组织学样品中单个靶标分子的定量的制作方法

专利名称：组织学样品中单个靶标分子的定量的制作方法
技术领域：
本发明属于使用免疫化学手段来对样品中的固定靶标进行可视化和定量的领域。具体而言，本发明涉及对免疫染色的组织学样品中的分子靶标进行定量的方法和试剂，以及所述方法和试剂在医学诊断中的用途。
背景技术：
在免疫组织化学即IHC的领域中，通常使用酶法产生的染料对感兴趣的生物靶标进行染色。然而，大多数现今的IHC酶体系由于受限的灵敏度而对靶标可视化具有有限可用性:如果靶标具有很低的丰度，则无法检测出沉积的染料的量。同样地，存在检测上限，在该检测上限之上时，进一步的染料沉积不会引起可检测的更强烈的染色。使用较低浓度的试剂，检测上限可以折衷以允许高丰度靶标与很高丰度靶标之间的区别；然而，这也会引起检测下限的增加，即检测灵敏度的丧失。因此，大多数现今的体系具有有限的检测动态范围。此外，来自相同或不同供应商的不同可视化体系之间的灵敏度差异使得难以比较染色结果。由于染料沉积不是靶标浓度的线性函数，因此对免疫化学染色的靶标的定量是另一挑战。在检测限的基线附近，强度作为靶标浓度的直接函数迅速增加(从没有可检测的信号变化到信号，甚至具有低强度的信号，表示无限的增加)。相反，接近检测上限时，甚至靶标浓度的大量增加也几乎不引起已经很强的信号的可察觉的增加。另一困难来自于以下事实，即没有国际公认的标准品存在，并且难以制备不变的参考样品。即使同一组织样品的连续切片也通常表现出生物变异。永生细胞系原则上可以提供无限的参考材料，然而在这种情况下培养条件、细胞循环周期和生物变异的不同也将引起靶标表达的某些批次间差异。用肽或蛋白质化学修饰的载玻片可以用作替代靶标，然而与组织样品的比较不直接。因此，需要生物样品中固定靶标的标准化定量检测。近来描述的一种对生物样品(包括组织学样品)中单个单元的固定靶标进行免疫化学染色的方法(PCT/DK2010/000137)提供了一种可视化体系，特征在于极度的灵敏度(即，可以使单个分子可视化并对其进行检测)以及靶标表达的整个动态范围内的沉积染料量与靶标表达的线性相关。本发明利用PCT/DK2010/000137体系的可视化潜力，并提供用于精确定量样品(具体是生物样品)中固定靶标的方法，包括对特定靶标分子的绝对数量的评估。

发明内容
本发明涉及对其中靶标固定的样品(例如，组织学样品)中的靶标(例如，分子靶标)进行定量的方法，执行该方法的试剂，利用该方法和试剂的检定，以及该方法和检定在医学诊断和治疗中的应用。本发明的一个方面涉及用于对样品中存在的靶标进行定量的方法，其中所述靶标是固定的，该方法包括(a)将包括靶标的单独单元的群体的样品与一种或多种结合剂孵育，其中(i)至少一种结合剂能够与靶标的单个单独单元特异结合，且(ii)至少一种结合剂包括酶，且(ill) (i)或(ii)的至少一种结合剂对其在样品中的结合配偶体的结合亲和性是已知的，从而形成具有祀标的单独单个单元的部分子群(sub-population)的一个或多个离散的单个靶标部位(target site)，其中各个离散的单个靶标部位包括单独单个单元的所述部分子群的一个单独单元以及一种或多种结合剂的复合物，其中至少一种结合剂包括酶；(b)使包括酶的离散的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点；(c)对视觉上明显的点进行定量，评估样品中靶标的量。在不同的实施方式中，可以由样品中存在的靶标的单个单独单元的大部分或小部分形成靶标部位。本发明的另一个方面涉及一种用于对样品中存在的靶标进行定量的方法，其中所述靶标是固定的，包括(a)将包括靶标的单独单元的群体的样品与一种或多种结合剂孵育，其中( i )至少一种结合剂能够与靶标的单个单独单元特异结合，且(ii)至少一种结合剂包括酶，从而形成具有靶标的单独单个单元的预定部分子群的一个或多个离散的单个靶标部位，其中各个离散的单个靶标部位包括包括单独单个单元的所述部分子群的一个单独单元以及一种或多种结合剂的复合物，其中至少一种结合剂包括酶；(b)使包括酶的离散的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点；(c)对视觉上明显的点进行定量，(d)评估样品中靶标的量。在一些实施方式中，后一方法可以包括以下步骤:(a)将样品与第一结合剂孵育，其中(i)所述第一结合剂能够与靶标的单个单独单元特异结合并使样品中的所有结合位点(binding site)基本上饱和；且(ii)预定部分的所述第一结合剂包括酶，从而形成离散的单个靶标部位，各个靶标部位包括靶标的单个单独单元和结合齐U，其中一部分的所述离散的单个靶标部位包括含有酶的第一结合剂；(b)使包括酶的离散的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点；(c)对视觉上明显的点进行定量，(d)评估样品中靶标的含量。在其它实施方式中，方法可以包括以下步骤:
(a)将样品与第一和第二结合剂孵育，其中(i)第一结合剂能够与靶标的单个单独单元特异结合并使样品中的所有结合位点基本上饱和；且(ii)第二结合剂能够与第一结合剂特异结合且预定部分的所述第二结合剂包括酶，从而形成离散的单个靶标部位，各个靶标部位包括靶标的单个单独单元、第一结合剂和第二结合剂，其中一部分所述离散的单个靶标部位包括含有酶的结合剂；(b)使包括酶的离散的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点；(c)对视觉上明显的点进行定量，( d )评估样品中靶标的量。可以根据近来描述的对样品中固定靶标的单个单独单元进行可视化的方法(参见PCT/DK2010/000137)或如本文中所描述地进行对本发明的离散靶标部位的可视化。本发明的可视化方法允许识别靶标的基本上每个单个单元，并由此可以确定靶标在样品中的绝对或相对量。靶标的绝对和相对量可以确定为样品中单个靶标单元的总数量或相对于一些标记物的数量。这些方法可以适用于任何包括靶标的样品，该靶标可由对该靶标具有亲和性的结合剂检测出，其中靶标是固定在固体支承物中/上。因此，通过本发明的方法能够检测并精确定量几乎任何固定的靶标，例如分子、颗粒或微生物。通过使用特定的靶标可视化技术并使用限定明确的用于靶标检测的结合剂(两者的具体信息在下文中说明)来在本发明方法中保证靶标的精确定量。本发明的方法特别有利于复杂组织学样品中靶标的精确定量，例如，用于诊断或治疗靶标例如生长因子受体例如Her2等的定量，因此，它们在诊断和治疗应用中的效用不能被过高估计。这些方法对手动和自动评估样品中靶标的精确量的适用性可以作为这些方法的额外有价值的特征进行描述。用于本发明中的可视化体系还允许使同一样品中两种或更多种不同靶标可视化(详情参见W02011047680)，因此，可以使用本发明的方法来进行一个样品中两种或更多种革巴标的绝对或相对定量。此外，本发明的方法可用于允许使组织学和其它样品中固定靶标的单个单元可视化的任何体系，其中所述体系包括使用对样品中结合配偶体具有特异亲和性的结合剂的步骤。在本发明的方法中，可有利的是使用由可用于样品中固定靶标单元的可视化的试剂构成的试剂盒，具体地本发明涉及包括能够与结合配偶体特异结合的结合剂的试剂盒，其中预定部分的所述结合剂包括酶。本发明试剂盒的一些非限制性实施方式包括作为特异结合对成员的结合剂，例如，抗体或核酸；结合配偶体，其为样品中的靶标；结合配偶体，其为另一结合剂，例如，其中另一结合剂为能够与样品中靶标结合的结合剂；靶标，其为生物或化学靶标分子、颗粒、分子或细胞复合物、分子或细胞结构、病毒或微生物、或所述靶标分子、颗粒、复合物、结构、病毒或微生物的片段；酶，其为具有氧化还原酶活性的酶，例如具有过氧化物酶或酚氧化酶活性的酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)等。在一个实施方式中，本发明的试剂盒可以包括参考样品，其中靶标的单个单元的量是预定的，例如，表达特定蛋白的参考细胞系，其中蛋白分子的数量是预定的。在一个方面，本发明涉及一种用于在个体中诊断或预测疾病、或用于预测治疗处理的效力的方法，包括根据本发明方法在从所述个体得到的样品中对与所述疾病或所述治疗处理相关的生物标记物的量进行评估的步骤。诊断和治疗应用可以包括，但不限于，对作为疾病生物标记物的分子靶标进行检测和定量，例如，得知不同生长因子受体例如Her2FGFR等的水平已经显示出对癌症的诊断和治疗是重要的，且对治疗处理的特定疗程进行确定在如今越来越基于疾病生物标记物定
量的结果。


图1示出根据传统HRP-DAB法(B)和根据本发明(A)的组织学片子的示例性染色。图2示出在靶标部位处形成视觉上明显的点的示意图。图3示出根据本发明可视化方法的Her阳性细胞的免疫染色结果:
a.0+Herceptest对照细胞系的IOX图像的单色分割，每个图像识别21个点(黑色)；
b.1+Herceptest对照细胞系的IOX图像的单色分害I]，每个图像识别36个点(黑色)；
c.3+Herceptest对照细胞系的IOX图像的单色分割,每个图像识别2567个点(黑色);d.乳房癌的IOX图像的双色分割，点为白，核为黑，背景为灰；e.3+Herc印test对照细胞系的IOX图像的双色分割，点为黑，核为白，背景为灰(与c相同的样品)。图4 7是相应于实验12.1、12.3a、12.3b和12.3c的表I 4的结果的图示(详情参见相应描述)。
具体实施例方式基本而言，本发明涉及包括对样品中存在的靶标进行检测、可视化和定量的方法，其中靶标是固定的。具体而言，本发明涉及在生物样品中对单个分子靶标进行可视化及其定量的方法，然而，本发明的方法并不限制于生物样品或分子靶标，其可从以下讨论中明显得出。本发明的一个方面涉及一种用于对样品中存在的靶标进行定量的方法，其中所述靶标是固定的，包括(a)将包括靶标的单独单元的群体的样品与一种或多种结合剂孵育，其中(i)至少一种结合剂能够与靶标的单个单独单元特异结合，并且(ii)至少一种结合剂包括酶，并且(ill) (i)或(ii)的至少一种结合剂对其在样品中的结合配偶体的结合亲和性是已知的，从而形成具有靶标的单独单个单元的部分子群的一个或多个离散的单个靶标部位，其中各个离散的单个靶标部位包括靶标的一个单独单元以及一种或多种结合剂的复合物，其中至少一种结合剂包括酶；(b)使离散的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点；(c)对视觉上明显的点进行定量，
( d )评估革巴标的量。在不同的实施方式中，靶标部位可以形成为具有样品中存在的靶标的单个单独单兀的大部分或小部分。本发明的另一个方面涉及一种用于对样品中存在的靶标进行定量的方法，其中所述靶标是固定的，包括(a)将包括靶标的单独单元的群体的样品与一种或多种结合剂孵育，其中( i )至少一种结合剂能够与靶标的单个单独单元特异结合，且(ii)至少一种结合剂包括酶，从而形成具有靶标的单独单个单元的预定部分子群的一个或多个离散的单个靶标部位，其中各个离散的单个靶标部位包括单独单个单元的所述部分子群的一个单独单元以及一种或多种结合剂的复合物，其中至少一种结合剂包括酶；(b)使包括酶的离散的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点；(c)对视觉上明显的点进行定量，(d)评估样品中靶标的量。在一些实施方式中，后一方法可以包括以下步骤:(a)将样品与第一结合剂孵育，其中(i)所述第一结合剂能够与靶标的单个单独单元特异结合并使样品中的所有结合位点基本上饱和；且(ii)预定部分的所述第一结合剂包括酶，从而形成离散的单个靶标部位，各个靶标部位包括靶标的单个单独单元和结合齐U，其中一部分所述离散的单个靶标部位包括含有酶的第一结合剂；(b)使包括酶的离散的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点；(c)对视觉上明显的点进行定量，( d )评估样品中靶标的量。在其它实施方式中，方法可以包括以下步骤:(a)将样品与第一和第二结合剂孵育，其中(i)第一结合剂能够与靶标的单个单独单元特异结合并使样品中的所有结合位点基本上饱和；且(ii)第二结合剂能够与第一结合剂特异结合且预定部分的所述第二结合剂包括酶，从而形成离散的单个靶标部位，各个靶标部位包括靶标的单个单独单元、第一结合剂和第二结合剂，其中一部分所述离散的单个靶标部位包括含有酶的结合剂；(b)使包括酶的离散的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点；(c)对视觉上明显的点进行定量，(d)评估样品中靶标的含量。使用本发明的任何方法，在不同的优选实施方式中，靶标的量可以评估为样品中靶标的部分量(与样品中单独单个靶标单元的部分子群相应)；评估为样品中靶标的总量(或单独单个祀标单元的总量)(在本文中也称为“绝对量”)；评估为祀标的相对量(祀标或靶标的单个单元相对于另一靶标、参考标记物等的相对量)。根据本发明，可以手动评估根据本发明染色的样品中的靶标的量，S卩，可以通过观测者使用可得的显微镜来对点进行计数。在其它实施方式中，可以使用可得的本领域软件来自动采集和处理染色样品的图像。在实施例部分中描述染色样品的处理的一些非限制性实例。在一个实施方式中，可以使用本发明的试剂盒对样品中的靶标进行可视化并对靶标量进行评估。包括对样品中固定靶标进行定量的部件的试剂盒是本发明的另一方面。具体而言，在一个实施方式中，本发明的试剂盒可以包括作为结合分子混合物的结合剂，其中预定部分的所述结合分子标记有酶。在其它实施方式中，本发明的试剂盒可以包括权利要求中包括的任何试剂且任选地包括使用说明。在一个实施方式中，本发明的试剂盒可以包括参考样品，其中靶标的单个单元的量是预定的，例如，表达特定蛋白质的参考细胞系，其中蛋白分子的数量是预定的。本发明的一个方面是用于诊断或预测疾病、或用于预测治疗处理在个体中的效力的方法，其中所述方法包括根据本发明的方法在从所述个体得到的样品中对与所述疾病或所述治疗处理相关的生物标记物的量进行评估的步骤。因此，本发明的试剂盒可以用作为诊断试剂盒的一部分。诊断和治疗应用可以包括但不限于对作为疾病的生物标记物的分子靶标进行检测和定量，例如，得知不同生长因子受体例如Her2FGFR等的水平已经显示出对于癌症的诊断和治疗是重要的，并且现在对治疗处理的特定疗程的确定越来越基于疾病生物标记物定量的结果。因此，本发明的试剂盒可以包括说明，其教导使用者如何将根据本发明的方法在样品中确定的生物标记物的量与相关疾病的诊断、预测或治疗相关联。在以下以及实施例部分中详细讨论本发明的以上和其它方面以及非限制性实施方式。术语“样品”是指来自较大的整体或群组的代表性部分或单一项、推测含有将要检测的靶标的物质或对象的量或部分，例如，包括将要分析的靶标分子、颗粒、结构的生物、化学、环境材料的部分或量，例如活检样品、食物样品、土壤样品等。典型的样品显示出物质或对象的剩余部分是什么或应该是什么等。在一个实施方式中，本发明的样品可以是环境样品，例如土壤样品或泄漏物(spillage)样品。在另一实施方式中，样品可以是食物样品。在另一实施方式中，样品可以是有机分子库的一部分。在另一实施方式中，样品可以是战争样品。在一个优选的实施方式中，本发明的样品是生物样品。生物样品可以是:1.包括悬浮细胞和/或细胞碎片的样品，例如，血液样品、克隆细胞的悬浮液、身体组织匀浆等；2.包括完整或损坏的动物体细胞、体组织、涂片或流体的样品，或肿瘤样品，例如活检样品；其可以是新鲜的组织样品或保藏的组织样品，例如福尔马林固定石蜡包埋的组织样品；3.包括活有机体的样品，例如包括动物、植物、细菌、真菌等的介质的样品；4.包括病毒颗粒、其碎片、或病毒产物的样品，例如包括病毒核酸、蛋白质、肽等的体涂片；5.包括细胞器的样品；6.包括天然或重组生物分子的样品，例如血浆样品、条件细胞培养介质等；7.包括植物细胞或其碎片的样品。生物样品的上述实施方式是示例性的且用于说明的目的，但不是本发明的限制。化学样品的实例可以通过化学化合物库(例如，肽库)的样品来示例说明，但是不限制于这些样品。环境样品的实例可以通过土壤、水或空气样品和食物样品来示例说明，但是不限于这些样品。本发明涉及包括固定靶标的样品(例如，上述中的任何一个)，即涉及在本发明的检测过程中不能自由移动的靶标的样品，例如，经机械或化学手段基本上降低或消除靶标移动的样品，例如在样品或靶标附着某些支承物或介质或在某些支承物或介质内的情况下。因此，在一个实施方式中包括感兴趣靶标的单个单独单元的样品可以在检测过程之前固定到固体支承物上，例如，固定到载玻片上的固体体组织样品。本发明的包括固定靶标的样品实例包括但不限于固定在玻璃片或塑料片上的体组织样品、或包括固定到膜或ELISA板等上的生物或化学分子的样品。这些实施方式中的样品靶标可以固定在样品内，例如固定在组织样品内的蛋白质，或可以固定在某些材料表面上或某些材料内，例如固体材料或凝胶的一部分，例如硝化纤维膜等。在一个实施方式中，固体支承物可以是三维结构，例如胶原或琼脂块。在该实施方式中，靶标，例如分子或颗粒，可以固定在该结构内。在一个实施方式中，本发明涉及不包括靶标的样品，例如，对照样品。在另一实施方式中，本发明涉及推定包括靶标的样品，例如具有未知内容物的样品。上述的术语“固体支承物”是指一片任意材料，其在根据本发明的过程条件下不溶，例如，其可以是硝化纤维膜、载玻片等。适用于固定样品和/或靶标的支承物的实例包括但不限于合成的聚合物支承物，例如聚苯乙烯、聚丙烯、取代的聚苯乙烯，例如胺化或羧化的聚苯乙烯；聚丙烯酰胺；聚酰胺；聚氯乙烯；玻璃；琼脂糖；硝化纤维；尼龙；聚偏氟乙烯；表面改性的尼龙等。本发明涉及在本文描述的条件下为化学惰性的固体支承物，即所选的支承物可对该方法的检测结果不具有任何主要影响。相应地，可以选择配合所选的检定形式例如IHC、ELISA、印迹等的适用于固定样品或靶标的任何惰性支承物。麵术语“靶标”在本文中是指推定存在于样品中且特征可在于特定物理和/或功能特征的感兴趣对象。应该理解，在本发明的上下文中，术语“靶标”涉及该对象的基本上相同实体的整个池，而不是样品中该对象的单个实体；在通过仅有的单个单元表示靶标的样品中，该仅有的单个靶标单元将被理解为整个靶标和样品中靶标的量。本文的术语“基本上相同”是指样品中靶标的总池的所有或几乎所有单个实体具有一个或多个使得它们被识别为靶标的特征。例如，靶标可以是特定的蛋白质，包括样品中该特定蛋白质的所有分子；本发明靶标的另一实例可以是特定的分子复合物或结构，包括含有该特定的分子复合物或分子结构的样品的基本上所有对象；本发明靶标的另一个实例可以是病毒颗粒或细菌，其中样品中该病毒颗粒或该细菌的总群是靶标。与作为特定细胞类型、组织、细胞结构、生理条件等的特征的特点相关的生物对象，例如分子、分子复合物、结构、颗粒或有机体经常被称为该特定细胞类型、组织、细胞结构或生理条件的“生物标记物”。这些生物标记物的非限制性实例包括但不限于特定的核苷酸序列、蛋白质或其它生物分子，例如碳水化合物或脂质、染色体或膜结构、病毒、细菌、微生物等。在本发明的一些实施方式中，术语“靶标”与术语“生物标记物”互换使用，并涉及作为特定细胞类型、组织、生理条件等的特征的分子、分子复合物、结构或颗粒，其中测试样品中的任何在后生物标记物的总群被认为是靶标。在一个实施方式中，靶标可以是蛋白质，例如细胞膜受体或细胞质蛋白质，在另一实施方式中，靶标可以是核酸，例如细胞质核酸。在本发明一些实施方式中，任何在后提及的靶标的衍生物，例如靶标蛋白或核酸的片段、前体、突变体等也可以是的靶标。因此，在本发明的不同实施方式中，靶标可以是生物或化学靶标分子、或颗粒、或分子或细胞复合物、或分子或细胞结构、或病毒、或微生物、或所述靶标分子、颗粒、复合物、结构、病毒或微生物的片段。在化学和环境样品中包含的靶标中，样品可以是不同的污染物、毒素、战争物质、分子库成员、工业无毒废化合物等。具体地，本发明涉及可以在样品中通过多个独立的基本上相同的单元表示的靶标，具体地，本发明涉及祀标的单个单独单元。术语“单元”是指在计算中视为整体的单个量的靶标，并用于执行一个特定的功能。术语“单独”是指单元可与相同种类的其它单元或环境中的其它组分(通过功能的物理特征)分开，并且可以单独考虑和计数。术语“单独单元”与术语“单个单元”互换使用。本文中的术语“单个”是指由单独的整体构成的、由数量上仅一个构成的、由与很多相对或相反的一个构成的靶标单元。例如，靶标蛋白的单个/单独单元是指靶标蛋白的单个单独蛋白分子，即多个相同种类分子中的一个分子。术语“基本上相同的单元”是指，靶标的多个单个单元具有一个或多个使这些单元被认为是靶标的特征。术语“独立的”是指靶标的单个单元以明显的实体存在，并不依赖于样品中相同种类的其它明显实体的存在。在一些实施方式中，本发明涉及作为分子的单个部分的单个单元。术语“分子的单个部分”是指分子的一部分，其具有使得分子的该部分被认为是与相同分子的其它部分分开的特定特性，例如靶标蛋白的蛋白水解部分、融合蛋白的一部分、靶标蛋白的特定结构域、核酸的特定结构、表位等。因此，在一个实施方式中，本发明可以涉及作为单个单独靶标分子的靶标的单个/单独单元，即涉及存在于样品中的多个单个单独靶标分子，在另一个实施方式中，本发明可以涉及作为分子的单个单独部分的靶标的单个/单独单元，例如，存在于样品的多个靶标分子中的特定分子结构，例如，表位。在另一实施方式中，本发明可以涉及构成样品中存在的病毒颗粒池的多个单个单独病毒颗粒。在不同的实施方式中，可以通过单个单独生物或化学分子、单个单独单个颗粒、单个单独分子或细胞复合物、单个单独分子或细胞结构、或单个单独病毒或单个单独微生物、或所述分子、颗粒、复合物、结构、病毒或微生物的单个单独片段来表示靶标的多个单个单
J Li ο在一个优选的实施方式中，靶标是与癌症相关的生物标记物，例如核酸、激素的多肽、生长因子及其受体、细胞粘合分子、信号转导分子、细胞周期调控分子等，例如包括生长因子TOGF、VEGF, TGF、HGF或EGF、其受体和通路相关的分子的群组的基因、RNA和蛋白质，与信号转导通路例如JAK/STAT通路或Aktl/PKB细胞存活通路或5-FU通路相关的基因及其产物，雌激素受体ER及其基因(ERSl)等。本发明的方法允许对所述生物标记物进行简单且快速的可视化和定量。本发明的方法允许对以较宽动态范围存在于样品中的靶标的单个单独单元进行可视化和定量。很高量和很低量的靶标均能在同一个样品中进行可视化和定量，或者它们可以在单独的样品中进行评估。两种或更多种不同靶标可以在一个或同一样品中进行可视化，例如，蛋白靶标和核酸靶标，或两种或更多种不同的蛋白靶标，或两种或更多种不同的核酸靶标等。在一个实施方式中，靶标的单个单元可以基本上均匀地分布在样品中，在其它实施方式中，靶标的单个单元可以在样品的一个部分中更大量地存在而在其其它部分中少量地存在。在所有在后实施方式中，可以使用本发明的方法在同一个样品中对靶标的单个单元进行可视化和定量。在一些实施方式中，其中单个靶标单元与感兴趣的另一靶标相关，例如，以特定的分子缔合或结构存在，其中所述特定分子缔合或结构是病理条件的生物标记物。也可以通过对样品中的单个靶标单元进行可视化和定量来对所述感兴趣的另一靶标进行可视化和定量。在一个实施方式中，本发明涉及存在于样品中的单个靶标单元的部分子群，例如，存在于样品中的单个单独靶标单元的总数的大部分或小部分。本文中的术语“部分子群”是指单个靶标单元总群的一部分，其等于或少于样品中靶标单个单元的总量的99.9%，例如，等于或少于98%、97%、95%、94%、93%、92%、91%或90%，例如在90%与85%之间，少于85%，例如样品中靶标单元的总量的85% 80%、80% 75%，例如少于75%，例如为样品中靶标单个单元总量的1% 74%，例如为样品中靶标单元的总量的1% 60%、1% 50%、1% 40%、1% 30%或25%,等等。根据本发明将由总群的50% 99.9%表不的单个祀标单兀的部分子群限定为存在于样品中的单个靶标单元的大部分。根据本发明将由少于样品中单个靶标单元的总群的50%表示的部分子群限定为存在于样品中的单个靶标单元的小部分。在一个实施方式中，单独单个靶标单元的大部分可以涉及本发明的离散的单个靶标部位的形成；在另一实施方式中，单独单个靶标单元的小部分可以涉及本发明的离散的单个靶标部位的形成。在一个实施方式中，优选基本上靶标的所有单独单个单元涉及与一种或多种结合剂形成复合物，其中仅所述复合物的部分子群涉及本发明的离散的单个结合位点的形成。结合剂本发明的方法包括如下步骤，其中假定包括靶标的样品与一种或多种结合剂孵育。术语“结合剂”是指能够与靶标单个单元例如靶标蛋白的单独分子直接或间接特异结合的分子。术语“特异”是指，结合剂对靶标具有特定的亲和性，例如对靶标分子的亲和性，或对结合到靶标的试剂的特定亲和性，例如，对结合到靶标蛋白的一抗的亲和性、对与一抗结合的半抗原的亲和性等。术语“直接”是指对靶标的单个单独单元具有特异亲和性的结合剂与该单个单独单元相互作用并在相互作用时形成立即的结合，例如，一抗与用作用于提升所述一抗的抗原的单个单独靶标分子直接结合。本文中使用的术语“间接”是指结合剂，其中所述结合剂对靶标的单个单独单元没有特异亲和性，但是其中所述结合剂对能够与该单个单独单元特异结合的另一物质例如一抗具有特异亲和性，或其中所述结合剂对与所述单个单独单元相关或连接的物质(例如，对半抗原)具有特异亲和性；所述结合剂直接与在后物质相互作用，并与所述物质形成结合，从而结合剂变成与靶标的单个单元间接结合。在本文中通常由第一结合剂表示能够与靶标单个单元直接特异结合的结合剂。通常由第二结合剂表示能够与靶标单个单元间接特异结合的结合剂。然而，根据本发明的检测体系可以包括能够与靶标单个单元间接结合的其它结合剂，例如第三、第四和其它结合剂。通常而言，使用第一结合剂或，在一些实施方式中，第二或第三结合剂，来与样品接触以识别靶标，与其结合并与其形成复合物。第二、第三和其它结合剂可以用于根据本发明的方法的其它步骤中，例如用于识别下述靶标部位处可检测分子的沉积。在一些实施方式中，使用第二、第三和其它结合剂来放大与靶标相关的信号。这些结合剂还可用于对检测体系增加灵活度，例如用于改变与靶标相关的原始信号，例如将红色荧光信号变为绿色等。本发明的结合剂可以是不同特异结合对的成员。领域内已知很多不同的特异结合对，这些是能够特异地相互结合的两个不同分子的配对。适用于实施本发明的特异结合对的成员可以是免疫或非免疫型。非免疫特异结合对包括其中两个组分分享对相互的天然亲和性而不是抗体的体系。示例性的非免疫结合对是生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素、叶酸-叶酸结合蛋白、互补核酸、受体-配体等。本发明还包括相互形成共价键的非免疫结合对。示例性的共价结合对包括巯基反应基团例如马来酰亚胺和卤代乙酰基衍生物，以及胺反应基团例如异硫氰酸盐(酯)、琥珀酰亚胺酯、磺酰卤化物，以及耦合染料例如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和3-( 二甲基-氨基)苯甲酸(DMAB)等。免疫特异结合对可以示例为抗体-抗体体系或半抗原-抗半抗原体系。在一个实施方式中，本发明的免疫特异结合对可以是包括两种或更多种相互有亲和性的抗体分子的抗体-抗体结合对，例如一抗和二抗对，其中一抗代表第一结合剂，并且二抗代表第二结合剂；包括3种或4种或更多种抗体成员的抗体体系可以用于另一个实施方式中。在本发明的其它实施方式中，可以由半抗原-抗半抗原体系表示免疫结合对。在这些实施方式中，可以由包括对靶标具有亲和性的分子和半抗原的结合物表示第一结合剂，例如与半抗原连接的一抗或核酸序列，且可以由抗半抗原抗体表示第二结合剂。术语“半抗原”是指能够被认为是分离的表位的小分子，对该表位可以制备抗体，尽管半抗原独自在注射到动物中时不引发免疫应答，其必须与载体(通常为蛋白)结合。因为半抗原是小分子，多个拷贝的半抗原可以连接到大分子，例如聚合物分子，例如蛋白、核苷酸序列、葡聚糖等。半抗原可以用作为用于其中放大信号是必须或有利的检定形式的便利标记分子。因此，结合的多个拷贝的半抗原提供增强的灵感度，例如，增加的信号强度。合适半抗原的非限制性实例包括荧光素(FITC)、2，4-二硝基酚(DNP)、myc地高辛(DIG)、酪氨酸、硝基酪氨酸生物素和染料，例如四甲基罗丹明、德克萨斯红、丹酰、Alexa Fluor488,BODIPY FL、荧光黄和Alexa Fluor405/Cascade蓝色荧光团，US20080305497中描述的半抗原也可以用于本发明的目的。本文中使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白或其一部分，并包括含有抗原结合位点的任何多肽，而不管来源、制造方法和其它特征。该术语包括，例如，多克隆的、单克隆的、单一特异性的、多特异性的、人化的、单链、嵌合的、合成的、重组的、杂交的、突变的和CDR接枝的抗体。抗体的一部分可以包括仍然能够结合抗原的任何片段，例如，Fab、F(ab’)2、Fv、scFvo通过与制造方法无关的基因序列来限定抗体的来源。本发明上下文中的一抗是指抗体结合剂，例如，整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如包括抗体或聚合抗体的结合物，其与靶标特异结合，更具体地与样品中靶标的单个单元结合，例如，与单个靶标分子结合。在一些实施方式中，一抗可以是能够与不同靶标的两个(或更多)单个单独单元结合的二价抗体，例如能够结合到受体二聚体(例如Her2/Her3 二聚体)的抗体。在该实施方式中，根据本发明的靶标的单个单元是单个的Her2/Her3二聚体，并且靶标是样品中Herf/Herf 二聚体的群体，包括样品的所有所述二聚体。一抗可以源自任何热血种属例如哺乳类、鸟类。本发明上下文中的二抗是指抗体结合剂，例如，整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如包括抗体或聚合抗体的结合物，其具有与一抗、或沉积在靶标部位处的半抗原、或直接或间接连接至一抗或另一结合剂的半抗原特异结合的抗原结合域。本发明上下文中的三抗是指抗体结合剂，例如整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如包括抗体或聚合抗体的结合物，其包括与二抗或连接至二抗的半抗原或连接至结合二抗的聚合物的半抗原或沉积在靶标部位处的半抗原特异结合的抗原结合域。有时候抗体可以同时起到二抗和三抗的作用。本发明中使用的抗体，包括一抗、二抗和三抗，可以源自任何哺乳动物种属，例如大鼠、小鼠、山羊、豚鼠、驴、兔、马、美洲驼、骆驼、或任何鸟类种属，例如鸡、鸭。如本文中使用的源自任何哺乳动物或鸟类种属是指编码特定抗体的核酸序列的至少一部分源自特定哺乳动物例如大鼠、小鼠、山羊或兔，或特定的鸟例如鸡、鸭的基因组序列。抗体可以是任何同种型，例如 IgG, IgM, IgA、IgD, IgE 或任何亚类，例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。在某些实施方式中，一抗含有抗原结合区，其能够与生物标记物特异结合，具体是与由生物样品的细胞表达的所述生物标记物的单个单独单元结合。标记物可以表达在细胞表面上或细胞膜内即细胞的内部，例如细胞质内、内质网内等。在一些实施方式中，可以从细胞中提取生物标记物，因此其存在于无细胞的介质中，例如水溶液中，或者其是存在于细胞培养介质、血浆、脑脊液等中的可溶分子。上面描述相应样品的实例。在某些实施方式中，二抗含有与一抗例如与一抗的恒定区特异结合的抗原结合区。在某些实施方式中，二抗可以与聚合物结合。在一些实施方式中，2 20个二抗例如5 15个二抗可以与聚合物结合。在其它实施方式中，聚合物可以与I 10个二抗例如
1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 个二抗结合。在某些实施方式中，三抗可以含有与二抗例如与二抗的恒定区、或与连接至二抗的半抗原、或与结合有二抗的聚合物特异结合的抗原结合区。在某些实施方式中，三抗与聚合物结合。在一些实施方式中，I 20个三抗可以与聚合物结合。在其它实施方式中，I 5个三抗例如1、2、3、4或5个三抗可以与聚合物结合。在一些实施方式中，可以优选包括单个结合单元的结合剂的聚合物，例如与一个分子的一抗、二抗或三抗结合的聚合物。可用于本发明目的的抗体包括单克隆和多克隆抗体，使用噬菌体展示或可选技术制造的含有嵌合的、CDR接枝和人工选择抗体的工程抗体。可以通过本领域熟知的多种方法中的任何一种来制造本发明的抗体结合剂，例如根据 Harlow 和 Lane, Antibodies:a Laboratory Manual, (1988)(Cold SpringHarbor Press, Cold Spring Harbor, NY)。用于制备重组抗体分子的技术在上述文献和多个其它文献例如EP0623679、EP0368684和EP0436597中有过描述。可以从cDNA库中分离编码抗体的核酸。可以从噬菌体库中分离编码抗体的核酸(参见例如 McCafferty 等人 1990，Nature348:552，Kang 等人 1991，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:4363;EP0589877B1 )。可以通过已知序列的基因改组而获得编码抗体的核酸(Mark等人1992，Bio/Technol.10:779)。可以通过体内重组而分离编码抗体的核酸(Waterhouse等人1993，Nucl.Acid Res.21:2265)。用于本发明方法中的抗体包括人化的免疫球蛋白(参见US5585089，Jones等人1986，Nature332:323)。可以以任何可能的方式改变本发明的抗体，假定它们保持它们的结合亲和性，例如它们可以与效应蛋白、毒素、标记物等融合。抗体与不同试剂结合的方法也在领域内熟知并在本发明以下的示例性实施方式中描述。在本发明的一个实施方式中，由Fab区域表示抗体结合剂。在一个实施方式中，抗体结合剂可以是包括两种或更多种不同抗体结合剂的组合物，例如包括第一抗体结合剂和第二抗体结合剂的组合物，其中该两种或更多种不同抗体剂具有不同的免疫结合对。在一个实施方式中，在组合物中，两种或更多种不同抗体结合剂中的至少一种是能够与靶标特异结合的抗体，且至少一种其它结合剂是包括酶的抗体。在另一个实施方式中，本发明涉及作为非免疫特异结合对的成员的结合剂，例如互补的核苷酸序列或核酸类似分子。包括核酸或核酸类似分子例如DNA分子、RNA分子、PNA分子的结合剂可以用于核酸靶标的单个单独单元的可视化和定量。用作本发明目的用结合剂的核酸序列可以化学合成或在重组细胞中产生。两种产生模式在领域内均公知(参见，例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual, 2nd ed.Cold Spring Harbor Press)。在一些实施方式中，核酸结合剂可以包括肽核酸(PNA)。肽核酸是其中通常存在于DNA和RNA中的脱氧核酸或核酸糖骨架(backbone)被肽骨架替换的核酸分子。制作PNA的方法在领域内已知(参见，例如Nielson, 2001, Current Opinion in Biotechnologyl2:16)(并入本文以供参考)。在其它实施方式中，结合剂可以包括锁核酸(LNA)(Sorenson等人2003，Chem.Commun.7 (17):2130)。在一些实施方式中，核酸结合剂可以包括至少一个寡核苷酸序列或至少一个聚核苷酸序列，其在特定的严格条件下与生物样品中靶标序列的单个单元(例如，单个mRNA序列)特异杂交。本文中使用术语“在严格条件下的杂交”来描述杂交的条件，在该条件下，显著地相互互补例如至少70%、至少80%、至少85 90%互补的核苷酸序列保持相互结合。如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402 (并入本文以供参考)中所述地确定互补百分比。规定的严格条件在领域内已知，并可以在Current Protocols in MolecularBiology, John ffiley&Sons, Inc.(Ausubel 等人 1995eds.)，第 2、4 和 6 节(并入本文以供参考)中找到。此外，在 Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nded.Cold Spring Harbor Press,第7、9和11章(并入本文以供参考)中描述了规定的严格条件。在一些实施方式中，杂交条件为高度严格的条件。高度严格的杂交条件的实例是在65 70°C下在4X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中的杂交或是在42 50°C下在4X SSC加50%甲酰胺中的杂交，之后在65 70°C下在IXSSC中洗涤一次或多次。应理解的是，其它的试剂可以添加到杂交和/或洗涤缓冲液中，例如，封闭剂(BSA或鲑鱼精子DNA)、洗涤剂(SDS )、螯合剂(EDTA )、聚蔗糖、PVP等。在一些实施方式中，结合剂可以在中等严格的条件下与样品中的靶标序列杂交。本文中使用的中等严格包括能够由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度而容易确定的条件。例不的条件在 Sambrook 等人 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2ded.Vol.1, pp.1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(并入本文以供参考)中提出，并包括使用5XSSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA (pH8.0)的预洗液，42°C下50%甲酰胺、6 X SSC的杂交条件(或其它类似的杂交液，例如Stark溶液，在50%甲酰胺中，42°C)，以及60。。、0.5XSSC、0.1%SDS的洗涤条件。在一些实施方式中，结合剂在低严格条件下与样品中靶标序列杂交。本文中使用的低严格条件可以包括能够由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度而容易确定的条件。例如，低严格可以包括在含有35%甲酰胺、5XSSC、50mM Tris-HCl (pH7.5)、5mM EDTA,0.1%PVP、0.1%聚蔗糖、1%BSA和500μ g/ml变性的鲑鱼精子DNA的溶液中于40°C对DNA预处理6小时。在具有以下改变的相同溶液中进行杂交:使用0.02%PVP、0.02%聚蔗糖、0.2%BSA、100 μ g/ml鲑鱼精子DNA、10%(wt/vol)硫酸葡聚糖和5 20 X IO6CPM结合剂。在杂交混合物中于40°C孵育样品18 20小时，之后在含有2XSSC、25mM Tris_HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1%SDS的溶液中于55°C洗涤样品1.5h。使用新鲜溶液替换洗涤液并再使其于60°C孵育 1.5h。在其它实施方式中，本发明可以涉及结合剂，其为源自非抗体蛋白的肽序列或包括该肽序列，例如源自不同蛋白的核酸结合域、不同细胞和核受体的配体及其衍生物的肽序列。这些结合剂的一些非限制性实例可以是能够与抗体恒定区结合的补体级联的经典通路的clq蛋白，MHC分子例如I类MHC和II类MHC和非常规MHC，具有特异结合配偶体的分子例如涉及细胞信号通路的分子例如具有亮氨酸拉链结构域的分子，例如fos/jun、myc、GCN4，具有SHl或SH2结构域的分子，例如Src或Grb_2 ;免疫球蛋白受体，例如Fe受体；嵌合蛋白，即工程制备为将两种或更多种特异结合配偶体的特征结合的蛋白，例如亮氨酸拉链可以被工程制备成抗体的Fe区，SH2结构域可以被工程制备成在抗体的Fe区中表达。在其它实施方式中，融合蛋白可以被工程制备成包括具有取代的可变结构域的抗体的Fe部。结合剂也可以是能够与生物大分子的某些结构单元特异结合的小分子。在一些实施方式中，结合剂可以包括可检测的标记物，例如，荧光物质、半抗原、酶等。在一个实施方式中，本发明涉及标记的结合剂，即能够与样品中结合配偶体(例如，靶标单元、其它结合剂、沉积的可检测分子)特异结合的标记的第一、第二、第三或其它结合剂。这些结合剂可以用于本发明样品中靶标单元或靶标部位的可视化。在一个实施方式中，本发明涉及包括作为酶的标记物的结合剂。合适的酶标记物的非限制性实例可以是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β -半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖_6_磷酸脱氢酶、β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β -葡萄糖醛酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶、葡糖氧化酶(GO)。在一个优选实施方式中，结合剂可以包括HRP作为标记物。在另一优选实施方式中，结合剂可以包括AP作为标记物。在以下讨论其它优选的酶实施方式。形成本发明靶标部位所需的结合剂的量可以根据不同因素例如样品种类、靶标种类、结合剂种类、结合剂的结合亲和性等而变化。使用一般常识，本领域技术人员可以选择合适的结合剂并确定每个特定实施方式所需的量。在一些实施方式中，优选调整用于形成靶标部位的结合剂的量，使得并非样品中存在的靶标的所有单个单元、而是其部分子群涉及靶标部位的形成，例如这些实施方式可以涉及包括大量靶标、或以较宽动态浓度范围存在的靶标的样品。在其它实施方式中，例如在靶标或靶标的单个单元的靶标表达非常低的样品的情况下，可以优选靶标的所有或基本上所有单个单元涉及本发明靶标部位的形成。在后实施方式中，可以优选以如下量使用结合剂，该量保证结合剂与样品的单独单个单元的大部分形成结合位点，即，存在靶标的单个单元的大部分会涉及靶标部位的形成。在一个实施方式中，结合剂可以是未标记和标记的相同种类的结合分子的混合物，其对相同的结合配偶体具有亲和性，例如，对特定靶标蛋白的标记和未标记的一抗的混合物，或针对特定种类的一抗的标记和未标记的二抗的混合物等等。根据本发明，使用在后结合分子混合物，其中一部分标记的结合分子是预定的，使用通过该部分标记的结合剂预定的单个靶标单元的某个部分子群形成靶标部位(之后可视化为视觉上明显的点)。这允许确定样品中单个祀标单元的精确量,并由此确定祀标的量,包括样品中祀标的相对量和总量。在实施例部分中详细讨论对组织学样品中靶标进行定量的该方法和其它方法。在一些实施方式中，本发明涉及结合剂，例如特异结合对的成员，其对于其特异结合配偶体的结合亲和性是已知的，例如，对样品中的结合配偶体例如对靶标或另一结合剂的的预定的结合亲和性。通常通过解离常数来描述特异结合对的成员之间的亲和性，例如，配体与受体、抗体和抗原等，即，配对中的一个结合配偶体(BPl)多紧密地与另一结合配偶体(BP2)结合。可以通过双 态过程来描述结合配偶体之间的复合物(BPl:BP2)的形成:BP1:BP2<=>BP1+BP2 ；相应的解离常数限定为
IBP1IBR21
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ΙΒΡ1ΛΡ2]其中[BP1]、[BP2]和[BP1:BP2]分别表示BPUBPl以及BPl与BP2的复合物的摩
尔浓度。解离常数具有摩尔单位(M)，其相应于BP2的结合位点被占据一半的BPl的浓度，即BP2结合为[BP1:BP2]的BP2浓度等于没有配体结合[BP2]的BP2浓度的BPl的浓度。解离常数越小，结合BPl越紧密，或者BPl与BP2之间的亲和性越高。例如，具有纳摩尔(nM)解离常数的BPl比具有微摩尔(μ Μ)解离常数的BPl更紧密地结合ΒΡ2。用于特定BPl与ΒΡ2相互作用的解离常数可以随着溶液条件(例如，温度、pH和盐浓度)而显著变化。不同溶液条件的作用是有效地改变将特定BPl:BP2复合物保持在一起的任何分子间相互作用的强度。在以下的其它部分中将讨论用于本发明目的的与BP1:BP2复合物形成相关的介质条件。在抗体(Ab)与抗原(Ag)结合的具体情况中，通常使用亲和常数(Ka)。这是解离常数的倒数。
权利要求
1.一种用于对样品中存在的靶标进行定量的方法，其中所述靶标是固定的，包括 (a)将包括所述靶标的单独单元的群体的样品与一种或多种结合剂孵育，其中 (i)至少一种所述结合剂能够与所述IE标的单个单独单元特异结合； ( )至少一种所述结合剂包括酶，并且 (iii)(i)或(ii)的至少一种所述结合剂对其在所述样品中的结合配偶体的结合亲和性是已知的， 从而形成具有所述靶标的单独单个单元的部分子群的一个或多个离散的单个靶标部位，其中各个离散的单个靶标部位包括所述靶标的一个单独单元与一种或多种结合剂的复合物，其中至少一种所述结合剂包括所述酶； (b)使所述离散的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点； (c)对所述视觉上明显的点进行定量； Cd)评估所述祀标的量。
2.根据权利要 求1所述的方法，其中由所述样品中存在的所述靶标的单个单独单元的小部分形成所述靶标部位。
3.根据权利要求1所述的方法，其中由所述样品中存在的所述靶标的单个单独单元的大部分形成所述靶标部位。
4.一种用于对样品中存在的靶标进行定量的方法，其中所述靶标是固定的，包括 (a)将包括所述靶标的单独单元的群体的样品与一种或多种结合剂孵育，其中 (i)至少一种所述结合剂能够与所述靶标的单个单独单元特异结合；并且 ( )至少一种所述结合剂包括酶， 从而形成具有所述靶标的单独单个单元的预定部分子群的一个或多个离散的单个靶标部位，其中各个离散的单个靶标部位包括所述靶标的一个单独单元与一种或多种结合剂的复合物，其中至少一种结合剂包括所述酶； (b)使包括所述酶的所述离散的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点； (c)对所述视觉上明显的点进行定量； Cd)评估所述样品中靶标的量。
5.根据权利要求4所述的方法，包括 (a)将所述样品与第一结合剂孵育， 其中 (i)所述第一结合剂能够与所述靶标的单个单独单元特异结合并使所述样品中所有结合位点基本上饱和， ( )预定部分的所述第一结合剂包括酶， 从而形成离散的单个靶标部位，各个靶标部位包括所述靶标的单个单独单元和所述结合剂，其中一部分的所述离散的单个靶标部位包括含有酶的所述结合剂； (b)使包括所述酶的所述离散的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点； (c)对所述视觉上明显的点进行定量； Cd)评估所述样品中靶标的量。
6.根据权利要求4所述的方法，包括 (a)将所述样品与第一和第二结合剂孵育，其中 (i)第一结合剂能够与所述靶标的单个单独单元特异结合并使所述样品中所有结合位点基本上饱和，且 (ii)第二结合剂能够与所述第一结合剂特异结合，且预定部分的所述第二结合剂包括酶， 从而形成离散的单个靶标部位，各个靶标部位包括所述靶标的单个单独单元、所述第一结合剂和所述第二结合剂，其中一部分的所述离散的单个靶标部位包括含有酶的所述结合剂； (b)使包括所述酶的所述离散 的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点； (c)对所述视觉上明显的点进行定量； Cd)评估所述样品中靶标的量。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的方法，其中所述结合剂是特异结合对的成员。
8.根据权利要求1 7中任一项所述的方法，其中所述酶是具有氧化还原酶活性的酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述酶具有过氧化物酶活性或酚氧化酶活性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述酶是辣根过氧化物酶、大豆过氧化物酶或漆酶、或所述酶的功能性类似物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述离散的单个靶标部位可视化为视觉上明显的点的步骤包括: (I)在水溶液(A)中孵育包括一个或多个离散的单个靶标部位的样品，所述水溶液(A)包括 小于2mM的量的过氧化物， 与所述离散的单个靶标部位相关的酶的第一底物，以及 所述酶的第二底物， 其中所述第一底物是水溶性富电子化合物，其 (1)能够在与所述酶反应时生成自由基；并且 (ii)能够在所述酶与过氧化物的存在下使所述第二底物的分子交联，从而生成所述第二底物的水不溶性聚合产物， 且其中所述第二底物是包括能够用作为所述酶的底物的至少两个化合物以及可检测的标记物的结合物分子，其中所述可检测的标记物选自荧光的、发光的、放射性的或发色的物质或特异结合对的成员， (2)从而在所述离散的单个靶标部位处形成所述第二底物的离散沉积，并使所述离散的单个靶标部位可视化。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述具有氧化还原酶活性的酶的第一底物是包括式(I)结构的化合物:
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述化合物是3，3’- 二氨基联苯胺或其衍生物。
14.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述化合物是阿魏酸或其衍生物。
15.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述化合物是α-氰基-4-羟基-肉桂酸。
16.根据权利要求13所述的方法，其中3，3’- 二氨基联苯胺或其衍生物的量是约0.1至小于ImM。
17.根据权利要求14所述的方法，其中阿魏酸或其衍生物的量是约0.5mM至约5mM。
18.根据权利要求15所述的方法，其中α-氰基-4-羟基-肉桂酸的量是约1.5mM至约 15mM。
19.根据前述权利要求11 18中任一项所述的方法，其中所述结合物分子包括至少一个作为所述具有氧化还原活性的酶的底物且由式(II)限定的化合物:
20.根据权利要求19所述的方法，其中至少两个化合物由式(II)限定。
21.根据权利要求19所述的方法，其中由式(II)限定的至少两个化合物是相同的化合物。
22.根据权利要求19所述 的方法，其中由式(II)限定的至少两个化合物是不同的化合物。
23.根据权利要求19 23中任一项所述的方法，其中所述化合物选自肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、氨基肉桂酸或芥子酸、或其衍生物。
24.根据前述权利要求19 22中任一项所述的方法，其中所述结合物包括至少一个酪氨酸残基作为所述酶的底物。
25.根据前述权利要求19 24中任一项所述的方法，其中在所述结合物中，能够用作为与单个靶标部位相关的所述酶的底物的所述至少两个化合物中的每个在所述结合物分子中相互隔开30个或少于30个连续连接的原子，并且所述可检测的标记物与任意所述底物隔开30个或多于30个连续连接的原子。
26.根据权利要求25所述的方法，其中在所述结合物分子中将所述标记物与所述具有氧化还原酶活性的酶的任意底物隔开的所述至少30个连续连接的原子包括下式(III)的2 10个重复:
27.根据前述权利要求11 24中任一项所述的方法，其中由相同结合物分子的群体或不同结合物分子的群体表示所述第二底物，其中所述结合物分子是权利要求18 26中任一项限定的任意一种。
28.根据前述权利要求11 27中任一项所述的方法，其中所述方法包括步骤(I)之前的步骤(1’)，其中在水溶液(B)中孵育所述样品，所述水溶液(B)除不包括第二底物之外具有与水溶液(A)相同的组成。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述明显的点是具有大约或大于0.4微米的视直径的点。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在根据权利要求1或4所述的步骤(a)、(b)和/或(c)之间包括至少一个洗涤步骤。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶标选自生物或化学的靶标分子、颗粒、分子或细胞复合物、分子或细胞结构、病毒或微生物、或所述靶标分子、颗粒、复合物、结构、病毒或微生物的片段。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中靶标的所述单独单元选自单独单个生物或化学分子、单独单个颗粒、单独单个分子或细胞复合物、单独单个分子或细胞结构、或单独单个病毒或微生物、或所述分子、颗粒、复合物、结构、病毒或微生物的单独单个片段。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述靶标是蛋白或核酸分子、或其片段或衍生物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述蛋白是胞浆、胞内或核膜蛋白，或细胞核、细胞器或胞质蛋白，或细胞核、细胞器或胞质核酸。
35.根据权利要求31 34中任一项所述的方法，其中所述靶标是生物标记物。
36.根据权利要求31 34中任一项所述的方法，其中所述靶标是HER2或其产物。
37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是生物、化学或环境样品。
38.根据前述权 利要求中任一项所述的方法，其中手动、半手动或自动执行对离散的视觉上明显的点的定量。
39.根据权利要求4 36中任一项所述的方法，其中所述方法用于对样品中靶标的绝对量进行定量。
40.根据权利要求1 36中任一项所述的方法，其中所述方法用于对样品中靶标的相对量进行定量。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述样品是组织学样品。
42.根据权利要求41所述的方法，其中相对于所述样品的单位面积或单位体积、或包括在所述样品中的单位对象或单位参考标记物而评估所述祀标的量。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述对象是细胞结构或细胞器。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述对象是细胞核。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述参考标记物是蛋白或核酸序列。
46.一种试剂盒，包括用于执行权利要求1 45中任一项所述的方法的试剂。
47.一种用于在个体中诊断或预测疾病、或预测治疗处理的效力的方法，包括根据权利要求I 45中任一项所述的方法在从所述个体得到的样品中评估与所述疾病或所述治疗处理相关的生物标记物的量的步骤。
全文摘要
本发明属于使用免疫化学手段对样品中固定靶标进行可视化和定量的领域。本发明的方法利用允许使样品中的单个靶标单元可视化为明显的点的免疫染色体系。具体地，本发明涉及用于对组织学样品中免疫染色的分子靶标进行可视化和定量的方法和试剂以及所述方法和试剂在医学诊断中的用途。然而本发明的可视化和定量方法可以应用于不同样品中的多种靶标，并且允许对其相对和绝对量进行精确定量。
文档编号G01N33/58GK103201627SQ201180053856
公开日2013年7月10日 申请日期2011年11月8日 优先权日2010年11月8日
发明者J.洛泽, G.斯克拉蒂奇克瓦 申请人:丹麦达科有限公司