专利名称：一种小鼠α干扰素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，尤其是涉及对对小鼠血清、 血浆、细胞培养上清液或其它相关生物液体中α干扰素含量的检测。
背景技术：
干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞 (NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性作用。目前，检测干扰素较为常用的方法为酶联免疫吸附法(ELISA)。其优点在于特异性强，操作简便，特别适于大批量样品的检测；但是ELISA由于采用大分子的酶标记，其灵敏度和稳定性及测量范围还有一定的局限。TRFIA是超微量检测领域中一项新兴的检测技术，是利用免疫反应的高度特异性和标记示踪物的高度灵敏性相结合而建立的一类微量物质检测技术。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种小鼠α干扰素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法。本试剂盒有效期长、操作流程短、灵敏度高、标准曲线量程宽、可全自动操作、应用范围十分广泛。本发明的技术方案如下
一种小鼠α干扰素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，α干扰素简称IFN-α，由以下部分组成具有微孔的IFN-α抗体包被板(I),缓冲液(2),小鼠IFN-a标准(3),生物素 IFN- a抗体(4)的冻干品，铕标记的Eu3+-链霉未和素(5)的冻干品，洗漆液(6)和增强液 (7)。试剂盒的检测方法取IFN-a抗体包被板(I )，加入小鼠IFN-a标准(3)或其他处理好的样品到各自的微孔中，再加入生物素IFN-a抗体(4)，振荡反应，用洗涤液(6)洗涤，再加入Eu3+-链霉亲和素(5)，进行反应，用洗涤液(6)洗涤，再加入增强液(7)振荡后测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的IFN-a含量。更具体的检测方法取IFN-a抗体包被板(I )，加入50 1的小鼠IFN-a标准(3) 或其他处理好的样品到各自的微孔中，再加入50 1以缓冲液(2)稀释的生物素IFN-a抗体(4)，25°C振荡I小时，洗涤液(6)洗三次，再加入以缓冲液(2)稀释的100 1 Eu3+-链霉亲和素(5)，25°C振荡O. 5小时，用洗涤液(6)洗六次，再加入200 1增强液(7)振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的IFN-a含量。
所述具有微孔的IFN- α抗体包被板(I)的微孔有96或48孔。所述其他处理好的样品可以为小鼠血清、血浆、细胞培养上清液等天然或重组的小鼠IFN-β。本发明有益的技术效果在于
TRFIA的基本原理是用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、 酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等物质。当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点(特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长)，用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。TRFIA技术采用原子标记，方法稳定，而且空间位阻小，灵敏度高，TRFIA的荧光计数可以跨越4个数量级，克服了 ELISA中的吸光度范围只有2个数量级的限制，检测的灵敏度和量程较ELISA成倍增加，使检测更灵敏、更稳定。采用TRFIA方法建立的TRFIA检测限在 10_18mol/L，大大高于 ELISA 的 10, mol/L 和放射免疫分析(RIA) 10_12 mol/L。
图I为本小鼠α干扰素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒示意图。图中l、IFN_a抗体包被板；2、缓冲液；3、小鼠IFN-a标准；4、生物素IFN-a抗体；5、Eu3+-链霉亲和素；6、洗涤液；7、增强液。图2为荧光值-浓度标准曲线。
具体实施例方式I、铕标记的Eu3+-链霉亲和素5的制备
取链霉亲和素溶液(SIGMA公司的Img包装)，将其缓冲体系(链霉亲和素一般是以溶液形式保存在缓冲液中的)通过S印hadex G-50转换为50 mmol/L的Na2CO3-NaHCO3、pH为8. 5 的缓冲液，这是一个常用的手段，目的是转换到碱性条件下利于反应。然后取转换好的含I mg链霉亲和素的缓冲液加入含O. 2 mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-节基]_ 二乙烯三胺四乙酸 (Eu3+-DTTA)的小瓶中，30°C磁力搅拌20小时，得到的反应液经用80 mmol/L Tris-HCl (pH 为7. 8)缓冲液平衡的S印harose CL-6B柱(I X 40cm)层析，紫外检测仪在A280监测，第一个吸收峰为标记的蛋白峰，收集蛋白峰对应的溶液，稀释分装备用。2、生物素IFN-α抗体4的制备
取I mg生物素N羟基琥珀酰亚胺酯(BNHS)溶于0. I ml 二甲基甲酰胺(DMF);另取标记用的抗IFN-a的抗体I mg,用pH为9. O的50 mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液配成5 mg/ ml的抗IFN- α的抗体溶液，将BNHS与抗IFN- α的抗体(体积比1:4)混合反应，25 °C电磁搅拌3小时，反应液对50 mmol/L pH为7. 2的Tris-HCl透析24h，中间换液3次，除去没有反应的BNHS，得到生物素生物素IFN-α抗体4，进一步稀释、分装、冻干、_20°C保存。3、IFN- α抗体包被板I的制备
将包被用的抗IFN- α的抗体用pH为9. 6的50 mmol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液稀释成5 mg/L的包被液，96 (或48)孔微孔板的各孔加分别加100 μ 1，4°C放置过夜。弃去包被液，冲洗两次，加150 μ I含3 g/L BSA的pH为9. 6的50mmol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液封闭，4°C放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置_20°C冷冻保存。
4、其他试剂的配制
(1)小鼠IFN-α标准3的制备从高浓度IFN-a(miltenyi biotec公司的200uL包装)稀释分别得到 Opg/ml, 2pg/ml, 10pg/ml, 100pg/ml, 500pg/ml, lOOOpg/ml 这 6 种标准,所述稀释液为缓冲液2 ；
(2)缓冲液2的配制将8mmol/L NaCl、0. 1%BSA、50 μ mol/L 二乙烯三胺五乙酸 (DTPA),0. I ml/LTween-80 和 0. l%NaN3 的 pH 为 7. 8 的 Tris-HCl 混合起来；
(3)洗涤液6的配制:将14.5 mmol/L NaCl.O. 2 ml/LTween-80和 0. 2%NaN3 的 50 mmol/ L pH为7. 8的Tris-HCl混合起来；
(4)增强液7的制备1升pH为3.2的邻苯二甲酸氢钾缓冲液中加入15 mol β-萘甲酰三氟丙酮(β_ΝΤΑ)、50 mol三正辛基氧化膦(T0P0)、1 ml曲拉通Χ-100 (Triton X-100)。5、本小鼠α干扰素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒提供的试剂每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下
(1)1X96孔IFN-α抗体包被板I (8条X 12孔，可以拆分为单孔)包被有抗IFN-a 的抗体；
(2)6X小鼠 IFN-a 标准液 3，I. O ml/瓶,标准液浓度为0 pg/ml, 2 pg/ml, 10 pg/ ml,100 pg/ml,500 pg/ml,1000 pg/ml ；
(3)IX生物素IFN-a抗体4的冻干品，测定时用0. 5 ml蒸馏水溶解；
(4)1XEu3+-链霉亲和素5的冻干品，测定时用0. 5 ml蒸馏水溶解；
(5)IX 增强液 7 :15 ml ；
(6)IX洗涤液6 :30 ml，用时以蒸馏水1:25稀释；
(7)IX 缓冲液 2 30 ml。6、测定之前注意事项
(O使用之前将所有试剂回升至室温(18 30°C)；
(2)使用之后立即将所有试剂放回2l°C；
(3)如果样品量大建议使用多通道移液器；
(4)在所有检测步骤过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔；
(5)取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2 8°C。7、具体检测步骤如下
选取小鼠血清为样品，制备方法为在4000rpm离心10分钟，取上清液。取包被有抗 IFN-a抗体的微孔IFN-α抗体包被板I，加入50 1的小鼠IFN-α标准3或处理好的样品到各自的微孔中，加50 1以缓冲液2以1:50稀释的生物素IFN-a抗体4，25°C振荡I 小时，用洗涤液6洗三次，加100 1以缓冲液2以1:50稀释的Eu3+-链霉亲和素5，25°C 振荡0. 5小时，用洗涤液6洗六次，加200 1增强液7振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线(如图2所示)计算样品中的IFN-a含量，见表I所示，该例的样品浓度为47 pg/ ml ο表I
权利要求
1.一种小鼠α干扰素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，α干扰素简称IFN-α，其特征在于由以下部分组成具有微孔的IFN-α抗体包被板(1)，缓冲液(2)，小鼠IFN-α标准(3),生物素IFN- α抗体(4)的冻干品，铕标记的Eu3+-链霉亲和素(5)的冻干品，洗涤液(6) 和增强液(7)。
2.一种用权利要求I所述的试剂盒的检测方法，其特征在于取IFN-α抗体包被板 (1)，加入小鼠IFN-α标准(3)或其他处理好的样品到各自的微孔中，再加入生物素IFN-a 抗体(4)，振荡反应，用洗涤液(6)洗涤，再加入Eu3+-链霉亲和素(5)，进行反应，用洗涤液(6)洗涤，再加入增强液(7)振荡后测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的IFN-a含量。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于取IFN-a抗体包被板(1)，加入 50 1的小鼠IFN-a标准(3)或其他处理好的样品到各自的微孔中，再加入50 1以缓冲液(2)稀释的生物素IFN-a抗体(4)，25°C振荡I小时，洗涤液(6)洗三次，再加入以缓冲液(2 )稀释的100 1 Eu3+-链霉亲和素(5 )，25°C振荡O. 5小时，用洗涤液(6 )洗六次，再加入200 1增强液(7)振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的IFN-a含量。
4.根据权利要求I所述的小鼠a干扰素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于所述具有微孔的IFN- a抗体包被板(I)的微孔有96或48孔。
5.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于所述其他处理好的样品可以为小鼠血清、血浆、细胞培养上清液等天然或重组的小鼠IFN-β。
全文摘要
一种小鼠α干扰素的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，α干扰素简称IFN-α，由以下部分组成具有微孔的IFN-α抗体包被板(1)，缓冲液(2)，小鼠IFN-α标准(3)，生物素IFN-α抗体(4)的冻干品，铕标记的Eu3+-链霉亲和素(5)的冻干品，洗涤液(6)和增强液(7)。试剂盒的检测方法取IFN-α抗体包被板(1)，加入小鼠IFN-α标准(3)或其他处理好的样品到各自的微孔中，再加入生物素IFN-α抗体(4)，振荡反应，用洗涤液(6)洗涤，再加入Eu3+-链霉亲和素(5)，进行反应，用洗涤液(6)洗涤，再加入增强液(7)振荡后测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的IFN-α含量。本试剂盒有效期长、操作流程短、灵敏度高、标准曲线量程宽、可全自动操作、应用范围十分广泛。
文档编号G01N21/64GK102608328SQ20121005639
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者徐铮, 杭晓健 申请人:无锡市普生生物工程技术有限公司