附图中图示了本发明的这些和其他目的、特征和优点，其中:

图1是根据本发明一个实施方案的施加有磁场的导管中的槽形免疫传感器芯片的横截面图示；图2是槽形免疫传感器芯片和微电极阵列的俯视图；图3A-C图示用于在容器盒内将稀土永磁体定位于免疫传感器芯片下方的各种示例性构造；图4是传感器构造的磁场线的示意图；图5是芯片表面上捕获的易感磁微珠的显微图，其中磁体中心定位于免疫传感器周缘的正下方；图6图示用于易感磁微珠捕获测定的电化学检测步骤的三个痕量:不含cTnl的血衆；Cliniqa控制级3 ;以及Cliniqa控制级4。图7图示根据本发明一个实施方案，在容器盒壳体内将稀土永磁体定位于免疫传感器芯片下方；图8图示根据本发明一个实施方案的可折叠容器盒壳体，其中稀土永磁体被定位于免疫传感器芯片下方；图9是局部定位在PVA和NdFeB颗粒的图案化磁层上的易感磁微珠的显微图；图10是图9的装置的显微图和断层横截面；图1lA-C包括具有多种颗粒尺寸的NdFeB(图11A);聚酰亚胺中研磨的6μπιMQP (图11Β);聚酰亚胺中研磨的6μπι MQP (图11C)的图案化PVA薄膜的显微图；图12Α是6 μ m MQP NdFeB粉末的显微图以及图12B是使用球磨机粉碎的6 μ m MQPNdFeB粉末的显微图13是NdFeB颗粒表面上捕获的微珠的显微图；图14A和图14B示出以印制的NdFeB磁层部分覆盖的示例性基底免疫传感器电极阵列，其中保留阵列周缘的一部分暴露；图15A和图15B说明根据本发明的其他实施方案的套印的磁层；图16是切开的传感器，其图示图15A和图15B的印制的磁层剖面；图17图示根据本发明一个实施方案的蚀刻沟槽工序；图18是蚀刻到硅晶圆中的示例性底侧沟槽设计的俯视图；图19是底侧沟槽的横截剖面；图20A和20B示出蚀刻沟槽的不同视图；图21示出聚酰亚胺树脂中填充以NbFeB粉末的蚀刻沟槽；图22k和图22B是通过反应式离子蚀刻在硅基质上制成的矩形沟槽的显微图；图22A示出沟槽的横截面，以及图22B示出聚酰亚胺树脂中填充以NbFeB粉末的沟槽的不同横截面；图23示出用于扩大检测范围的示例性组合传感器设计，其中磁区由聚酰亚胺基质中NdFeB粉末的丝网印制线构成；图24示出用于扩大检测范围的示例性组合传感器设计，其中磁区由成块NdFeB磁体构成；图25示出根据本发明一个实施方案的另一个组合的传感器设计，其中在芯片上的开口圆是本发明的试剂的潜在印制位置；图26是根据本发明一个实施方案的振荡珠免疫测定(OBIA)的示意图，两个相邻磁区位于中心免疫传感器两侧，其中小微珠在之间移动；图27是图示随时间的微珠捕获程度的示意图；图28示出复用式0ΒΙΑ，其中存在多种不同类型的分析物捕获微珠，但是其中将它们有效地分隔到它们各自的捕获点上；图29图示用于测定肌钙蛋白I (TnI)(心脏损伤的标记)的安培计免疫测定的比
较原理；图30是本发明一个实施方案的免疫传感器容器盒盖的等体积俯视图；图31是本发明一个实施方案的免疫传感器容器盒盖的等体积仰视图；图32是本发明一个实施方案的免疫传感器容器盒的带垫片的布局的俯视图；图33是本发明一个实施方案的免疫传感器容器盒基座的等体积俯视图；图34图示示例性样本段形成装置；图35是免疫传感器容器盒的一个实施方案的俯视图；以及图36是免疫传感器容器盒的一个实施方案的流控的示意图。
具体实施例方式本发明涉及一种用于利用一次性容器盒测定液体样本中分析物的存在或浓度的设备及其方法。本发明适用于执行分析物的多种实时或准实时测定。本发明与全血样本中高灵敏度心肌肌钙蛋白测定尤其相关。在特定实施方案中，本发明涉及使用磁电化学免疫传感器或其他基于易感磁微珠局部定位步骤的基于配体/配体受体的生物传感器来测定生物样本(如血液)中的分析物。本发明还由此通过引用并入其相应的共同物权共同拥有的Davis等的美国专利号7，419，821和Miller等的7，682，833和7，723，099，上文中对它们各自进行了引用。本发明的易感磁捕获微珠方法的一个显著优点在于，提高了免疫测定的低端灵敏度，其中在检测极低水平的心肌损伤标记物(例如，cTnl)中存在已认识到的益处。本文描述和公开的本发明实施方案的其他优点和益处包括但不限于易于使用、分析的自动化(许多步骤，如果不是所有)以及消除分析中用户导致的误差。1.磁免疫传感器本发明的各个实施方案涉及一种包括在大致平整芯片上的基传感器或感测电极的磁免疫感测装置或免疫传感器，其中该感测电极定位于用于接收与能够吸引磁体或响应磁场的微珠混合的样本的导管中。将高场磁体，例如，永磁体或电磁体定位于接近免疫传感器芯片(例如，其下方)或并入免疫传感器芯片中，以用于吸引导管中大致接近感测电极的微珠。此磁区用于在移除未结合的样本以及冲洗电极期间大致将微珠保持在感测电极表面处或附近。正如本文详细描述的，将微珠涂覆有所述样本中的分析物的抗体，这样提供免疫测定的基础。在优选的实施方案中，使用包括读数设备或读取器和一次性使用容器盒的系统来分析生物样本中的分析物，所述一次性使用容器盒包含磁免疫传感器和所有其他测定组件。A.高场磁体在本发明的某些实施方案中，磁免疫传感器包括大致平整芯片上的感测电极,并且具有定位于接近芯片(例如，其下方)或与芯片关联的高场磁体，例如，永磁体或电磁体。本发明的磁免疫传感器提供大于约0.1特斯拉的场，并且具有能够在感测电极区域中从约0.05mm到约5mm范围内高效地吸引微珠的“视界(event horizon)”(如本文定义)。本发明的高场磁体，例如永磁体或电磁体包括提供高磁场(例如,大于约0.1特斯拉、大于0.4特斯拉或大于I特斯拉)的任何材料。该磁场可以，例如作为磁体的大致平整表面积上的剩余磁场来测量。虽然优选材料是钕铁硼合金(NdFeB)合金，并且更优选地为Nd2Fe14B,但是其他材料也可以使用。例如,本领域技术人员将认识到高场永磁体可以包括铁氧体或铝镍钴(AlNiCo)磁体，其通常呈现0.1至I特斯拉的场。由稀土元素(例如，铷合金和衫钴(SmCo)合金)构成的其他高场永磁体呈现超过I特斯拉，例如大于1.2特斯拉或大于1.4特斯拉的场。稀土磁体一般易碎且易腐蚀，并且因此常常将这些材料电镀或涂覆来保护它们免于破碎。此外，稀土磁体的居里点大致高于本发明的免疫测定中遇到的温度，可以在达到约50°C范围的环境中运行，对于血液中测定，通常恒温在37°C。正如本文使用的，“居里点”或“居里温度”是指铁磁材料的特征属性。铁磁材料的居里点是这样的温度，超过该温度铁磁材料丧失其在没有外部磁场的情况下拥有净(自发性)磁化的特征铁磁能力。在低于居里点的温度下，磁矩在铁磁材料中磁畴内部分地对齐。随着从居里点以下升高温度，热波动逐渐破坏此对齐，直到净磁化在居里点处及以上变为零为止。在居里点以上，该材料是纯顺磁体。在另一个实施方案中，高场磁体包括其中由电流的流动产生磁场的电磁体。电流可以由读取器提供，其中插入免疫感测装置，并且将免疫装置与之电接触。
1.定位于磁免疫传感器的壳体中的成块磁体本发明的的某些实施方案的磁免疫传感器包括大致平整芯片上的感测电极和定位于接近电极(例如，芯片下方或对侧)的成块永久性高场磁体。在某些优选的实施方案中，将成块永久性高场磁体定位于磁免疫感测装置的壳体(例如，塑料容器盒的切口或沟槽)中。优选地，将成块永久性高场磁体定位在塑料容器盒壳体的基座内(例如，与感测电极不是共平面的)。在其他实施方案中，将磁体定位于接近免疫感测装置的读数设备或读取器或免疫感测装置的读数设备或读取器中。在一个实施方案中,成块高场永磁体是大致圆柱形的,具有约0.1mm至约5mm范围的直径以及约0.1mm至约5_的长度，且定位成在导管中产生适于短时间段(例如，1_5分钟)内捕获微珠的“视界”(如本文定义)。该导管一般具有约0.2mm至约5mm的高度和约
0.2mm至约5mm的宽度，以及均匀或非均匀的横截面积。在其他实施方案中，成块磁体形状可以采用正方形、矩形、椭圆形、雪花形、金字塔、球形、半球形或其他构形的形式。本发明的一些实施方案的方法包括(a)将涂覆有捕获抗体的易感磁微珠与疑似包含分析物的样本以及信号抗体混合以在微珠上形成夹心；(b)将该混合物施加到免疫传感器，并使微珠的至少一部分通过磁性局部定位和保持在免疫传感器上；(c)从免疫传感器上冲洗未结合的样本，以及(d)将夹心的信号抗体暴露于信号生成试剂，并测量来自电极处的试剂的信号。在一些实施方案中，该方法可以使用易感磁微珠和从干基质溶解的信号抗体。在其他实施方案中，该方法在操作上依赖于在导管第一部分中进行的步骤(a)以及在导管中传感器所在的第二部分中进行的步骤(b)。2.与磁免疫感测装置一体的磁化层本发明的另一个实施方案包括磁免疫感测装置，其包括大致平整芯片上的感测电极。该电极定位于用于接收与抗体标记的易感磁微珠混合的样本的导管和磁化层(例如，微制造的磁层)中。磁化层可以包括在芯片上(例如，定位于芯片的任何表面上方，直接附着于芯片的任何表面上，涂覆到或图案化到芯片的任何表面上)或嵌入到芯片中(例如，定位于芯片内，与芯片成一体)。此构造吸引大致接近电极的易感磁微珠，并在移除未结合的样本以及冲洗电极期间将它们大致保持在电极处。磁化层优选地由可移动磁组合物(例如，浆料)形成，其包含在固定化或支承基质(例如，聚酰亚胺、聚乙烯醇(PVA)或热塑性等效物)中的以颗粒形式能够保持高场永久性磁场的材料，例如NdFeB合金。此浆料不受粘度限制，并且可包含适于应用的任何粘度。在多种任选的实施方案中，可移动磁组合物具有范围从0.3至300，000CPS，例如，从100至100, 000CPS或从1，000至10，000CPS的粘度。本发明的某些实施方案的浆料中的磁颗粒具有从0.01 μ m至100 μ m,例如，从0.1 μ m至10 μ m或从3 μ m至7 μ m的平均颗粒尺寸。除了聚酰亚胺、PVA和热塑性聚酰亚胺外，两部分化学固化的环氧树脂、聚酰亚胺薄膜等也可用作将磁颗粒固定到晶圆的支承基质。固化基质的方法可以基于光引发的、热引发的或化学引发的工序。在某些实施方案中，固定化基底由其他光形成基质材料构成。正如上文提供的，可以将浆料施加在免疫感测装置中或上的多种位置中(例如，晶圆或芯片、电极、壳体、读取器等的前侧或后侧)。例如，在本发明的一些实施方案中，以图案化方式(例如，使用掩膜)将高场永磁材料施加到大致平整芯片。在某些实施方案中，还将高场永磁材料施加到微制造感测电极。在其他实施方案中，将浆料施加在感测电极下方的层中。在施加工序之前，可以将浆料磁化或可以不将其磁化。但是，在沉积步骤之后，优选地将磁层磁化以提供向场的定向性。B.感测电极优选地在大致平整芯片(例如，硅晶圆)上微制造感测电极(例如，测电流的金阵列)，正如本文中列述的共同拥有的待决和已公布的专利(例如，美国专利号5，200, 051和7，419，821)。C.易感磁微珠在本发明的各个实施方案中，以易感磁微珠修改生物样本，例如，血液样本。易感磁微珠可以由本领域中已知易于被本发明的装置中或与之相关所利用的磁体(例如，永磁体或电磁体)移动的任何材料构成。因此，有关微珠的术语“磁性的”和“易感磁的”可以互换地使用。在本发明的一些实施方案中，微珠包括磁芯，其优选地被完全或部分涂覆有涂层材料。磁芯可以包括铁磁、顺磁性或超顺磁性材料。在优选的实施方案中，易感磁微珠包括铁氧体芯和外部聚合物涂层。但是，磁芯可以包含Fe、Co、Mn、Ni的一种或多种、包含这些元素中的一种或多种的金属、这些元素的有序合金、由这些元素构成的晶体、磁氧化物结构(如铁氧体)及其组合。在其他实施方案中，磁芯可由磁铁(Fe3O4)、磁赤铁U-Fe2O3)或由式MehxOFeJxO3提供的二价金属铁氧体构成,其中在式Me^OFeJxC^中,Me是例如,Cu、Fe、N1、Co、Mn、Mg或Zn或这些材料的组合，并且其中x的范围在0.01至99。用于涂层的适合材料包括合成和生物聚合物、共聚物和聚合物混合物以及无机物材料。聚合物材料可以包括丙烯酸酯、硅氧烷、苯乙烯、醋酸酯、对苯二乙二醇(akyleneglycol)、烯烃、烯化氧、 聚对二甲苯、乳酸和乙醇酸的聚合物的各种组合。生物聚合物材料包括淀粉或类似的碳水化合物。无机涂层材料可以包括金属、金属合金和陶瓷的任何组合。陶瓷材料的实例可以包括羟磷灰石、碳化硅、羧酸酯、磺酸盐、磷酸盐、铁氧体、磷酸酯和元素周期表第IV族元素的氧化物。在本发明的其他实施方案中，磁微珠包括其上敷设磁性涂层的非磁性基质微珠，非磁性基质微珠由例如选自聚苯乙烯、聚丙烯酸和葡聚糖的材料形成。原理上来说，在考虑到易感磁微珠的可扩散性要求的前提下，可以采用能够用本发明的高场磁体定位的任何正确尺寸的易感磁微珠。在优选的实施方案中，将至少50重量％，例如至少75重量％的易感磁微珠保持在电极表面处。在一些示例性的实施方案中，易感磁微珠的平均颗粒尺寸可以在从0.01 μ m至20 μ m,例如，从0.1 μ m至10 μ m,从
0.Ιμπι至5μηι或从0.2μηι至1.5μηι的范围。正如本文所使用的，术语“平均颗粒尺寸”是指如本领域中熟知的方法所测定的颗粒(例如，微珠)的平均最长尺寸，例如球形颗粒的直径。易感磁微珠的颗粒尺寸分布优选地是单峰分布，虽然根据本发明也可以使用多峰分布。虽然使用球形易感磁微珠是优选的，但是在其他实施方案中，其他微珠形状和结构，例如椭圆形、半球形，圆柱形和其他不规则构形的颗粒也在如本文使用的术语“微珠”和“微颗粒”的含义内。易感磁微珠制品的商业来源包括Life Technologies 的Invitrogen (Carlsbad, California, U.SA.)、Ademtech(Pessac, France)、ChemicellGmbH (Berlin, Germany)、Bangs Laboratories, Inc. (Fishers, IN)和 Seradyn, Inc.(Indianapolis, IN)。许多可商购的产品引入可被采用来将抗体(例如，IgG)固定在微珠表面上的表面功能化。示例性的能化包括羰基、氨基或链霉亲和素改性的易感磁微珠。易感磁微珠优选地涂覆有作为心血管疾病标记物的分析物的抗体，心血管疾病标记物尤其诸如，心肌肌钙蛋白1、肌钙蛋白T、肌钙蛋白复合物、人绒毛膜促性腺激素、BNP,肌酸激酶、肌酸激酶亚基M、肌酸激酶亚基B、肌酸激酶MB (CK-MB)、proBNP、NT-proBNP、肌红蛋白、肌球蛋白轻链或其改性片段。此外，还可以利用其他指示的标记物。又一些示例性的分析物尤其包括但不限于，P_HCG、TSH、ultra hTSH I1、TT3、TT4、FT3、FT4、髓过氧化物酶、D- 二聚体、CRP、NGAL, PSA、LH、FSH、半乳糖凝集素_3、催乳素、孕酮、雌二醇、DHEA-S, AFP、CA125I1、CA125、CA 15-3, CA 19-9, CA19-9XR、CEA、甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、T-uptake、Tg、抗 Tg、抗 ΤΡ0、铁蛋白、皮质醇、胰岛素、HBsAg、HCV Ag/Abcombo、HCV coreAg、抗 HCV、AUSAB (抗 HB)、C0RE、C0RE-M、SHBG、iPTH、茶碱、雷帕霉素、他克莫司、抗 HAV)、抗HAV IgM、HAVAB, HAVAB-M, HAVAB-M2.0、HAVAB-G, HAVAB2.0、HAVAB2.0 定量、IgM、CMV IgM、CMV IgG、§._2_ 微球蛋白、洋地黄毒式、HBe、抗 HBe、HBeAg、HIVl/2g0、HIV Ag/Ab combo、睾酮、SCC、维生素B12、叶酸、梅毒、抗HBe、风疹IgG、风疹IgM、同型半胱氨酸、ΜΡ0、巨细胞病毒(CMV) IgG亲合力、弓形虫IgG亲合力、弓形虫IgG、弓形虫IgM、C-肽、维生素D、HTLV I/
I1、总fihCG、孕酮、estradrogen、催乳素、肌红蛋白、tPSA、fPSA、卡马西平(CBZ)、地高辛、庆大霉素、NAPA、苯妥英、苯巴比妥、丙戊酸、万古霉素、普鲁卡因、奎尼丁、拓普霉素、甲基苯丙胺(METH)、安非他明(AMPH)、巴比妥盐、苯二氮、大麻、可卡因、美沙酮、鸦片制剂、PCPji乙酰氨基酹、乙醇、水杨酸盐、三环素、holoTc、抗CCP、HbAlc、barbs_U。在本发明的某些实施方案中，所述抗体是针对样本中的低丰度分析物。上文的缩略语名称对于临床检验分析领域中的普通技术人员将是熟知的。本发明的磁免疫传感器和方法优选地还包括第二抗体，第二抗体作为标记抗体，在本文中也称为信号抗体。在一些实施方案中，标记抗体采用可溶解干试剂的形式，其还可以包含本发明中采用的易感磁微珠，正如下文论述的。固定抗体和标记抗体都可以是单克隆抗体、多克隆抗体、其片段以及其组合。此外，可以利用多种标记来标记这些抗体的其中一种或多种，包括放射性同位素标记、酶、发色团、荧光团、化学发光物质、离子载体、电活性物质以及免疫测定领域中已知的其他标记。在第二抗体以酶标记的情况中，它优选地是ALP、辣根过氧化物酶或葡萄糖氧化酶。在其他实施方案中，以荧光素、二茂铁、对氨基苯酚或其衍生物来标记分析物。在某些实施方案中，作为例如Advanced Enzyme Technologies (Pontypool, GreatBritain)提供的乳糖醇和DEAE-葡聚糖的混合物中的悬浮物，将易感磁微珠沉积在磁免疫感测装置的适合区域中。溶剂，通常是水的蒸发产生其中固定微珠的玻璃态沉积。乳糖醇/DEAE-葡聚糖使得微珠能够以机械和生化稳定的状态在装置内形成区域，但是在与样本接触后还会快速溶解。在其他实施方案中，将易感磁微珠与样本均匀地混合。在另一些其他实施方案中，可以将易感磁微珠与样本非均匀地混合；而是，有意地相对于感测电极优化微珠的位置和浓度。本领域技术人员将认识到，在引入 到磁免疫感测装置中之前，可以例如作为血液收集装置的组成部分或作为标准人工添加步骤，将本发明的易感磁微珠添加到生物样本中。但是，为了方便使用者和确保质量测定，优选地将易感磁微珠包含在装置内。在本发明的一些实施方案中，收集样本，例如全血样本，并且然后通过将包含易感磁微珠的干试剂溶解到样本中来修改样本。可以用干试剂涂覆免疫感测装置的任何部分(例如，感测装置、导管、样本入口、样本容放室)。除了易感磁微珠外，干试剂还可以包含如下的其中一种或多种:用于减少白细胞干扰的微珠、杀白细胞试剂、缓冲液、盐、表面活性齐 、稳定剂、单一碳水化合物、复合碳水化合物及其多种组合。干试剂还可以包含分析物的酶标记的抗体(例如，上文描述的标记抗体)。在多种实施方案中，在第一容器或位置中，使用易感磁微珠来修改生物样本，例如血液，并且然后将样本传递到包含捕获抗体和信号抗体的第二容器或位置。在一些实施方案中，将易感磁微珠容放在溶液中，并与生物样本混合，并且将所得修改的样本引入到磁免疫感测装置中。例如，可以将血液样本与易感磁微珠混合，以形成修改的样本，然后将其引入到装置中。在某些实施方案中·，磁免疫感测装置，例如，容器盒包括含有液体的装料袋，所述液体包含易感磁微珠，可以将该液体与装置中的生物样本混合，并且然后大致按本文描述的处理以形成用于分析物检测的测定(例如，夹心测定)。在其他实施方案中，米用电润湿将含有易感磁微珠的第一液体与液体生物样本(例如，血液)混合。在一个这种实施方案中，可以提供用于操控液滴的设备。例如，该设备可以具有单侧电极设计，其中所有导电元件包含在操控液滴的一个表面上。在其他实施方案中，为了包含要操控的液滴，与第一表面平行地提供附加表面。通过执行基于电润湿的技术操控液滴，其中以受控的方式将第一表面上包含或嵌入在第一表面中的电极依次赋能和释放。该设备可以允许多次液滴操控过程，包括将两个液滴汇合并混合在一起，将液滴分成两个或更多个液滴、通过从液流形成个体可控液滴来对连续液流取样，以及迭代实现液滴的二进制或十进制混合来获得期望的混合比。此外，可以通过例如在样本预处理步骤中添加微珠来修改本领域中已知的任何免疫测定形式以包括本发明的易感磁微珠。预处理可以通过例如将微珠引入血液收集装置中来实现、在单独的容器中实现，或可以在装置的测试循环中通过引入微珠以在免疫测定装置本身中进行预处理。在本发明的各个实施方案中，微珠是可移动的，并且由此能够与分析物相互作用。在结合到所关注的分析物之后，使用磁力将微珠集中在用于测量的电极处，促使易感磁微珠局部位于用于信号检测的安培测定电极。使用根据本发明的可移动微珠的一个优点在于，它们在样本或液体中的运动加速结合反应，从而使得测定的捕获步骤更快。D.添加剂在本发明的一些实施方案中，可以将添加剂包含在磁免疫测定装置中或与测定一起使用。在某些实施方案中，可以添加抗凝剂。例如，在肝素抗凝管中未收集到样本或在肝素抗凝管中未适当混合样本的情况中，可以添加肝磷脂来改善性能。可以添加足够量的肝磷脂，以使新鲜未肝素化血液在容器盒的测定循环期间(通常在2至20分钟的范围中)保持不凝聚。在另一些其他实施方案中，可以添加proclin、DEAE-葡聚糖、氨丁三醇缓冲剂和乳糖醇作为试剂稳定剂。在又一个实施方案中，可以添加表面活性剂(如聚山梨酯20，也称为Tween 20)以减少蛋白质与塑料的结合，塑料是用于磁免疫感测装置的容器盒壳体的优选材料。添加表面活性剂还有利于试剂均匀地涂覆在塑料表面上，并将糖(例如，乳糖醇)的结晶减少到最小。在本发明的其他实施方案中，可以添加抗菌剂或杀虫剂(例如，叠氮化钠)以抑制细菌生长。I1.磁免疫感测装置的制造在本发明的一个实施方案中，将硅晶圆加热氧化以形成具有约Ιμπι厚度的绝缘氧化层。然后将钛/钨层溅镀到该氧化层上以达到约100 A至约1000 A的优选厚度，然后溅镀金层，其范围从500 A至1000 A厚,最优选为约800 A厚。接下来，将光刻胶旋涂到晶圆上，并使其干燥并烘烤。然后使用接触掩膜曝光表面，将潜影显影，并将晶圆暴露于金蚀刻剂。将图案化的金层涂覆有光可界定聚酰亚胺，适当地将其烘烤，使用接触掩膜曝光，显影，在氧等离子体中清洗，并且优选地在350°C下亚胺化约5小时。这样在聚酰亚胺层中成正方形阵列保留大量电极开口。在一些实施方案中，该正方形阵列具有例如从2 μ m至100 4!11、从541]1至15μ 或约7 μ m的直径，以及具有例如从5 μ m至100 μ m、从10 μ m至20μπι或约15μπι的间距。这些电极覆盖的区域(即，传感器区域)为大致圆形的，具有例如从50 μ m至1000 μ m,从100 μ m至300 μ m或约300 μ m的直径。在将晶圆切割成个体芯片之后，将每个芯片组装成一次性使用容器盒。这些容器盒可以是Davis等的美国专利号7，419，821中所描述的类型，或2009年12月18日提交的共同拥有的美国专利申请号61/288，189,标题为“Foldable Cartridge Housings forSample Analysis”中所描述的类型,这些专利通过引用全部并入本文。在一个实施方案中，将传感器定位于用于接收样本的导管中，并将高场磁体，例如永磁体或电磁体定位于传感器正下方，优选地定位于其中心区域中。在另一个实施方案中，可以将高场磁体定位于导管的传感器区域的上方。这些元件可以位于仪器壳体内的固定位置中，或调适成能够相对于免疫传感器和导管移入或移出位置的促动器。可以使用一个或多个高场磁体以吸引导管中(例如，大致接近传感器)的易感磁微珠，并在移除样本并冲洗传感器以移除未结合或部分吸收的试剂期间，将它们保持在传感器区域中。如上文描述的，将磁微珠涂覆有样本中可能存在的分析物的抗体。A.沟槽 在图1所示的本发明的免疫传感器实施方案中，示出一些附加特征。具体来说，图1的横截面表示示出以适合材料(例如，可光赋形的聚酰亚胺)图案化且具有沟槽(或槽)的电化学传感器，这些沟槽(或槽)具有从约I μ m至约100 μ m,例如,从3 μ m至50 μ m或从10 μ m至20 μ m的宽度,从约0.1 μ m至约100 μ m,例如从I μ m至50 μ m或从5 μ m至10 μ m的高度或深度，以及约Iym至约5000 μ m,例如，从10 μ m至1000 μ m或从100 μ m至500 μ m的长度。在本免疫传感器设计实施方案中，将平整芯片定位于能够沿着大致z轴上的方向(如矢量BI和B2所示)施加磁场的分析系统。在一些实施方案中且如图1所示，这些沟槽可以沿着与免疫感测装置的样本流动方向大致平行的方向设置朝向。在备选的实施方案中，这些沟槽可以沿着与样本流动方向大致横向或垂直的方向设置朝向。本发明的沟槽结构可以有益地抑制沿着X和/或y方向的液体运动例如通过冲洗液体移除已经通过磁性局部定位于沟槽内的任何易感磁微珠。图2中图示图1的电化学传感器的俯视示，其中在传感器结构中每个沟槽底部处观察到阵列形式的微电极，其直径PD(即，约Ιμπι至约ΙΟΟμπ )和间距UL(约5μπ 至约500 μ m)。这些微电极可以由金或其他适合导体构成，并且可如上所述进行图案化(例如，利用金和聚酰亚胺)。在优选的实施方案中，将高场磁体定位于电化学传感器的下侧上或下方。B.磁场在本发明的一些实施方案中，在导管中大致每个位置的易感磁微珠上形成夹心免疫测定，并通过将磁体引领到容器盒附近并缓慢地振荡液体，以在传感器表面上或附近缓慢地收集微珠。在某些实施方案中，通过设在仪器内的可移动高场磁体，例如，永磁体或电磁体产生振荡的磁场。在其他实施方案中，一个或多个磁体固定于仪器内，并且将夹心形成设在超出磁场的位置。然后可以通过泵或类似装置将样本引入磁场足够强以实现捕获的区域中。在优选的实施方案中，例如通过一个或多个泵，使样本在传感器上方以前后运动进行振荡，同时施加磁场，以便将易感磁微珠被吸引到传感器表面的机会最大化。II1.执行免疫测定的方法本发明可应用于利用磁免疫传感器执行免疫测定的方法。在优选的实施方案中，在如下一个或多个领域中可以采用本发明:在医疗点测试的应用环境中最显而易见的免疫传感器；电化学免疫测定；与免疫参照(immuno-reference)传感器结合的免疫传感器；全血免疫测定；基于一次性容器盒的免疫测定；以及仅一次冲洗步骤的非循序免疫测定；以及干试剂涂层。正如本领域人员将认识到的，本文公开的一般概念可应用于许多免疫测定方法和平台。本发明的方法可应用于多种生物样本类型(例如,血液、血浆、血清、尿液、间质液以及脑脊液)。本发明可应用于兼包括夹心免疫测定和竞争性免疫测定的多种免疫测定。A.夹心免疫测定在夹心测定实施方案中，样本接触具有目标分析物的第一固定抗体和所述目标分析物的第二标记抗体的免疫传感器。在本发明的一些实施方案中，收集样本，例如，全血样本，并且然后通过将包含易感磁微珠的干试剂溶解到样本中来修改样本。正如上文论述的，微珠优选地包含固定在微珠的外表面上的所关注的分析物的抗体。溶解干试剂和夹心形成步骤可以同时进行或以逐步方式进行。所采用的易感磁微珠浓度可以在宽范围上变化。在一些示例性的实施方案中，利用易感磁微珠修改样本以提供每μ L样本至少5 μ g，例如每μ L样本至少IOyg或每μ L样本至少15 μ g的已溶解微珠浓度。干试剂优选地溶解到样本中以提供每μ L样本从约5 μ g至约40 μ g,优选地每μ L样本从约10 μ g至约20 μ g的微珠浓度。根据微珠的尺寸，这对应于每μ L样本至少约IO4个微珠，每μ L样本至少约IO5个微珠或大致每μ L样本从约IO5至约IO6个微珠。因此，在一些优选的实施方案中，微珠以足够的数量存在，以提供每μ L样本至少IO4个微珠,例如,每μ L样本至少约IO5个微珠，或每μ L样本从约IO5至约IO6个微珠的已溶解微珠浓度。一旦完成此步骤，则可能对修改的样本执行免疫测定，例如，电化学免疫测定，以测定分析物的浓度。在本发明优选的实施方案中，对于每个测定使用至少约10，000个微珠。此下限降低计数误差问题，例如对于约1，000个或更少的微珠，约1%或更大。定义上限不太直接且取决于微珠尺寸，但是约10，000, 000个微珠一般是足够的。在某些实施方案中，已溶解微珠容积小于总样本测定容积的约1%，并且优选地小于约 0.1 %。在实际测定步骤中，在优选实施方案中，一旦在易感磁微珠的外表面上固定抗体和信号抗体之间形成夹心，则施加磁场以吸引导管中大致接近电极的微珠。然后将样本冲洗到废料室，同时保留大致接近电极保持的微珠，然后将易感磁微珠上的夹心暴露于能够与酶反应的基质以形成能够进行电化学检测的产物。一种示例性的形式是电化学酶联免疫吸附测定。在本发明的一些实施方案中，可以使用磁化层(例如，微制造的磁层)作为夹心免疫测定方法的基础。例如，在一个实施方案中，本发明涉及一种利用磁免疫传感器来执行免疫测定的方法，其中免疫传感器包括大致平整芯片上的感测电极和芯片上磁化并大致接近电极定位的附加层。此方法包括(a)将涂覆有捕获抗体的易感磁微珠与含有(或疑似含有)分析物的样本以及信号抗体混合，以在微珠上形成夹心；(b)将该混合物施加到免疫传感器，并使微珠的至少一部分通过磁性局部定位和保持在免疫传感器上；(c)从免疫传感器上冲洗样本和未结合的材料，并将夹心的信号抗体暴露于信号生成试剂；以及(d)测量来自电极处的试剂的信号。再者，步骤(a)优选地在导管的第一部分中进行，以及步骤(b)优选地在导管中传感器所在的第二部分中进行。在一些实施方案中，可以优化测定的其他特征(例如，样本类型、使用包含易感磁微珠和信号抗体的干试剂，如本文所描述的)，以便有助于干基质溶解到样本中。B.竞争性免疫测定本发明的实施方案还可应用于利用磁免疫传感器执行竞争性免疫测定的方法。在传统的竞争性测定实施方案中，样本接触包含目标分析物的第一固定抗体和竞争与目标分析物结合的已标记目标分析物的免疫传感器。因为(未标记的)目标分析物与(修改的)已标记目标分析物竞争，所以所产生的信号与样本的原有分析物浓度成反比。在一些此类实施方案中，本发明的方法包括，将涂覆有捕获抗体的易感磁微珠与含有(或疑似含有)分析物和添加标记形式的分析物的样本混合，以允许在易感磁微珠上进行竞争性结合，将该混合物施加到免疫传感器，并使微珠的至少一部分通过磁性局部定位和保持在免疫传感器上；从免疫传感器上冲洗样本和未结合的材料；将已标记分析物暴露于信号生成试剂，并测量来自感测电极处的试剂的信号。c.1-yTAT馨免疮测宙虽然本发明广泛地可应用于免疫测定系统，但是在1-STAT 免疫测定系统(Abbott Point of Care Inc.,Princeton,New Jersey,USA)的环境中得以最好理解，正如本文列述的共同拥有的未决和公布的专利中所描述的。在这些免疫测定系统中，仅捕获样本中存在的小部分分析物。该测定包括通过捕获涂覆(或永久性结合)到传感器(例如，电化学传感器)表面的抗体标记的微粒上的分析物来对血浆或全血中存在的分析物取样。在某些实施方案中，然后以酶标记的第二抗体结合到分析物制成夹心。电化学检测形式确保基本所有酶(例如，碱性磷酸酶(ALP))均被检测到(即，检测效率逼近100%)，这样能够实现高灵敏度测定。但是，通常，由于质量传递限制，抗体标记且正常使用期间易于捕获的微粒区域中的分析物的总量低。因此，捕获更高百分比的分析物同时仍保持检测步骤的高效率将是有利的。如本发明中公开的，可以有利地通过采用分析物捕获步骤期间捕获分布(例如，均匀地分布)在整个样本中但是以保持能够以足够提高的检测效率测量酶的方式通过磁性局部定位于传感器的易感磁微珠试剂来捕获并检测更多分析物。
在某些实施方案中，利用可选地位于容器盒的样本入口印制(sample inletprint)中的干扰减少试剂和/或调节试剂来修改样本,例如,血衆或全血样本。例如,这些试剂可以包含免疫球蛋白、涂覆免疫球蛋白的非易感磁微珠、用于干扰屏蔽的非易感磁微珠试剂和其他稳定剂或调节试剂。有关使用牺牲性微珠减少或消除血液样本中白血球所导致的干扰的描述，参见例如，2009年11月17日提交的美国专利申请号12/620，230和12/620，179，每个专利过引用全部并入本文。还参见美国专利申请号12/411，325，该专利申请通过引用全部并入本文，其描述使用非人IgM和/或IgG或其片段来减少嗜异性抗体导致的干扰。在推入导管后，利用至少两种试剂:主捕获试剂和标记的偶联物试剂修改样本。主捕获试剂包含以适于所关注的分析物的抗体或抗体片段涂覆的易感磁微珠。可以使用Cozzette等的共同拥有的美国专利号5，554，339中描述的方法，将此易感磁微珠试剂印制在例如容放室的壁部或粘附到传感器芯片上游区域中的导管，该专利通过引用全部并入本文。标记的偶联物试剂优选地还包含信号转导成分(例如，ALP)。可在一阶段测定中作为例如可溶解基质将此试剂与主捕获试剂一起印制。在另一个实施方案中，可以按任一种顺序将这两种试剂彼此分开地修改到样本中。为了促进易感磁微珠上夹心的形成，理想的是在导管中振荡或混合修改的样本持续适合的时间段(例如，约I分钟至约20分钟或约5至10分钟)。这使得样本中存在的分析物被捕获在微珠的表面上并被信号发生偶联物试剂标记。在一个实施方案中，在捕获之后，以使易感磁微珠被诱导向传感器通道的顶部迁移与传感器表面相对的方式施加磁场BI,其中这些微珠暂时地保持在传感器表面。可以在后续液体移动时存在微珠抗拒(超出BI的作用)沿着混合方向移动的方式将该表面(即，传感器通道的顶部)图案化。此过程可以通过沿着捕获运动(X轴)的方向低振幅振荡来实现，以便帮助捕获易感磁微珠，而不会夹带已形成的成分或非易感磁微珠。在一个实施方案中，然后将样本移到废料室。但是，在优选的实施方案中，如Davis等的共同拥有的美国专利号7，419，821 (如上文引用)和Miller等的美国专利号7，723，099 (如上文引用)中描述的，通过由空气气囊促动的增压将样本移到锁芯功能件。这些专利中每个专利均通过引用全部并入本文。以使磁场BI能够暂时地将微珠保持在传感器通道的顶部，优选地大致与传感器相对的方式进行易感磁微珠的移动。在此期间，以与美国专利号7，419，821和7，723，099 (如上文引用)中描述的相似的方式冲洗传感器通道。在优选的实施方案中，在冲洗步骤完成之前，将一部分冲洗液体留在传感器通道中，直到如下磁促动步骤完成为止。在本实施方案中，将磁场BI反转到B2，其效果是先前在传感器通道顶部保持位置的微珠现在向沟槽或槽式传感器结构迁移。可以施加沿着捕获混合方向的液体部分的低振幅振荡，以便帮助将微珠沉淀到免疫传感器的沟槽中。在此步骤完成后，将冲洗液体从传感器通道缓慢地引出，并且可选地关闭磁场B2。然后测量由冲洗液体中包含的适合生电基质上结合的标记的作用产生的电活性物质的扩散所引起的电流。(参见例如，美国专利号7，419，821和7，723,099(如上文引用))。如上文描述的，免疫传感器的沟槽或槽式结构旨在帮助捕获易感磁微珠，但仍允许沿着液体移动的方向进行有效的冲洗。但是，也可以使用其他适合的结构。一个示例性的结构包括网格(例如，方格)阵列。在本实施方案中，将微珠保持在阵列上方的能力一般将取决于以使得最高场密度包含在阵列区域界定的区域内的方式聚集磁场的能力。在一些实施方案中，设法捕获大致全部或可靠部分(例如，超过75重量％)的微珠是令人期望的，在此情况中，微珠保持功能件(例如，沟槽)的尺寸是次要的，只要它们提供足够容量以包含微珠即可。作为备选，可以采样固定比例的微珠，在此情况中，必须将捕获功能件的总容量保持恒定。本发明的某些实施方案利用依次地施加两个相对的磁场。在其他实施方案中，可以利用单个施加的场。再者，在一些实施方案中，为酶有限的检测反应提供足够基质的能力可能需要高基质浓度(例如，约20mM)。任选的沟槽或其他保持功能件的数量和尺寸取决于实现有效地捕获样本中存在的分析物所需的易感磁微珠的尺寸和数量。在一些实施方案中，例如，沟槽的长度可以是几千微米，而高度和宽度可以约为几微米。此外，沟槽的一个功能是使微珠能够局部定位和固定，并强化对液体运动移走它们的阻力。在某些实施方案中，沟槽内的微珠是可移动的。在其他实施方案中，在将晶圆切割成个体芯片之后，优选地将每个芯片组装成一次性使用容器盒，以及在本实例中，无沟槽功能件而使用标准免疫传感器。将传感器定位于用于接收样本的导管，其中还将单个高场磁体，例如，永磁体或电磁体，优选为钕铁硼磁体(例如，Nd2Fe14B)定位于传感器中心正下方。使用高场磁体来吸引导管中(例如，大致接近传感器)的易感磁微珠，并在移除样本并冲洗传感器期间，将它们保持在传感器区域中。在优选的实施方案中，将微珠涂覆有样本中或样本中疑似存在的分析物的抗体。图3A-C示出如下专利中描述的类型的基座或容器盒壳体中的传感器芯片或晶粒的三个示例性构造:共同拥有的美国专利号7，419，821和7，723，099 (如上文引用)或美国专利申请号61/288，189 (如上文引用)。传感器晶粒(sensor die)上的椭圆结构对应于定位于导管中的免疫传感器。在每个实施方案中，高场永磁体是圆柱形，其长度为从1_至IOmm,例如，从2mm至5mm,优选地约3mm,以及直径为从0.1mm至5mm,例如，从0.5mm至2mm。在图3A-C中，这些磁体分别具有约1mm、约0.5mm和约0.3mm的直径。将磁体靠近芯片的下侧，该芯片优选地具有从约0.2mm至5mm,例如从0.5mm至2mm或优选为约Imm的厚度。图4是随着磁体直径从Imm减少到0.3mm时磁场线的示意图表示，以及图示场和磁体选择可能如何影响易感磁微珠被吸引并集中在传感器上的区域。图5是芯片表面上捕获的易感磁微珠的显微图，其中具有直径Imm的磁体上午中心定位于免疫传感器周缘上一点的正下方。此构造有助于示出微珠(黑色)、金电极区域(白色)和基座硅材料(灰色)之间的对比。如图5所示，当微珠悬浮物向下通过导管并进入磁体区域以进行捕获时，大部分微珠局部定位于磁体正上方的表面区域上。这些微珠的直径为约3 μ m。通过定位于免疫传感器中心正下方的0.5mm直径高场永磁体执行心肌肌钙蛋白I (cTnl)的免疫测定。不同于上文描述的使用两个磁体的实施方案，在本实施方案中，在始于传感器上游的导管部分中执行微珠夹心形成步骤，以避免过早将微珠局部定位于传感器上。图6包括用于易感磁捕获微珠捕获测定的电化学检测步骤(计时安培分析法)的三个痕量:不含cTnl的血衆；Cliniqa控制级3 ；以及Cliniqa控制级4。这些位图曲线以与商用cTnl容器盒大致相同的方式行进，但是采用针对新液体运动的特殊软件。此特定试验的所有试剂被印制在传感器芯片上。cTnl级别L3和L4分别为约llng/mL和40ng/mL。每个痕量示出作为时间的函数的电极处的电流。电流达到稳态值的上升时间反映传感器的时间常量(TC)，以及平稳值反映样本中的分析物的量。图6中的痕量仅示出检测步骤，完整的测定花费约12分钟，这对于定量医疗点免疫测定来说是可接受的。本发明的实施方案证明在当前装置中使用固定的永磁体能够将微珠(例如，超顺磁性或铁磁微珠)可靠地捕捉到免疫传感器上而不会有微珠的大量结块。此外，共同拥有的美国专利号7，419，821和7，723，099 (如上文引用)或美国专利申请号61/288，189 (如上文引用)中公开的容器盒液体系统提供用于控制样本以便利用试剂修改它并允许有在其通过导管中有磁体的区域之前的反应时间的基础。图7图示根据本发明一个实施方案，在容器盒壳体内将稀土永磁体R21定位于免疫传感器芯片下方，并且图8图示先前引用的美国专利申请号61/288，189 (如上文引用)中描述的类型的可折叠容器盒，其中可以将磁体，例如，稀土永磁体(未不出)定位于免疫传感器芯片204或其他相邻芯片之一的下方。在一些实施方案中，提供一种免疫传感器，其中将磁组件直接集成到传感器制造中，而非作为需要组装到测试装置中的单独元件(例如，成块高场永磁体)。例如，在一个实施方案中，使用共同拥有的美国专利号5，554，339 (如上文引用)中描述的类型的微喷设备(microdispensing apparatus),将与研磨的Nd2Fe14B粉末混合的可光形成的聚乙烯醇(PVA)的混合物印制到晶圆上。印制的区域是直径为约400 μ m的区域。在暴露于UV光和冲洗步骤之后，将粘合的层暴露于约3μπι直径的易感磁微珠的溶液。然后移除该溶液，并以缓冲液冲洗表面。图9是印制的区域的一部分的显微图，其中将相对较小的铁磁(黑色)微珠精确地局部定位于图案化磁层。如图所示，在微珠下方可观察到相对较大且不规则的NdFeB(浅色)颗粒的小区域。图10是图9的装置的显微图和断层横截面。图1lA-C图示在暴露于易感磁微珠之前，图案化PVA和聚酰亚胺薄膜的细节，其具有多种颗粒尺寸的NdFeB(图10Α);聚酰亚胺中研磨的6μηι Magnaquench颗粒(MQP)(图10Β);聚酰亚胺中研磨的6 μ m MQP (图10C)。使用Magnaquench颗粒(MQP)来形成这些类型的层所述Magnaquench颗粒为具有聚酰亚胺中或Shipley光刻胶(SPR)中约6 μ m的平均颗粒尺寸的NdFeB粉末。根据本发明的某些实施方案发现，图9的约3 μ m至约7 μ m厚度的磁薄膜就捕获微珠而言，部分地不如图1lA-C的约30 μ m至约40 μ m厚度有效。图9的实施方案的“捕获半径”为几十微米，而图1lA-C的实施方案的捕获半径为至少200 μ m。在优选的实施方案中，传感器的平均捕获半径小于约500 μ m，例如，小于300 μ m或小于250 μ m。该磁体及其组合物的形状和位置有助力于使用本发明技术的测定的灵敏度和精度。图12A是具有约6μπι的平均颗粒尺寸的MQP NdFeB粉末的显微图。图12Β是通过球磨机粉碎约3天的图12Α的MQP NdFeB粉末的显微图。在一些实施方案中，粉碎的NdFeB粉末提供更均匀的可移动磁组合物，这可以有助于微珠的磁捕获。图13是NdFeB颗粒表面上捕获的微珠的显微图。本领域技术人员将认识到，在研磨工序期间应该注意防止燃烧，例如，添加0.1重量％硫磺或冷却之后才打开研磨容器。图14Α和图14Β示出以印制的聚酰亚胺和NdFeB颗粒基质111部分涂覆的示例性基底免疫传感器电极阵列110，其中保留阵列周缘的一部分暴露。示出的还有基硅晶圆112和用于将阵列连接到仪器电子元件的导电线路113。图15Α和图15Β说明根据本发明的其他实施方案的套印的磁层，其中图15Α是标准微电极阵列，以及图15Β是具有约20 μ m的宽度的单环电极。图16是切开(S卩，断面)的传感器，其图示图15A和图15B的印制的磁层剖面。优选地，高场磁体，例如，永磁体或电磁体应该在几十微米安培计传感器电极表面内，以便加速传感器的时间常量(TC)。此外，优选地将磁体的尺寸设为使得易感磁微珠的吸引对任何潜在的破坏性流动步骤(例如，冲洗)实质性地占优，从而一旦将试剂微珠捕获在免疫传感器表面上时，“有效且永久性地”俘获试剂微珠。虽然不拘泥于原理，但是这相当于永磁体的“视界”的概念。“有效永久性的”捕获是指在颗粒加速度大于任何潜在“破坏性”液体运动(例如，混合振荡和冲洗)的点上，将磁颗粒吸引到磁体。因此，利用显微镜目视观察此现象可以给出任何给定微珠、传感器设计和液体运动的“视界”的实际大略估算。就细化整体测试系统设计以对于不同装置实现捕获基本所有或可靠部分(例如，超过75wt.% )的微珠而言，此信息是有用的。本发明的一种预期用途是大批量(即，每年大于百万)制造一次性测试容器盒，以及每个装置必须在给定批次内可再生产性地执行(即，具有临床上可接受的精度和准确性)。作为示例，在cTnl测定的优选的实施方案中，使用由i_ STAT 免疫测定容器盒形式调适的原型设计,在免疫传感器上方0.5mm高度的导管中振荡IOyL血液样本段。执行此过程4秒周期时间(即，4赫兹)，并等同于每秒约IOcm的最大流动速度。观察到易感磁微珠沿着磁场方向以每秒约10 μ m的速度移动(未示出显微镜、夹具和试剂盒组合)。但是，一旦微珠位于传感器表面的约50 μ m内，则微珠位于“视界”内，并且被捕获在该表面上。这些微珠不再受到振荡的影响(即，颗粒的悬浮物基本可忽略不计)。相似地，本发明一个实施方案的槽式设计(具有特意制造的滞留层)可以有助于在此步骤期间将微珠保持在表面处。不同于其中易感磁微珠始终与液相接触的测定，在本发明的某些实施方案中，导管中样本与冲洗液体之间存在一个或多个居中空气段。(参见例如，美国专利号7，419，821 (如上文引用))。惊人且出乎意料的是，发现在微珠通过传感器上方时，空气段形成的半月形对捕获的微珠提供比微珠持续与液相接触的情况下液体振荡所产生的力更大的剪切力。还发现半月形在传感器表面上方缓慢通过比相对快速地运动更具破坏性。对于优化易感磁微珠相对于传感器的移动，本发明中采用的高场磁体(例如，提供高磁场(例如，大于约0.1特斯拉)的任何材料)是优选的。本领域技术人员将认识到，在冲洗步骤期间将捕获的微珠连贯性且可靠地保持在传感器上是提交准确分析结果所期望的。虽然在传感器上增加沟槽可以是有利的，但是还发现选择适合的场强是重要的参数。试验显示在本发明方法的冲洗步骤期间，大于约75%的微珠保持在表面上。在一个示例性的实施方案中，冲洗液体包含0.1M 二乙醇胺缓冲液(ρΗ9.8)、ImM MgCl2U.0M NaCl、10mM4_ 氨基苯酚磷酸盐和 10 μ M NaI。就优化的测试系统设计来说，高场磁体的尺寸是重要的，因为一般，如果磁体太小，则要么捕获易感磁微珠所需的时间太长，要么冲洗步骤期间的稳定性(即，保持的捕获)将降低测定的性能。此外，如果磁体在传感器平面下太深或与传感器表面保持得太远，则吸引力将降低且更扩散，并且捕获后磁试剂聚集得不好。基于本公开，本领域技术人员将理解如何优化任何给定系统和几何形状(例如，导管中的电极区域和位置)的多种需求。在一些免疫传感器实施方案中，其中将成块高场永磁体定位于接近感测电极或传感器(例如，此免疫感测装置的壳体中)，磁体直径或宽度影响传感器的时间常量(TC)和传感器有效地检测到结合到磁体表面上的磁试剂的信号发生酶标记的程度。考虑到此以及图9和图1lA-C中示出的相对较高形貌(topography)设计,相对于通常期望在大致平整表面上执行晶圆制造处理，开发了图17所示的工序。图17图示根据本发明一个实施方案的蚀刻沟槽工序，其中首先以氢氟酸(HF)，然后以热氢氧化钾(KOH)或三甲基氢氧化铵(TMAH)蚀刻具有光刻胶1302的表面涂层的硅晶圆1301，留下受控尺寸的沟槽1303(例如，从约5μπι至约200μπι的深度和宽度)。然后，将热塑性基质(例如，聚酰亚胺)的可磁化颗粒(例如，NdFeB粉末)的浆料微喷1305或旋转涂覆1306到沟槽中，从而形成与晶圆1301共平面的大致平整的表面。可以进一步处理晶圆1301，如共同拥有的美国专利号7，419，821和7，723，099 (如上文引用)中描述的，以在晶圆上每个蚀刻的沟槽上方提供免疫传感器阵列。图18是使用800 μ mX 1000 μ m掩膜蚀刻到硅晶圆中的示例性底侧沟槽设计的俯视图。图19是底侧沟槽的蚀刻后的横截剖面，其具有至硅晶圆中50-90%的深度。图20A和图20B示出根据本发明一个实施方案的蚀刻的沟槽的不同视图，并且图21示出在聚酰亚胺树脂中填充以NbFeB粉末的沟槽。图22A和图22B是通过INO(Hamilton，Ontario)的反应式离子蚀刻在硅基质上制成的矩形沟槽的显微图。图22A示出沟槽的横截面，而图22B示出聚酰亚胺树脂中填充以NbFeB粉末的沟槽的不同横截面。NbFeB粉末的直径为约6 μ m。在另一个实施方案中，将硅晶圆两侧都抛光，并在一侧上蚀刻沟槽，并在结合剂基质中以磁颗粒材料填充该沟槽。然后，可以在晶圆的另一侧上执行根据美国专利号7，419，821和7，723，099 (如上文引用)的传感器制造工序。此方法具有在原始平整表面上开始传感器工序的电极部分的优点。可以可选地作为整个工序中的最后一个步骤来执行磁区的结合剂基质沉积步骤。P.混合免疫测定在本发明的混合测试实施方案中，可以修改目前的商用cTnl测定(例如，1-STATcTnl试剂盒)以包括单独但是分析上集成的磁捕获免疫传感器。现有技术的传感器覆盖
0.20ng/mL至36.00ng/mL的检测范围，而本发明的磁捕获免疫传感器的某些实施方案覆盖
0.002ng/mL至1.0ng/mL的较低但重叠的范围。图23中示出一个此类实施方案，其中磁区由聚酰亚胺基质中丝网印制的NdFeB粉末线构成。图24中示出另一个实施方案，其中磁区由具有尺寸1.5mmX 100 μ mX40 μ m的成块NdFeB磁体构成。虽然磁体看上去定位于芯片的前侧，但是实际将其定位于背侧，以及图24作为组合旨在示出如何将磁体和电极对齐。图25示出又一个示例性组合的传感器设计，其中芯片上的开口圆是本发明的试剂的潜在印制位置。在多个安培计磁免疫传感器形式的一个实施方案中，执行共同拥有的Miller等的美国专利号7，723，099中公开的背景减法。美国专利号7，723，099通过引用全部并入本文。基于包括参照免疫传感器来实现磁条设计，此方法可选地应用于两种传感器。在示例性的实施方案中，从主要使用磁传感器跨越到标准传感器，从而能够实现宽的分析范围(例如，对于 cTnl,从约 50ng/mL 至约 0.001ng/mL)。在优选的实施方案中，使用重叠范围传感器将包括仪器误差检测软件协议，这样能够检测cTnl传感器信号之间的不一致。例如，在测试样本中存在足够cTnl的情况中，两个传感器都应该产生上升的信号，而在没有cTnl的情况中，两个传感器都应该得到相对较低的安培计信号。操作软件检测到这些条件不成立将指示分析结果不可靠。因此，仪器将抑制报告结果，并代之向用户指示应该使用新容器盒重新执行测试。在又一个实施方案中，试剂盒的稳定和印制模式能够实现快速固化基质。酶偶联物的印制混合物包括但不限于，小于30%固体，以及更优选地为10%或更少固体的蛋白稳定基质中分析物的酶标记的抗体。本发明的印制的磁材料很快固化(即，在少于约7天)。这种相对较快的固化时间具有简化制造工序的优点，其中芯片制造与组装到容器盒中之间的短时延是期望的。IV.振荡磁免疫测定虽然上文的公开一般基于局部定位于免疫传感器的区域中的静态磁场的概念，但是还可设想备选方法，其中使用与免疫传感器相邻的振荡磁场。一种振荡磁场实施方案关键地使用标记的易感磁微珠,该标记的易感磁微珠同时包含标记抗体和酶或荧光标记物或任何其他可检测标记，本文称为“信号部分(signalingmoiety) ”。该标记可以通过本领域中已知的任何方式来检测，包括简单的显微镜或使用免疫感测装置对附着于捕获点的微珠进行反射率测量。此外，该标记可以通过对捕获区域的简单光学强度测量来以光学方式测量或以电化方式，例如通过酶促反应来测量。另外的检测技术尤其包括光学共振器、核磁共振(NMR)、压电体、热电物质、突光、化学发光和表面声波。本发明的另一个实施方案是一种使用施加振荡磁场(例如，相对于免疫传感器表面的电磁体和/或移动固定磁体)的方式通过大致平整表面上的免疫传感器对样本中的分析物执行夹心免疫测定的方法。第一步骤包括将易感磁微珠与疑似包含分析物的样本混合，其中这些微珠涂覆有分析物的抗体和信号发生部分。第二步骤需要使用上文提到的磁方式之一振荡通过涂覆有分析物的第二抗体的免疫传感器的表面的微珠。形成抗体夹心，从而将微珠固定在免疫传感器上。然后从免疫传感器冲洗样本，并检测免疫传感器上的信号部分。本发明的多种实施方案涉及使用磁易感微珠沿着表面的移动来加速免疫测定的信号生成。在一个实施方案中，这些微珠最初位于两个隔开的磁区之间的区域，并且能够在二者之间自由地移动。可以缓慢地开始磁场的振荡，并且在频率上增加该振荡，并迫使易感磁微珠随着场变化前后移动通过表面。通过此运动，能够将微珠捕获在具有针对特定目标分析物的捕获抗体的免疫传感器的捕获区域上的居中空间。在优选的实施方案中，以一种或多种分析物特异的抗体标记这些微珠。图26是振荡珠免疫测定(OBIA)的示意图，其中利用两个相邻磁区位于中心免疫传感器两侧使小微珠在之间移动，以及图27示出根据本发明的一个实施方案的随时间推移的微珠捕获的强化程度。因为通过捕获免疫传感器对特定分析物的特异性将捕获事件局部定位，所以这些免疫测定实施方案能够进行复用，即对多于一种类型的分析物的检测。图28示出复用式0ΒΙΑ，其中存在多种不同类型的分析物捕获微珠，但是其中将它们有效地分隔到它们各自的捕获点(例如，分开的免疫传感器)上。如图28所示，可以将OBIA的形式与针对待测的不同分析物的特定捕获区复用，这些相关捕获区顺序地布置在两个同心磁区域之间。通过设有具有一系列相关分析物捕获点的非相关抗体层，还容易地将参照传感器(未示出)应用于此形式。在本实施方案中，取决于复用式免疫测定试容器内的特定测定的分析考虑，制备其上包含标记抗体的易感磁微珠，并将其按受控比例混合在一起。然后所有标记的易感磁微珠将在穿过每个特定捕获区域的两个磁接触区之间移动。不同的分析物特异性易感磁微珠可以具有相同的标记类型，或更优选地，将具有不同类型的标记。任选地，可以将不同分析物特异性易感磁微珠混合到相同样本中，并允许其反应，然后才通过磁体定位吸引到传感器表面。免疫感测领域中的技术人员将认识到，此测定形式依赖于随着微珠在存在捕获区域两侧上生成的磁场的情况下在表面上穿越时，捕获微珠。因此，传感器信噪比取决于使得表面上的非特异性结合最小，除非特异性捕获抗体已沉积。因此，本发明的一个实施方案的重要特征在于，采用具有不同抗体的免疫传感器对(例如，电极)，其中第二免疫传感器用作参照传感器。这里，将第一对信号中的第一传感器信号减去第二传感器信号。此通用概念公开在共同拥有的美国专利号7，723，099 (如上文引用)中。在本实施方案的另一种变型中，将微珠的振荡保持在捕获区域的一侧一段时间，以允许免疫传感器表面上进行分析物捕获。另一个细化包括参照传感器以确定测定的分析物捕获部分期间生成的非特异性信号的部分。优选地通过围绕管或导管两端的线圈激励磁场，类似于例如NMR匀场的形成。这样允许控制易感磁微珠在接触传感器表面时所经受的力并将非特异性结合减少到最小。这里，线圈具有若干轴以便允许导管中x/y和z运动。在备选的实施方案中可以使用旋转或振荡平台上固定的磁体。实施例参考下文非限制性实施例中阐述的特定实施方案，将更好地理解本发明。实施例1:用于确定肌钙蛋白I (TnI)的免疫测定图29图示用于确定肌钙蛋白I (TnI) 70，心脏损伤的标记的对比安培计免疫测定。在一个实施方案中，将例如血液样本引入到本发明的免疫感测装置的样本容放室中，并通过包含共价连接到多克隆抗肌钙蛋白I抗体(cTnl)的碱性磷酸酶(AP)偶联分子71对其进行修改。此偶联物特异性地结合到血液样本中的TnI70，从而产生由结合到AP-aTnl偶联物72的TnI构成的复合物。利用具有涂覆有TnI抗体的铁磁芯74的聚合物微珠进一步修改血液样本。在连接到容放室的导管中振荡该混合物，这在微珠上形成夹心。定位在导管中的是一个(或多个)传感器芯片，其包括用于监测样本相对于传感器芯片的位置的导电性传感器。可以使用液体的边缘作为标记物主动地控制样本段在导管内的位置。随着样本/空气介面通过导电性传感器，生成精确的信号，该信号可以用作可执行受控液体由其漂移的液体位置标记物。优选地在传感器上以边缘到边缘的方式振荡液体段。将免疫传感器芯片定位于导管中平均振荡位置的下游。将成块磁体76定位于传感器芯片下方，并将易感磁微珠吸引到免疫传感器表面。在当前实施例中，传感器包括安培测定电极，该安培测定电极用于检测来自4-氨基苯酚磷酸盐与酶标记的碱性磷酸酶反应的酶促4-氨基苯酚。该电极优选地由涂覆有光界定的聚酰亚胺层的金表面制成。绝缘聚酰亚胺层中规则间隔的开口界定小金电极的网格，其中按每个分子反应2电子将4氨基苯酚氧化。可以选择如对氨基苯酚物质的基质使得该基质和产物的的半波电位(E1/2)大致不同。优选地，基质的E1/2大致高于(例如，更偏正于)产物的e1/2。当满足此条件时，就能够在存在基质的情况下选择性地以电化方式测量产物。本实施例中，碱性磷酸酶活性的检测依赖于对4-氨基苯酚氧化电流的测量。这在约+60mV的电位处相对于芯片上的Ag/AgCl参考电极来实现。所使用的检测的具体形式取决于传感器配置。4-氨基苯酚磷酸盐的浓度选为过量的，例如，为Km值的10倍。分析溶液是0.1M乙二醇胺和1.0M NaCl，缓冲到9.8的pH。此外，分析溶液包含0.5mM MgCl，这是酶的辅因子。可以作为备选采用碳酸盐缓冲液。在各个实施方案中，选择抗体以结合一种或多种蛋白质，例如，人绒毛膜促性腺激素、肌钙蛋白1、肌钙蛋白T、肌钙蛋白C、肌钙蛋白复合物、肌酸激酶、肌酸激酶亚基M、肌酸激酶亚基B、肌红蛋白、肌球蛋白轻链或其修饰片段。此类修饰片段通过至少一种氨基酸的氧化、还原、缺失、添加或修饰来产生，包括具有天然部分或具有合成部分的化学修饰。优选地，这些生物分子特异性地结合到分析物，并对结合具有约IO7至IO15M-1的亲合常数。还如下制备免疫传感器。将硅晶圆加热氧化以形成厚度约I μ m的绝缘氧化层。将钛/钨层溅镀到该氧化层上以达到约100 A至约1000A的优选厚度,然后溉镀最优选为约800 A厚的金层。然后，将光刻胶旋转涂覆到晶圆上，并使其干燥并烘烤。然后使用接触掩膜曝光表面，并将潜影显影。接下来，将晶圆暴露于金蚀刻剂。将图案化的金层涂覆有光可界定聚酰亚胺，适当地将其烘烤，使用接触掩膜曝光，显影，在O2等离子体中清洗，并优选地在350°C下酰亚胺化约5小时。可执行晶圆背侧的可选金属喷镀以在例如要以恒热方式中使用免疫传感器的实施方案中作为耐热元件。实施例2:磁免疫感测装置和使用方法当前实施例描述一种使用根据本发明一个实施方案的磁免疫感测装置的方法。如图30-33所示，经样本入口 4将未计量的液体样本引入到容器盒的样本室34中。毛细管栓25在此阶段阻止样本通过进入导管11，并以样本填充导管34。封上盖子2以阻止样本从容器盒泄漏。然后将容器盒插入到读数设备，如Zelin的美国专利号5，821，399 (如上文引用)中公开的读数设备，其通过引用全部并入本文。将容器盒插入到读数设备，则当顶住钉子38施压液体容放包装时，激活位于42处刺穿液体容放包装的机构。从而液体排入第二导管，依次达到39、20、12和11处。12处的收缩阻止液体的进一步移动，因为液体流通过第二导管部分11将残余液压分散到废料室44中。在第二步骤中，泵装置的操作对空气气囊43施压，迫使空气经由导管40、经由剖面17和18，在预定位置27处进入导管34。毛细管栓25和位置27界定原始样本的已计量部分。在样本位于样本室34内的同时，任选地利用以最初为样本室的内表面上的干涂层的形式存在的一种或多种化合物(例如，涂覆抗体的易感磁微珠和酶标记的抗体偶联物)修改样本。然后，通过空气气囊43内产生的气压经由毛细管栓排出计量部分的样本。任选地振荡样本，以促进在易感磁微珠上有效地形成夹心。优选地，使用介于约0.2Hz与约5Hz之间的振荡频率，最优选为约0.7Hz。在下一个步骤中，沿着导管向前移动样本，以使易感磁微珠能够被俘获到磁电极的表面上。随后，通过进一步对空气气囊43施压将样本从导管排出，并且样本送到废料室44。冲洗步骤接下来从导管的免疫传感器区域移除非特异性结合的酶偶联物。通过泵装置43移动第二导管中的冲洗液体以与传感器接触。由任何适合的装置在导管内产生一个或多个空气段(半月形)，该装置包括被动装置，其实施方案示出在图34中并且详细描述于美国专利号7，682，833 (如上文引用)；或者主动装置，包括使用泵装置瞬时性地降低导管内的压力，从而经由活页或阀门将空气吸入到导管中。空气段对于从导管15清除样本污染的液体极其有效。通过引入一个或多个空气段大大地提高了清洗传感器区域的效率。空气段的前边缘和/或尾边缘一次或多次地通过传感器上方以清洗可能已从样本沉积的无关材料并使之再次悬浮。无关材料包括特异性地结合的分析物或分析物/抗体-酶偶联物复合物以外的任何材料。但是，根据本发明的各个实施方案，冲洗或清洗步骤不够持久或有力以促进易感磁微珠的大量再次悬浮或特异性结合的分析物或分析物/抗体-酶偶联物复合物从微珠离解。为了测量，将包含酶基质的液体的又一个部分置于免疫传感器上的微珠上，并按适合的工作模式将电流或电位记录为时间的函数。图34图示以被动方式将空气段引入样本液体中的特定装置的构造。在免疫传感器的基座内是凹部140，凹部140包括连接的锥形部141和柱体部142。锥形部与带垫片(图32)中相似直径的孔液体相连，带垫片将组装的免疫传感器容器盒的基座(图33)和封盖(图30和31)隔开。凹部包含吸附材料，当与液体接触时，从导管吸取小量的液体，从而以被动方式将空气段引入到导管中。凹部的容量及其内的材料的数量和类型可以调整以控制引入的空气段的尺寸。特定的吸附材料包括但不限于，玻璃过滤器和层压板，其包含通过蔗糖粘附到60%粘胶雪纺层的3μπι Versapor(I)过滤器(S卩，非编织尼龙支承体上的丙烯酸共聚物膜铸)。实施例3:磁免疫感测装置和使用方法本实施例描述使用容器盒的方法之一。在本实施方案中，容器盒包括位于免疫传感器与废料室之间的可封闭阀。对于cTnl测定，首先将血液样本引入到容器盒的样本室中。在如下的时间序列中，时间O (t = O)表示将容器盒插入到容器盒读数装置中时的时间。时间以分钟计。在t = O和t= 1.5之间，容器盒读数装置经由电触垫与传感器电接触，并执行某些诊断测试。容器盒的插入刺穿锡箔袋，从而将液体引入到第二导管中，正如本文先前描述的。在分析物测定之前，诊断测试使用导电性电极确定导管中是否存在液体或样本，确定电极中是否存在电短路，并确保传感器和地线(例如，参照/计数器)电极优选地热均衡于37°C。在t = 1.5与t = 6.75之间，使用计量部分的样本，优选地介于约4μ L与约200 μ L之间，更优选地介于4 μ L与约20 μ L之间以及最优选地为约7 μ L，以接触传感器。以优选地介于0.2至5.0Hz之间以及最优选为0.7Hz的频率将限定样本前边缘和尾边缘的边缘来回地在导电性传感器区域上移动。在此时间期间，酶抗体偶联物和易感磁微珠溶解在样本内。选择涂覆在导管上的酶抗体偶联物的量以在溶解时得到在样本中优选地高于最高预期的cTnl浓度，以及最优选为6倍高于最高预期cTnl浓度的浓度。在t = 6.75与t = 10.0之间，将样本移到免疫传感器以捕获易感磁微珠。如图30-33所示，经可封闭阀门41将样本移到废料室中，润湿可封闭阀并使之关闭。由阀门41的关闭产生的密封使得第一泵装置能够用于控制液体从导管11到导管15的运动。在阀门41关闭且其余样本被锁闭在后分析导管中之后，分析仪活塞从泵装置的柔性隔膜缩回，在传感器导管中产生部分真空。这迫使分析液体通过带垫片31中的小孔并进入基座13和14中的短交叉导管中。然后进一步抽取分析液体，并且使分析液体的前边缘跨免疫传感器芯片表面振荡，以使样本贴近导管壁剪切。使用芯片上的导电性传感器来控制此过程。
最优地，通过引入一个或多个半月形的液体或空气段进一步提高冲洗的效率。正如先前描述的，可以通过主动或被动装置引入空气段。然后，通过减少施加在叶片6的机械压力产生的部分真空使液体向传感器芯片强制性地移动，导致交叉管附近的传感器通道的“T”区域中填充以分析液体。传感器通道的T区域任选地具有较高的通道高度，从而产生具有较小曲率半径的半月形。离开T区域进一步移向后分析导管，导管高度任选地更小。分析液体被动地从T区域流向此低导管高度区域，从而冲洗导管壁。此被动式渗漏能够使用最小量的液体进一步高效地冲洗T区域且不会使易感磁微珠移位。在本实施方案中，位于第二导管内的液体还包含酶的底物。在其他实施方案中，可以采用在第二导管内使用干式基质修改液体。在将最终液体段定位于传感器上之后，记录传感器响应的测量，并测定分析物的浓度。具体而言，通过在传感器上快速地放置包含酶底物的新鲜液体部分来执行样本的至少一个传感器读数。快速移位同时能够清洗掉先前形成的产物，并为电极提供新基质提。对重复信号取均值以产生更高精度的测量，并且还获得紧随将溶液在免疫传感器上移位之后电流表示的基准的更好统计平均值。实施例4:磁免疫感测装置现在参考图35，其中示出根据本发明一个实施方案的磁免疫传感器容器盒的俯视图。容器盒150包括底部和顶部，优选地由塑料构造。通过薄粘性垫片或柔性薄膜将这两个部分连接。与先前实施方案一样，组装的容器盒包括样本室151，包含所关注的分析物的样本经由样本入口 152引入样本室151。通过毛细管栓152和位于样本室内的预定点的进入点155的组合动作将计量部分的样本经样本导管154 (第一导管)递送到传感器芯片153 (包括集成的磁层)，毛细管栓152优选地由连接容器盒的两个部分的垫片或薄膜中的0.012 "激光切口形成，从而通过泵装置(如样本隔膜156上的叶片按压)的动作引入空气。在免疫传感器上以磁方式捕获微珠之后，将样本移到出口 157,出口 157包含吸附样本的吸附材料，并由此将出口密封而封闭液体或空气的进一步通过。该吸附材料优选地是棉纤维材料、纤维素材料或有孔的其他亲水材料。在当前应用中重要的是，材料具有足够吸附性(即，拥有足够的吸附速度)，使得阀门在与样本隔膜促动装置随后退回相应的时间内封闭，从而不会由此使样本洗回到免疫传感器的区域中。在本发明的特定实施方案中，提供有冲洗导管(第二导管)158，其一端连接到出口 159以及另一端在样本导管上位于出口 157与免疫传感器芯片153之间的点160处连接到样本导管。当将容器盒插入到读数设备时，液体被引入到导管158中。优选地，液体最初存在于锡箔袋161内，当促动装置对锡箔袋施加压力时钉子将锡箔袋刺穿。还提供有短导管162，其经由垫片163中的小开口将液体连接到导管154。第二毛细管栓最初阻止液体达到毛细管栓160，以使液体保持在导管158内。在封闭出口 157之后，促动泵装置，从而在导管154内产生下降的压力。空气出口164优选地包括垫片或膜中的小活页切口，小活页切口摇摆以提供间断性空气流，从而提供空气经由第二出口 165进入导管158的装置。第二出口 165优选地也包括吸附材料，其能够在润湿的情况下封闭出口，这允许在需要时随后按下样本隔膜156可以封闭出口 165。与样本隔膜156促动的同时，经毛细管栓160将液体从导管158吸到导管154中。因为液体流被进气口 164中断，所以引入至少一个空气段(例如，一段或多段的流)。
样本隔膜156的进一步退回将包含至少一个空气段的液体吸回通过传感器芯片153的感测表面。液体内存在空气-液体边界强化了传感器芯片表面的清洗，从而移除剩余的样本。优选地，结合从装在与分析物传感器相邻的传感器芯片内的导电性电极接收的信号来控制样本隔膜156的移动。以此方式，检测液体在传感器上方存在与否，并且可以通过在离散步骤中移动液体来执行多次读数。在此实施方案中，有利的是，在仅薄液体膜涂覆免疫传感器、接地芯片165和导管154管壁中介于传感器与接地电极之间的连续部分上的易感磁微珠时执行分析物测量。通过样本隔膜156的操作回收液体来获得适合的薄膜，直到位于传感器旁边的电导测定传感器指示导管154的该区域中不再有大段液体为止。已发现可以在非常低(nA)电流下执行测量，并且因接地芯片与传感器芯片之间的薄膜的电阻增加(与大段液体相比)导致的电位下降是不显著的。接地芯片165优选地是银/氯化银参考电极，并且有效地兼用作安培计测定测量中的计数器和参考电极。在本发明的此实施方案中，有利的是，避免容易在相对亲水的氯化银表面上形成的空气段，以将接地芯片图案化为穿插以更亲水的区域(如氧化硅的表面)的银/氯化银小区域。因此，优选的接地电极(组合的计数器和参考电极)配置包括密集地布置且穿插以二氧化硅的银/氯化银方块阵列。在银/氯化银区域稍微凹进的情况下避免无意的分段有另一个优点。现在参考图7和图36，其中示出免疫传感器容器盒的优选实施方案的流控的示意图。区域R1-R7表示与特定操作功能关联的导管的特定区域。具体来说，Rl表示样本室；R2表示使得剂量部分的样本由此传递到捕获区域的样本导管，以及其中可选地以涂覆在导管壁上的物质(例如，含有分析物的抗体和抗体偶联物的易感磁微珠)修改样本；R21表示用于混合和样本振荡的区域；R3表不磁捕获区域，其中存放免疫传感器；R4和R5表不任选地用于以涂覆到导管壁上的物质进一步修改液体，从而实现更复杂的测定方案的第一导管的部分；R6表示在将容器盒插入到读数设备中时引入液体的第二导管的部分；R7包括位于毛细管栓160与166 (如图35所示)之间的导管部分，其中能够执行进一步修改；以及R8表示位于点160与出口 157之间的导管154的部分，其中可以进一步用于修改其中包含的液体。实施例5:磁免疫传感器系统本实施例作为系统解决流控和分析物测量的协调。在分析序列中，用户将样本放置到容器盒中，将容器盒放置到分析仪中，并在约I分钟至约20分钟内，执行一种或多种分析物的定量测量。参考图35和图36，下文是分析期间发生的事件序列的非限制性实例。I)在样本入口 167中引入25至50 μ L样本，并填充室151到毛细管栓152，毛细管栓152在将盖子与基座组件固定在一起的粘性带中由0.012"激光切口形成。用户然后密封入口并将容器盒放置到分析仪中。可以在室151的壁部上的干涂层中提供具有所关注的分析物的抗体的易感磁微珠以及任选的标记的偶联物抗体，以便将样本引入其中时它们溶解到样本中。在备选实施方案中，可以在导管154内的干涂层中提供易感磁微珠和标记的偶联物抗体的其中之一或二者兼有。2)分析仪与容器盒接触，并且电动机驱动的活塞压在锡箔袋161上，迫使冲洗/分析液体流出进入中心导管158。
3)单个电动机驱动的活塞接触样本隔膜156，从而沿着样本导管推送测量的样本段(从试剂区域Rl至R2和R21)。通过一个或多个导电性传感器检测样本位置。免疫传感器芯片位于捕获区域R3中。4)在R21区域中以预定且受控的方式由样本隔膜156振荡样本持续受控的时间，以促进分析物结合到易感磁微珠以及结合到抗体偶联物。5)将样本推向容器盒的废料区域(R8)，并且以纤维素或类似吸水性芯子的形式与被动式泵157接触。润湿此芯子的动作将芯子密封而不使空气流动，由此使之丧失疏通样本隔膜156产生的过量压力的能力。主动疏通由此变为图36的“受控式通气”。6)快速排空样本导管(通过从样本隔膜156回收电动机驱动的活塞来实现)，迫使空气(来自出口)与来自第二导管的冲洗/分析液体的混合物移入R5与R4之间的入口中。通过重复样本导管的快速排空，产生一系列空气隔开的液体段，将其朝样本入口推送通过传感器芯片(从R4到R3到R21到R2和Rl)。此过程冲洗没有过量试剂的传感器，并以适于分析的试剂润湿传感器。在某些实施方案中，可以通过在中心冲洗/分析液体导管内的R7和R6中添加试剂来进一步修改锡箔袋中原有的冲洗/分析液体。7)以较低速度将冲洗/分析液体抽向样本入口，以得到保持有易感磁微珠的免疫传感器芯片，其仅包含分析液体薄层。在此点处执行电化学分析。优选的分析方法是安培测定法，但是还使用电位测定法或阻抗检测。8)机构缩回，从而能够从分析仪移除容器盒。虽然本发明是依据各个优选的实施方案来描述的，但是本领域技术人员将认识至IJ，在不背离本发明的精神和范围的前提下可以对此类实施方案进行修改、替代、省略和更改。
权利要求
1.一种磁免疫感测装置，其包括: 大致平整芯片上的感测电极，其中所述电极定位于用于接收与抗体标记的易感磁微珠混合的样本的导管中；以及 所述芯片上集成的高场永磁层，其中所述磁层相对于所述电极定位，从而吸引大致接近所述电极的所述微珠，并在移除未结合的样本和冲洗所述电极期间将所述微珠大致保持在所述电极表面处。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述电极是微制造的。
3.如权利要求1所述的装置，其中所述磁层是微制造的。
4.如权利要求1所述的装置，其中所述样本选自血液、血浆、血清、尿液、间质液以及脑脊液。
5.如权利要求1所述的装置，其中以抗凝剂修改所述样本。
6.如权利要求1所述的装置，其中所述磁层包含钕铁硼(NdFeB)合金。
7.如权利要求1所述的装置，其中所述磁层包含Nd2Fe14B合金。
8.如权利要求1所述的装置，其中所述磁层包含固定化基质中的Nd2Fe14B合金。
9.如权利要求1所述的装置，其中所述磁层包含可光形成聚酰亚胺基质中的Nd2Fe14BI=1-Wl O
10.如权利要求1所述的装置，其中所述磁层包含聚乙烯醇基质中的Nd2Fe14B合金。
11.如权利要求1所述的装置，其中所述磁层提供大于约0.1特斯拉的磁场。
12.如权利要求1所述的装置，其中将所述磁层定位成在所述导管中产生所述电极的区域中最大约200 μ m范围内的视界。
13.如权利要求1所述的装置，其中所述微珠包括铁氧体。
14.如权利要求1所述的装置，其中所述微珠包括磁铁(Fe3O4)。
15.如权利要求1所述的装置，其中所述微珠包括具有聚合物涂层的易感磁芯。
16.如权利要求1所述的装置,其中所述微珠具有从0.01 μ m至20 μ m的平均颗粒尺寸。
17.如权利要求1所述的装置，其中所述微珠具有从0.1 μ m至5 μ m的平均颗粒尺寸。
18.如权利要求1所述的装置，其中所述微珠具有从0.2 μ m至1.5 μ m的平均颗粒尺寸。
19.如权利要求1所述的装置，其中所述微珠从干基质溶解到所述样本中。
20.如权利要求1所述的装置，其中超过50重量％的所述微珠被保持在所述电极表面处。
21.如权利要求1所述的装置，其中超过75重量％的所述微珠被保持在所述电极表面处。
22.如权利要求1所述的装置，其中所述电极是安培测定的。
23.如权利要求1所述的装置，其中所述电极是金微阵列。
24.如权利要求1所述的装置，其中所述导管具有约0.2mm至约5mm的高度和约0.2mm至约5mm的宽度。
25.如权利要求1所述的装置，其中所述导管具有均匀的横截面积。
26.如权利要求1所述的装置，其中所述导管具有非均匀的横截面积。
27.如权利要求1所述的装置，其中所述抗体针对所述样本中的低丰度分析物。
28.如权利要求1所述的装置，其中所述抗体针对选自如下的分析物:心肌肌钙蛋白1、肌钙蛋白T、肌钙蛋白复合物、人绒毛膜促性腺激素、BNP、肌酸激酶、肌酸激酶亚基M、肌酸激酶亚基B、肌酸激酶MB (CK-MB)、proBNP、NT-proBNP、肌红蛋白、肌球蛋白轻链及其修饰片段。
29.如权利要求1所述的装置，其中所述抗体针对选自如下的分析物:β-HCG、TSH、ultra hTSH I1、TT3、TT4、FT3、FT4、髓过氧化物酶、D- 二聚体、CRP、NGAL、PSA、LH、FSH、催乳素、孕酮、雌二醇、DHEA-S, AFP、CA125I1、CA125、CA 15-3, CA 19-9, CA19-9XR、CEA、甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、T-uptake、Tg、抗Tg、抗TP0、铁蛋白、皮质醇、胰岛素、HBsAg、HCVAg/Ab combo、HCV core Ag、抗 HCV、AUSAB (抗 HB)、CORE、CORE-M、SHBG, iPTH、茶碱、雷帕霉素、他克莫司、抗 HAV、抗 HAV IgM, HAVAB, HAVAB-M、HAVAB-M2.0、HAVAB-G, HAVAB2.0、HAVAB2.0 定量、IgM, CMV IgM, CMV IgG,! _2_ 微球蛋白、洋地黄毒甙、HBe、抗 HBe、HBeAg,HIVl/2gO、HIV Ag/Ab combo、睾酮、SCC、维生素 B12、叶酸、梅毒、抗 HBe、风疫 IgG、风疫 IgM、同型半胱氨酸、MP0、巨细胞病毒(CMV) IgG亲合力、弓形虫IgG亲合力、弓形虫IgG、弓形虫IgM、C-肽、维生素 D、HTLV 1/1·1、总illCG、孕酮、estradrogen、催乳素、肌红蛋白、tPSA、fPSA、卡马西平(CBZ)、地高辛、庆大霉素、NAPA、苯妥英、苯巴比妥、丙戊酸、万古霉素、普鲁卡因、奎尼丁、拓普霉素、甲基苯丙胺(METH)、安非他明(AMPH)、巴比妥盐、苯二氮、大麻、可卡因、美沙酮、鸦片制剂、PCP、对乙酰氨基酚、乙醇、水杨酸盐、三环素、holoTc、抗CCP、HbAlc、barbs-U及其修饰片段。
30.如权利要求1所述的装置，其中利用作为至少一个半月形施加的冲洗液体执行所述电极的冲洗。
31.一种大致平整表面上的微制造的磁层，其包括: 高场永磁颗粒，其中所述颗粒散布在以热、化学或可光形成方式固化的固定化基质中；以及 微制造的感测电极。
32.如权利要求31所述的微制造的磁层，其中所述磁颗粒包含钕铁硼(NdFeB)合金。
33.如权利要求31所述的微制造的磁层，其中所述磁颗粒包含Nd2Fe14B合金。
34.如权利要求31所述的微制造的磁层，其中所述磁颗粒具有从0.01 μ m至20 μ m的平均颗粒尺寸。
35.如权利要求31所述的微制造的磁层，其中所述磁颗粒具有从0.Ο μπι至5μπι的平均颗粒尺寸。
36.如权利要求31所述的微制造的磁层，其中所述固化基质包含聚酰亚胺。
37.如权利要求31所述的微制造的磁层，其中所述固定化基质包含聚乙烯醇。
38.如权利要求31所述的微制造的磁层，其中所述磁颗粒提供大于约0.1特斯拉的磁场。
39.如权利要求31所述的微制造的磁层，其中将所述磁层定位成产生所述电极的区域中小于约200 μ m范围内的易感磁微珠的视界。
40.如权利要求31所述的微制造的磁层，其中所述电极是安培测定的。
41.如权利要求31所述的微制造的磁层，其中所述电极是金微阵列。
42.一种利用磁免疫传感器对样本中的分析物执行夹心免疫测定的方法，其中所述免疫传感器包括大致平整芯片上的感测电极和所述芯片上磁化并大致接近所述电极定位的集成的层，所述方法包括: (a)将涂覆有分析物的捕获抗体的易感磁微珠与含所述分析物的样本以及信号抗体混合以在所述微珠上形成夹心； (b)将所述混合物施加到所述免疫传感器； (c)将所述微珠的至少一部分通过磁性局部定位和保持在所述电极上； (d)从所述电极上冲洗未结合的样本； (e)将所述夹心的所述信号抗体暴露于信号生成试剂；以及 (f)测量来自所述电极处的所述试剂的信号。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述电极是微制造的。
44.如权利要求42所述的方法，其中所述磁层是微制造的。
45.如权利要求42所述的方法，其中所述样本选自血液、血浆、血清、尿液、间质液以及脑脊液。
46.如权利要求42所述的方法，其中以抗凝剂修改所述样本。
47.如权利要求42所述的方法，其中所述磁化集成的层包含钕铁硼(NdFeB)合金。
48.如权利要求42所述的方法，其中所述磁化集成的层包含Nd2Fe14B合金。
49.如权利要求42所述的方法，其中所述磁化集成的层包含固定化基质中的Nd2Fe14BI=1-Wl O
50.如权利要求42所述的方法，其中所述磁化集成的层包含可光形成聚酰亚胺基质中的Nd2Fe14B合金。
51.如权利要求42所述的方法，其中所述磁化集成的层包含聚乙烯醇基质中的Nd2Fe14B 合金。
52.如权利要求42所述的方法，其中所述磁化集成的层提供大于约0.1特斯拉的磁场。
53.如权利要求42所述的方法，其中将所述磁化集成的层定位成产生所述电极的区域中最大约200 μ m范围内的视界。
54.如权利要求42所述的方法，其中所述微珠包括铁氧体。
55.如权利要求42所述的方法，其中所述微珠包括磁铁(Fe3O4)15
56.如权利要求42所述的方法，其中所述微珠包括具有聚合物涂层的易感磁芯。
57.如权利要求42所述的方法，其中所述微珠具有从0.01 μ m至20 μ m的平均颗粒尺 寸。
58.如权利要求42所述的方法，其中所述微珠具有从0.14 111至54 111的平均颗粒尺寸。
59.如权利要求42所述的方法，其中所述微珠具有从0.2μπι至1.5μπι的平均颗粒尺寸。
60.如权利要求42所述的方法，其中所述微珠从干基质溶解到所述样本中。
61.如权利要求42所述的方法，其中所述信号抗体从干基质溶解到所述样本中。
62.如权利要求42所述的方法，其中超过50重量％的所述微珠被保持在所述电极表面处。
63.如权利要求42所述的方法，其中超过75重量％的所述微珠被保持在所述电极表面处。
64.如权利要求42所述的方法，其中所述电极是安培测定的。
65.如权利要求42所述的方法，其中所述电极是金微阵列。
66.如权利要求42所述的方法，其中步骤(a)在所述免疫传感器的第一部分中进行，以及步骤(b)在所述免疫传感器的第二部分中进行。
67.如权利要求42所述的方法，其中所述抗体针对所述样本中的低丰度分析物。
68.如权利要求42所述的方法，其中所述抗体针对选自如下的分析物:心肌肌钙蛋白1、肌钙蛋白T、肌钙 蛋白复合物、人绒毛膜促性腺激素、BNP、肌酸激酶、肌酸激酶亚基M、肌酸激酶亚基B、肌酸激酶MB (CK-MB)、proBNP、NT-proBNP、肌红蛋白、肌球蛋白轻链及其修饰片段。
69.如权利要求42所述的方法，其中所述抗体针对选自如下的分析物:β-HCG, TSH、ultra hTSH I1、TT3、TT4、FT3、FT4、髓过氧化物酶、D- 二聚体、CRP、NGAL、PSA、LH、FSH、催乳素、孕酮、雌二醇、DHEA-S, AFP、CA125I1、CA125、CA 15-3, CA 19-9, CA19-9XR、CEA、甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、T-uptake、Tg、抗Tg、抗TP0、铁蛋白、皮质醇、胰岛素、HBsAg、HCV Ag/Abcombo、HCV core Ag、抗 HCV、AUSAB (抗 HB)、CORE、CORE-M, SHBG, iPTH、茶碱、雷帕霉素、他克莫司、抗 HAV、抗 HAV IgM、HAVAB, HAVAB-M、HAVAB-M2.0、HAVAB-G, HAVAB2.0、HAVAB2.0 定量、IgM、CMV IgM、CMV IgG,a _2_ 微球蛋白、洋地黄毒甙、HBe、抗 HBe、HBeAg,HIVl/2gO、HIV Ag/Ab combo、睾酮、SCC、维生素 B12、叶酸、梅毒、抗 HBe、风疫 IgG、风疫 IgM、同型半胱氨酸、MP0、巨细胞病毒(CMV) IgG亲合力、弓形虫IgG亲合力、弓形虫IgG、弓形虫IgM、C-肽、维生素D、HTLV 1/11、总紐CG、孕酮、estradrogen、催乳素、肌红蛋白、tPSA、fPSA、卡马西平(CBZ)、地高辛、庆大霉素、NAPA、苯妥英、苯巴比妥、丙戊酸、万古霉素、普鲁卡因、奎尼丁、拓普霉素、甲基苯丙胺(METH)、安非他明(AMPH)、巴比妥盐、苯二氮、大麻、可卡因、美沙酮、鸦片制剂、PCP、对乙酰氨基酚、乙醇、水杨酸盐、三环素、holoTc、抗CCP、HbAlc、barb s-U及其修饰片段。
70.如权利要求42所述的方法，其中利用作为至少一个半月形施加的冲洗液体执行所述电极的冲洗。
71.如权利要求42所述的方法，所述方法由包括读取器和容纳所述免疫传感器的一次性容器盒的系统执行。
72.—种利用磁免疫传感器对样本中的分析物执行竞争性免疫测定的方法，其中所述免疫传感器包括大致平整芯片上的感测电极和所述芯片上磁化并大致接近所述电极定位的集成的层，所述方法包括: (a)将涂覆有捕获抗体的易感磁微珠与含第一分析物和第二分析物的样本混合，其中所述第二分析物被标记，以允许在所述微珠上进行结合； (b)将所述混合物施加到所述免疫传感器； (c)将所述微珠的至少一部分通过磁性局部定位和保持在所述电极上； (d)从所述电极上冲洗未结合的样本； (e)将所述第二分析物暴露于信号生成试剂；以及 (f)测量来自所述电极处的所述试剂的信号。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述电极是微制造的。
74.如权利要求72所述的方法，其中所述磁层是微制造的。
75.如权利要求72所述的方法，其中所述样本选自血液、血浆、血清、尿液、间质液以及脑脊液。
76.如权利要求72所述的方法，其中以抗凝剂修改所述样本。
77.如权利要求72所述的方法，其中所述磁化集成的层包含钕铁硼(NdFeB)合金。
78.如权利要求72所述的方法，其中所述磁化集成的层包含Nd2Fe14B合金。
79.如权利要求72所述的方法，其中所述磁化集成的层包含固定化基质中的Nd2Fe14BI=1-Wl.
80.如权利要求72所述的方法，其中所述磁化集成的层包含可光形成聚酰亚胺基质中的Nd2Fe14B合金。
81.如权利要求72所述的方法，其中所述磁化集成的层包含聚乙烯醇基质中的Nd2Fe14B 合金。
82.如权利要求72所述的方法，其中所述磁化集成的层提供大于约0.1特斯拉的磁场。
83.如权利要求72所述的方法，其中将所述磁化集成的层定位成产生所述电极的区域中最大约200 μ m范围内的视界。
84.如权利要求72所述的方法，其中所述微珠包括铁氧体。
85.如权利要求72所 述的方法，其中所述微珠包括磁铁(Fe3O4)15
86.如权利要求72所述的方法，其中所述微珠包括具有聚合物涂层的易感磁芯。
87.如权利要求72所述的方法，其中所述微珠具有从0.01 μ m至20 μ m的平均颗粒尺寸.
88.如权利要求72所述的方法，其中所述微珠具有从0.Ιμπι至5μπι的平均颗粒尺寸。
89.如权利要求72所述的方法，其中所述微珠具有从0.2μπι至1.5μπι的平均颗粒尺寸。
90.如权利要求72所述的方法，其中所述微珠从干基质溶解到所述样本中。
91.如权利要求72所述的方法，其中所述信号抗体从干基质溶解到所述样本中。
92.如权利要求72所述的方法，其中所述第一分析物在一种或多种可溶解干试剂涂层中。
93.如权利要求72所述的方法，其中超过50重量％的所述微珠被保持在所述电极表面处。
94.如权利要求72所述的方法，其中超过75重量％的所述微珠被保持在所述电极表面处。
95.如权利要求72所述的方法，其中所述电极是安培测定的。
96.如权利要求72所述的方法，其中所述电极是金微阵列。
97.如权利要求72所述的方法，其中步骤(a)在所述免疫传感器的第一部分中进行，以及步骤(b)在所述免疫传感器的第二部分中进行。
98.如权利要求72所述的方法，其中所述抗体针对所述样本中的低丰度分析物。
99.如权利要求72所述的方法，其中所述抗体针对选自如下的分析物:心肌肌钙蛋白.1、肌钙蛋白T、肌钙蛋白复合物、人绒毛膜促性腺激素、BNP、肌酸激酶、肌酸激酶亚基M、肌酸激酶亚基B、肌酸激酶MB (CK-MB)、proBNP、NT-proBNP、肌红蛋白、肌球蛋白轻链及其修饰片段。
100.如权利要求72所述的方法，其中所述抗体针对选自如下的分析物:β-HCG, TSH、ultra hTSH 11、TT3、TT4、FT3、FT4、髓过氧化物酶、D- 二聚体、CRP、NGAL、PSA、LH、FSH、催乳素、孕酮、雌二醇、DHEA-S, AFP、CA125I1、CA125、CA 15-3, CA 19-9, CA19-9XR、CEA、甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、T-uptake、Tg、抗Tg、抗TPO、铁蛋白、皮质醇、胰岛素、HBsAg、HCV Ag/Ab combo、HCV core Ag、抗 HCV、AUSAB (抗 HB)、CORE、CORE-M、SHBG、iPTH、茶碱、雷帕霉素、他克莫司、抗 HAV、抗 HAV IgM, HAVAB, HAVAB-M、HAVAB-M2.0、HAVAB-G, HAVAB2.0、HAVAB2.0 定量、IgM, CMV IgM, CMV IgG,a _2_ 微球蛋白、洋地黄毒甙、HBe、抗 HBe、HBeAg,HIVl/2gO、HIV Ag/Ab combo、睾酮、SCC、维生素 B12、叶酸、梅毒、抗 HBe、风疫 IgG、风疫 IgM、同型半胱氨酸、MP0、巨细胞病毒(CMV) IgG亲合力、弓形虫IgG亲合力、弓形虫IgG、弓形虫IgM、C-肽、维生素 D、HTLV 1/11、总AhC.’G、孕酮、estradrogen、催乳素、肌红蛋白、tPSA、fPSA、卡马西平(CBZ)、地高辛、庆大霉素、NAPA、苯妥英、苯巴比妥、丙戊酸、万古霉素、普鲁卡因、奎尼丁、拓普霉素、甲基苯丙胺(METH)、安非他明(AMPH)、巴比妥盐、苯二氮、大麻、可卡因、美沙酮、鸦片制剂、PCP、对乙酰氨基酚、乙醇、水杨酸盐、三环素、holoTc、抗CCP、HbAlc、barbs-U及其修 饰片段。
101.如权利要求72所述的方法，其中利用作为至少一个半月形施加的冲洗液体执行所述电极的冲洗。
102.如权利要求72所述的方法，其中所述第二分析物在一种或多种可溶解干试剂涂层中。
103.如权利要求72所述的方法，其中所述第二分析物以选自如下的标记进行标记:放射性同位素标记、酶、发色团、荧光团、化学发光物、离子载体以及电活性物质。
104.如权利要求72所述的方法，其中所述标记的分析物以选自如下的标记进行标记:荧光素、二茂铁以及对氨基苯酚。
105.如权利要求72所述的方法，所述方法由包括读取器和容纳所述免疫传感器的一次性容器盒的系统执行。
全文摘要
本发明提供用于通过传感器上并入磁捕获微珠的免疫测定快速测定液体样本中的分析物的设备和方法，所述设备和方法能够在医疗点诊断现场使用。
文档编号G01N33/543GK103154739SQ201180048048
公开日2013年6月12日 申请日期2011年8月5日 优先权日2010年8月5日
发明者C·J·米勒, 胡景华 申请人:雅培医护站股份有限公司