专利名称：杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性影响的测定方法
技术领域：
本发明涉及杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的測定方法。
背景技术：
自1996年转基因Bt植物在美国首次商业化种植以来，转基因作物在全球的种植面积持续快速增长。根据ISAAA公布的数据表明，2010年全球转基因作物种植面积已达到了 I. 48亿公顷(James，2010)，其中具有抗虫特性的转基因作物0. 586亿公顷，占总种植面积的37. 5%。转Bt抗虫植物的种植能有效减少广谱化学杀虫剂的使用，降低了农药对环境的污染，保护了人类健康。转基因抗虫植物的利用是作物害虫防治技术的一次巨大绿色变革。然而，像其他害虫防治措施一祥，其为人类带来利益的同时，也可能会对环境造成潜在的生态风险。转基因抗虫作物对非靶标生物的潜在影响是有关转基因作物环境风险评价中关注的ー个焦点。目前，在转基因植物的非靶标生物影响方面，国际上已逐渐形成了一套被风险评估工作者广泛采用的分层次评价程序(Romeis et al. ,2008 ;王圆圆等,2011)。在该评价程序中， 第一歩(层)需要鉴定转基因作物表达的杀虫蛋白对受试非靶标生物的潜在毒性，被称之为Tier-I毒性測定试验。简单的说，就是发展合适的人工饲料或其它杀虫蛋白载体把高剂量的、具有杀虫活性的杀虫蛋白传递给受试生物，设立合适的阴性和阳性对照，通过比较杀虫蛋白处理和阴性和阳性对照处理间的受试生物生长发育及其它生理生化參数，评价杀虫化合物对该生物的潜在毒性。这样的毒性測定模型不但可以用于评价转基因抗虫作物对非靶标受试生物的潜在风险，还有可以用于筛选对受试昆虫具有杀虫活性的新基因(Li et al. ,2011)。灰飞風(Laodelphax striatellus Fall6n)属半翅目飞風科,主要分布于从菲律宾至西伯利亚与欧洲的温帯地区，在我国分布十分广泛，尤其是在长江流域及华北地区。它不仅直接刺吸危害水稻、小麦、玉米、高粱等作物。更重要的是传播水稻条纹叶枯病、黑条矮缩病及玉米粗缩病等病毒病害。在亚洲，长期化学防治已导致该虫对有机氯、有机磷及氨基甲酸酯类等多种杀虫剂产生了抗性。发展转基因抗虫作物可能是防治稻飞虱的有效措施。 然而，当前培育的转基因抗虫水稻都只对鳞翅目害虫有较好抗性，至今还没有发现对飞虱有高效抗性的杀虫基因。
发明内容
为了高效筛选对该类害虫有抗性效果的杀虫基因，并评价当前已经培育成功的转基因抗虫水稻表达的外源杀虫蛋白及不同杀虫剂对灰飞虱的潜在影响，专利申请人通过试验研究，其首先确立了对灰飞虱毒性測定体系有效的人工饲料，发展了把不同有机或无机杀虫化合物加入人工饲料的技术和方法，筛选了适合可用于测定体系的阳性对照化合物 (蛋白酶抑制剂E-64或无机化合物神酸ニ氢钾PA)，经试验研究提出了适合的灰飞虱毒性影响评价指标，并利用E-64和PA作为模式化合物，通过剂量反应生测试验验证了所建立灰飞虱毒性测定方法的有效性和敏感性，最终建立了系统、敏感的评价杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性影响的测定方法。本发明提供的一套杀虫化合物(纯杀虫蛋白或其它毒性化合物)对灰飞虱潜在毒性的测定方法，以期为新型杀虫基因的筛选、转基因抗虫植物的环境安全评价及杀虫剂毒性测定提供技术支撑。本发明提供的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法利用混入了需要检测的杀虫化合物的人工饲料供灰飞虱取食，通过选择合适的灰飞虱生长发育指标评价所述杀虫化合物对灰飞虱的潜在毒性，所述人工饲料为含有氨基酸、维生素、无机盐和蔗糖的水溶液，以mg/100ml为浓度单位，所述氨基酸包括如下组分L_盐酸精氨酸150-200，L-天冬酰胺酸200-250，L-谷氨酸220-280，L-谷氨酰胺180-230，L-组氨酸65-85，L-蛋氨酸65-85， L-亮氨酸210-270，L-赖氨酸盐酸盐180-210，L-苯丙氨酸180-220, L-丝胺酸350-450， L-结Jj氛酸 260-330。较佳地，以mg/100ml为浓度单位，所述氨基酸还包括如下组分L-丙氨酸 100-150，L-天冬氨酸 90-110，L-异亮氨酸 90-110，L-脯氨酸 90-110，L-苏氨酸 100-150， L-色氨酸90-120。较佳地，以mg/100ml为浓度单位，所述氨基酸还包括如下组分甘氨酸25_35， L-半胱氨酸70-90，L-胱氨酸盐酸盐15-25，Y -氨基丁酸8_12，L-酪氨酸8_12。较佳地，所述维生素包括如下组分生物素O. 03-0. 07,泛酸钙3-7，氯化胆硷 40-60，叶酸O. 3-0. 7，肌醇45-55，烟酸12-18，盐酸吡哆辛2-3，核黄素O. 3-0. 7，盐酸硫胺素2-3，维生素C 80-120 ;所述无机盐还包括如下组分=CaCl2 · 2H20 3-3. 3，CuCl2 · 2H20 O. 2-0. 35，FeCl3 · 6H20 2-2. 5，MnCl2 · 4H20 0. 5-1，氯化锌 0. 3-0. 5，六水氯化镁 180-220， 磷酸二氢钾450-550 ;所述蔗糖的浓度为6000-12000。更佳地，所述人工饲料中含有的氨基酸、维生素、无机盐和蔗糖的组分和浓度如下
权利要求
1.杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其利用混入了需要检测的杀虫化合物的人工饲料供灰飞虱取食，通过灰飞虱生长发育指标评价所述杀虫化合物对灰飞虱的潜在毒性，其特征在于，所述人工饲料为含有氨基酸、维生素、无机盐和蔗糖的水溶液，以mg/100ml 为浓度单位，所述氨基酸包括如下组分L-盐酸精氨酸150-200，L-天冬酰胺酸200-250， L-谷氨酸220-280, L-谷氨酰胺180-230, L-组氨酸65-85，L-蛋氨酸65-85，L-亮氨酸 210-270，L-赖氨酸盐酸盐180-210, L-苯丙氨酸180-220, L-丝胺酸350-450，L-缬氨酸 260-330。
2.根据权利要求I所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于， 以mg/100ml为浓度单位，所述氨基酸还包括如下组分L_丙氨酸100-150，L-天冬氨酸 90-110，L-异亮氨酸 90-110，L-脯氨酸 90-110，L-苏氨酸 100-150，L-色氨酸 90-120。
3.根据权利要求2所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于， 以mg/100ml为浓度单位，所述氨基酸还包括如下组分甘氨酸25-35，L-半胱氨酸70-90， L-胱氨酸盐酸盐15-25，Y -氨基丁酸8-12，L-酪氨酸8_12。
4.根据权利要求I所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于， 以mg/100ml为浓度单位，所述维生素包括如下组分生物素O. 03-0. 07，泛酸钙3_7，氯化胆硷40-60，叶酸O. 3-0. 7，肌醇45-55，烟酸12-18，盐酸吡哆辛2-3，核黄素O. 3-0. 7， 盐酸硫胺素2-3，维生素C 80-120 ;所述无机盐还包括如下组分=CaCl2 · 2H20 3-3.3， CuCl2 ·2Η200· 2-0. 35，FeCl3 ·6Η20 2-2. 5，MnCl2 · 4Η20 O. 5_1，氯化锌 O. 3-0. 5，六水氯化镁 180-220，磷酸二氢钾450-550 ;所述蔗糖的浓度为6000-12000。
5.根据权利要求I所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于，所述人工饲料中含有的氨基酸、维生素、无机盐和蔗糖的组分和浓度如下
6.根据权利要求5所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的測定方法，其特征在干，所述人工饲料中含有的氨基酸、维生素、无机盐和蔗糖的组分和浓度如下i.氨基酸mg/100mlL-脯氨酸100盐酸吡哆辛2. 5甘氨酸30L-赖氨酸盐酸盐200核黄素0. 5L-丙氨酸130L-苯丙氨酸200盐酸硫胺素2. 5L-盐酸精氨酸175L-丝胺酸400维生素C100. 0L-天冬酰胺酸230L-苏氨酸1303.无机盐mg/100mlL-天冬氨酸100L-色氨酸105CaCl2 2H203. IL-半胱氨酸80L-酪氨酸10CuCl2 2H200. 27L-胱氨酸盐酸盐20L-缬氨酸300FeCl3 6H202. 23Y-氨基丁酸102.维生素mg/100mlMnCl2 4H200. 8L-谷氨酸250生物素0. 05氯化锌0. 4L-谷氨酰胺204泛酸钙5. 0六水氯化镁200L-组氨酸80氯化胆硷50. 0磷酸ニ氢钾500L-蛋氨酸70叶酸0. 5L-异亮氨酸100肌醇50. 04.mg/100mlレ亮氨酸240烟酸15. 0蔗糖9000
7.根据权利要求I所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的測定方法，其特征在于，所述灰飞虱生长发育指标选自灰飞虱若虫的生存率、若虫历期和新羽化的成虫体重的ー种或多种。
8.根据权利要求I所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的測定方法，其特征在于，该方法以含有机化合物蛋白酶抑制剂E-64或无机化合物砷酸ニ氢钾的人工饲料作为生物测定阳性对照，以纯饲料处理作为阴性对照。
9.根据权利要求8所述的杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1)配制人工饲料母液；2)把需要检测的可溶性化合物溶解于适量的蒸馏水或溶液中；3)把毒性化合物溶液混入人工饲料母液，用蒸馏水定容至需要的浓度；4) 同样根据前三个步骤配制含一定浓度有机化合物蛋白酶抑制剂E-64或无机化合物砷酸二氢钾的人工饲料作为生物测定阳性对照；5)纯饲料处理作为阴性对照；将初孵灰飞虱若虫单头接入饲养容器中，每个处理设25个以上重复，饲料1-3天更换一次，观察记录灰飞虱生长发育情况，评价各处理对灰飞虱的潜在毒性。
全文摘要
本发明提供了杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性的测定方法，其首先确立了对灰飞虱毒性测定体系有效的人工饲料，发展了把不同有机或无机杀虫化合物加入人工饲料的技术和方法，筛选了适合可用于测定体系的阳性对照化合物(蛋白酶抑制剂E-64或无机化合物砷酸二氢钾PA)，经试验研究提出了适合的灰飞虱毒性影响评价指标，并利用E-64和PA作为模式化合物，通过剂量反应生测试验验证了所建立灰飞虱毒性测定方法的有效性和敏感性，最终建立了系统、敏感的评价杀虫化合物对灰飞虱潜在毒性影响的测定方法。本发明可以用于评价转基因抗虫作物表达的外源杀虫蛋白对灰飞虱的潜在毒性、筛选对灰飞虱具有抗性的新型杀虫蛋白基因、也可用于测定不同杀虫剂对灰飞虱的潜在影响。
文档编号G01N33/50GK102608307SQ20121006388
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者刘泽文, 彭于发, 李云河, 林克剑, 王增霞 申请人:中国农业科学院植物保护研究所