专利名称：一种检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒，该试剂盒可以实现从少量体液细胞中简单，快捷，准确的检测出结核杆菌。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的人兽共患慢性传染病，是威胁人类的三大传染性疾病之一，目前全世界大约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年大约有200-300万人死于结核。加之多重耐药结核菌的流行、人类免疫缺陷病毒的感染及贫穷等多种因素的影响，结核病发病率呈日益回升的严重趋势，结核性脑膜炎 (Tuberculous meningitis, TBM)的发病率亦逐渐升高。结核性脑膜炎是严重的中枢神经系统感染性疾病，病死率和病残率均较高。因此，早期、快速、有效的病原学诊断对及时治疗结核病、减少病死率和后遗症极其重要。目前常用的结核分支杆菌感染的检测方法包括
传统CSF抗酸杆菌涂片法具有简便、快速、价廉的优点，但是阳性率低，约10%，且需要检材中的细菌彡io4/mi才能找到，特异性差。结核分枝杆菌培养检查，培养时间较长，需4 8周，且阳性率低，多在20 30%， 对临床早期诊断价值有限。结核菌素皮肤试验(TST)是建立在机体对pro迟发性超敏反应的基础上，但pro是将MTB培养物加热灭活和沉淀制成的一组蛋白质，为成分不明确的复合抗原，其许多成分与卡介苗和非结核分枝杆菌的抗原成分相同，因此，在卡介苗接种率和非结核分枝杆菌感染率较高的地区，TST方法的特异度较低。对于免疫低下者、近期感染者、年幼儿童及营养不良者，TST方法缺乏足够的灵敏度。另外，TST方法缺乏一个内在固有数值来判定一个人是否存在MTB的感染，该方法以某数值为界来判断某人是否存在MTB潜伏感染，不同的界值可能会对个体的划分产生错误，影响方法的灵敏度和特异度。结核抗体测定是结核病研究和应用报道最多的方法。TBM患者的脑脊液(CSF)中抗MTB IgG抗体高于其自身血液中特异性IgG抗体，说明中枢神经系统能局部合成抗体，经受损血脑屏障转送到CSF中。综合多家报道，结核抗体检测的假阳性率在2 15%，假阴性率在5 45%。抗体检测不能鉴别是MTB的急性感染还是以前对MTB的暴露，更不能解决 TBM早期诊断的问题。结核抗原测定，由于MTB被吞噬、形成抗原抗体复合物，及抗原量少往往会造成一定的假阴性。另外，在结核抗原的检测中，由于MTB与属内外某些微生物有共同的抗原，往往会造成一定的假阳性。分子生物学具有敏感、快速、特异、高效等优点，但是在大批量临床应用中，PCR作为一种诊断手段仍然存在一定的假阳性和假阴性，污染、扩增循环过多或退火温度过低而引起非特异性扩增产物从而产生假阳性，需要相应的检测设备且检测费用高。生化检查方法具有重要的诊断价值，但患者多数入院前已经过抗菌、抗病毒、抗痨甚至激素等治疗，使CSF呈不典型改变。结核杆菌为胞内寄生菌，传统的抗酸染色法细胞收集率低，对结核杆菌检测的阳性率低。
发明内容
为克服现有临床诊断结核性疾病和传统抗酸染色技术的上述缺陷，本发明的目的是提供一种检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒及其使用方法。本发明实现过程如下
一种检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒，包括下述部件
1)A液，I管，内装丙酮甲醛固定液；
2)B 液，I 管，内装 O. 5%TritonX-100 ；
3)C液，I管，内装石碳酸复红溶液；
4)D液，I管，内装酸性酒精溶液；
5)E液，I管，内装亚甲基蓝溶液。所述丙酮甲醛固定液的配置方法为将丙酮45ml和甲醛25ml加入磷酸盐缓冲液中，并将PH值调至6. 6，过滤备用；所述磷酸盐缓冲液由磷酸氢二钠20mg和磷酸二氢钾 IOOmg溶于双蒸馏水30ml得到。所述O. 5%TritonX-100的配置方法为将30% TritonX-IOO稀释60倍，所述30% TritonX-IOO由30ml TritonX-100加入70ml双蒸水中混匀、过滤得到。所述体液为脑脊液、尿、胸水、腹水、羊水、血液、前房液或中耳液。上述检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒的使用方法所述试剂盒使用时需要用细胞玻片离心沉淀仪收集细胞；采用2% 3-氨丙基-3-乙氧甲娃烧(3-Aminopropyl-Tri ethoxysilance, APES)挂胶的载玻片；并采用O. 5%TritonX_100处理细胞。具体的讲，制作APES挂胶的载玻片操作步骤为
1)将载玻片在碱性洗涤液中清洗晾干后，载玻片过酸清洗晾干；
2)将晾干的载玻片浸入经丙酮I: 50稀释的APES胶中30s，后经丙酮溶液浸泡30s， 涮去未结合的APES，浸泡两次；
3)将挂好胶的载玻片晾干装盒备用。检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒的具体使用方法包括以下步骤
1)将APES挂胶的载玻片装载于细胞玻片离心沉淀仪上；
2)将体液细胞计数后根据每立方毫米细胞数滴加于载玻片上，于细胞玻片离心沉淀仪离心2-5分钟至细胞面刚刚干燥为止；
3)A液固定30秒,后蒸懼水自载玻片一端轻缓冲洗；
4)滴加B液于细胞面上处理细胞30分钟，后用pH7. 4的O. OlM磷酸盐缓冲液洗涤3 次，每次3-5min ；
5)滴加C液于载玻片上，盖满细胞面，染色15分钟，然后用蒸馏水自载玻片一端轻缓冲
洗；
6)自细胞面上端外缘滴加D液，布满细胞面，脱色两次，每次5分钟，后蒸馏水自载玻片一端轻缓冲洗，浙去载玻片上剩余的水；7)滴加E液，染色4-5分钟，后蒸馏水冲洗，并浙去载玻片上剩余的水，待载玻片干燥后镜检。本发明的试剂盒能够适用于细胞核内染色，是一种细胞收集率高的抗酸染色法。 结合细胞玻片离心沉淀仪收集细胞，使用APES挂胶的载玻片以及O. 5%TritonX-100处理细胞，这种改进的方法可以从结核菌感染患者O. 5毫升的体液中检测结核杆菌，这对于结核性疾病的临床诊断和治疗具有重要意义。
图I为使用本发明试剂盒染色法检测的脑脊液嗜中性粒细胞中的结核杆菌；
图2为使用本发明试剂盒染色法检测的脑脊液单核细胞中的结核杆菌；
图3为使用本发明试剂盒染色法检测的脑脊液淋巴细胞结核杆菌；
图I至3中，比例尺20 μ m，内置图5 μ m。
具体实施例方式以脑脊液为例，采用本发明试剂盒进行如下操作
1)将挂胶载玻片装载于FUM-6型细胞涂片离心沉淀器上，使离心沉淀器与载玻片之间松紧适度且用力均匀；
2)将脑脊液经细胞计数后根据每立方毫米细胞数滴加适量于沉淀器中的载玻片上，于 FUM-6型细胞玻片离心沉淀仪52g离心2-5分钟至细胞面刚刚干燥为止；
3)甲醛丙酮溶液固定30秒，后蒸馏水自玻片一端轻缓冲洗；
4)滴加O.5%TritonX-100于细胞面上处理细胞30分钟，后蒸馏水轻缓冲洗；
5)滴加石碳酸复红溶液于玻片上，盖满细胞面，染色15分钟，后蒸馏水自玻片一端轻缓冲洗；
6)自细胞面上端外缘滴加酸性酒精溶液，布满细胞面，脱色两次，每次5分钟，后蒸馏水自玻片一端轻缓冲洗，浙去玻片上剩余的水；
7)滴加亚甲基蓝溶液，染色4-5分钟，后蒸馏水冲洗，并浙去玻片上剩余的水，待玻片干燥后镜检。
表I本试剂盒所述染色法与传统的抗酸染色法和结核分支杆菌培养方法检测
脑脊液样本灵敏度的差异
权利要求
1.一种检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒，其特征在于包括下述部件.1)A液，I管，内装丙酮甲醛固定液；.2)B 液，I 管，内装 O. 5%TritonX-100 ；.3)C液，I管，内装石碳酸复红溶液；.4)D液，I管，内装酸性酒精溶液；.5)E液，I管，内装亚甲基蓝溶液。
2.根据权利要求I所述的检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒，其特征在于丙酮甲醛固定液的配置方法为将丙酮45ml和甲醛25ml加入磷酸盐缓冲液中，并将pH值调至.6.6，过滤备用；所述磷酸盐缓冲液由磷酸氢二钠20mg和磷酸二氢钾IOOmg溶于双蒸馏水 30ml得到。
3.根据权利要求I所述的检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒，其特征在于 O. 5%TritonX-100 的配置方法为将 30% TritonX-IOO 稀释 60 倍，所述 30% TritonX-IOO 由 30ml TritonX-IOO加入70ml双蒸水中混匀、过滤得到。
4.根据权利要求I所述的检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒，其特征在于所述体液为脑脊液、尿、胸水、腹水、羊水、血液、前房液或中耳液。
5.权利要求I所述的检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒的使用方法，其特征在于所述试剂盒使用时需要用细胞玻片尚心沉淀仪收集细胞；米用2% 3-氨丙基-3-乙氧甲硅烷APES挂胶的载玻片；并采用O. 5%TritonX-100处理细胞。
6.根据权利要求5所述的检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒的使用方法，其特征在于制作APES挂胶的载玻片操作步骤为.1)将载玻片在碱性洗涤液中清洗晾干后，载玻片过酸清洗晾干；.2)将晾干的载玻片浸入经丙酮I: 50稀释的APES胶中30s，后经丙酮溶液浸泡30s， 涮去未结合的APES，浸泡两次；.3)将挂好胶的载玻片晾干装盒备用。
7.根据权利要求5所述的检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤.1)将APES挂胶的载玻片装载于细胞玻片离心沉淀仪上；.2)将体液细胞计数后根据每立方毫米细胞数滴加于载玻片上，于细胞玻片离心沉淀仪离心2-5分钟至细胞面刚刚干燥为止；.3)用A液固定30秒，后蒸馏水自载玻片一端轻缓冲洗；.4)滴加B液于细胞面上处理细胞30分钟，后用pH为7.4的O. OlM磷酸盐缓冲液洗涤 3次,每次3-5min ；.5)滴加C液于载玻片上，盖满细胞面，染色15分钟，然后用蒸馏水自载玻片一端轻缓冲洗；.6)自细胞面上端外缘滴加D液，布满细胞面，脱色两次，每次5分钟，后蒸馏水自载玻片一端轻缓冲洗，浙去载玻片上剩余的水；.7)滴加E液，染色4-5分钟，后蒸馏水冲洗，并浙去载玻片上剩余的水，待载玻片干燥后镜检。
全文摘要
本发明公开了一种检测体液细胞中结核杆菌的染色试剂盒，包括丙酮甲醛固定液、0.5%TritonX-100、石碳酸复红溶液、酸性酒精溶液和亚甲基蓝溶液。本发明的试剂盒能够适用于细胞核内染色，是一种细胞收集率高的抗酸染色法。结合细胞玻片离心沉淀仪收集细胞，使用APES挂胶的载玻片以及0.5%TritonX-100处理细胞，这种改进的方法可以从结核菌感染患者0.5毫升的体液中检测结核杆菌，可用于结核性疾病的临床诊断。
文档编号G01N1/30GK102589955SQ201210010660
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月15日 优先权日2012年1月15日
发明者赵钢 申请人:中国人民解放军第四军医大学