专利名称：检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法
技术领域：
本发明涉及检测领域，特别涉及检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法。
背景技术：
白藜芦醇是广泛存在于葡萄、花生、虎杖、何首乌等多种天然食物和药物中的植物化学物，具有显著的降血脂、心血管保护、抗肿瘤、减肥、抗炎、抗衰老、保肝作用。美国已经上市了以白藜芦醇为主要成分的多种保健食品或膳食补充剂，例如Longevity 抗衰老保健食品。以白藜芦醇为先导化合物开发的抗肿瘤、抗心血管疾病、抗老年痴呆药物也已成功筛选，部分药物已进入临床试验，具有良好的应用前景。然而，白藜芦醇多种生物学效应 的分子机制尚未完全阐明，细胞内作用靶点也不明确，现有的研究证实与白藜芦醇与细胞内多种大分子(蛋白质、核酸、糖蛋白等)的相互作用密切相关，相关分子机制有待进一步研究。因此，通过一定的技术手段明确白藜芦醇在不同靶细胞的生物利用和亚细胞定位有助于阐明其作用靶点和作用机制。何卉等人报道了关于白藜芦醇在肠道的吸收情况，利用高效液相色谱法测定不同时间白藜芦醇在肠道中的浓度(何卉，陈西敬，王广基等；药物转运体在反式白藜芦醇肠道吸收中的作用.中国药科大学学报.2008,39 (4) :324 - 328)。高欣等人研究了白藜芦醇在体内的药代动力学参数，包括血浆峰浓度、半衰期、尿液代谢物浓度等(高欣，谢文利，朱江等.纳米级白藜芦醇和白藜芦醇￠-环糊精包合物生物利用度的比较研究.中草药，2011，42 (5) :966-968)。Gester等人采用放射性核素(18F)或荧光探针标记白藜芦醇的方法检测其在肠道上皮的转运特点(Gester S, Wuest F, PawelkeB， Bergmann R， Pietzsch J. Synthesis and biodistribution of an 18F_labelledresveratrol derivative for small animal positron emission tomography. AminoAcids. 2005 Dec ；29(4) :415_28)，这些方法可以用于检测白藜芦醇在肠道的吸收情况和跨膜转运特点，但检测周期长、标记费用高、存在人体放射危害，且常规实验室不易开展。因此，急需一种检测白藜芦醇细胞内定位的方法，以进一步研究白藜芦醇在不同靶细胞的作用靶点和作用机制。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法，其检测方法简单，检测周期短，不存在放射危害。为实现上述发明目的，技术方案为
检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法，包括以下步骤
a.将靶细胞用浓度为I 40ii M的白藜芦醇处理，得白藜芦醇处理靶细胞；
b.将步骤a所得白藜芦醇处理靶细胞加入细胞器探针，得细胞器探针标记的靶细胞；
c.将步骤b所得细胞器探针标记的靶细胞在激光共聚焦显微镜观察白藜芦醇与细胞器探针的荧光位置，根据荧光重叠情况确定白藜芦醇在靶细胞的定位。优选的，所述步骤a是将靶细胞加入浓度为I 40iiM白藜芦醇中，在温度为37°C、100%饱和湿度，体积分数为5%的CO2培养箱培养至少I小时。本发明中的方法可以用于检测哺乳动物的任何细胞，优选的靶细胞为血管内皮细胞，肝细胞或肿瘤细胞。
本发明中使用的细胞器探针可以根据检测的细胞器不同选择细胞生物学上可接受的探针，优选的细胞器探针为细胞膜突光探针、线粒体突光探针或细胞核突光探针。更优选的，所述细胞膜荧光探针为细胞膜红色荧光探针(1，I’ -dioctadecyl-3, 3，3’，3’ -tetramethylindocarbocyanine perchlorate, Dil探针)，所述线粒体突光探针为线粒体膜电位突光探针(5，5' ,6,6' -Tetrachloro-I, ,3,3' -tetraethyl-imidacarbocyanineiodide 5, 5' ,6,6' -Tetrachloro-l, I' ,3,3' -tetraethylbenzimidazolocarbocyanine iodide CBIC2(3)，JC-1)，所述细胞核荧光探针为标记细胞DNA的荧光探针(PropidiumIodide, PI)o优选的，所述步骤c中白藜芦醇激发波长为322nm，接收波长为350 500nm条件下检测。更优选的，所述接收波长为405nm。本方法的有益效果在于本发明公开了检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法，利用了白藜芦醇的自发荧光特性，并结合特异性荧光标记的细胞器探针，运用激光共聚焦显微镜检测不同靶细胞中白藜芦醇和细胞器探针的亚细胞分布，根据荧光重叠情况确定白藜芦醇在靶细胞中的亚细胞分布，为进一步研究白藜芦醇的细胞内作用靶点和作用机制奠定了基础。
图I为本发明白藜芦醇分子结构图。图2为本发明白藜芦醇自发荧光的激发和吸收波谱全波长扫描图。图3为本发明白藜芦醇在人脐静脉内皮细胞的定位检测图。图4为本发明白藜芦醇在人脐静脉内皮细胞的细胞膜定位检测图。图5为本发明白藜芦醇人脐静脉内皮细胞线粒体定位检测图。图6为本发明白藜芦醇在人脐静脉内皮细胞细胞核定位检测图。图7为本发明白藜芦醇在肝细胞的定位检测图。图8为本发明白藜芦醇在肝细胞的细胞膜定位检测图。图9为本发明白藜芦醇在肝细胞线粒体定位检测图。图10为本发明白藜芦醇在肝细胞细胞核检测图。图11为本发明白藜芦醇在乳腺癌细胞的定位检测图。图12为本发明白藜芦醇在乳腺癌细胞的细胞膜定位检测图。图13为本发明白藜芦醇在乳腺癌细胞线粒体定位检测图。图14为本发明白藜芦醇在乳腺癌细胞细胞核定位检测图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本方法主要利用白藜芦醇的自发荧光特性，运用激光共聚焦显微镜检查白藜芦醇在不同靶组织的定位分布特点。白藜芦醇的分子结构如图I所示，对白藜芦醇全波长扫描结果如图2所示。实施例I、激光共聚焦显微镜检测白藜芦醇在人脐静脉内皮细胞的定位
取人脐静脉内皮细胞至活细胞培养皿中，向培养基中加入白藜芦醇至白藜芦醇的终浓度为20 u M，然后在温度为37°C、100%饱和湿度，体积分数为5%的CO2培养箱中处理I小时，得白藜芦醇处理的人脐静脉内皮细胞；将所得白藜芦醇预处理的内皮细胞加入细胞膜红色突光探针(1，I' -dioctadecyl-3, 3, 3' , 3' -tetramethylindocarbocyanine perchlorate,Dil)(购自碧云天生物技术有限公司)，用DMSO溶解，至终浓度为IOiiM,在温度为25°C条件下处理5分钟；在激发波长为322nm，接收波长为397nm条件下检测白藜芦醇荧光位点，·结果如图3所示。同时在激发波长为549nm，发射波长为565nm条件下检测Dil的发光位置，结果如图4所示。由图3可知，20 ii M白藜芦醇处理内皮细胞I小时后能够检测到白藜芦醇的蓝色荧光。由图4可知，红色荧光与蓝色荧光有部分重叠，表明白藜芦醇在人脐静脉内皮细胞的细胞膜存在少量分布。将白藜芦醇预处理的人脐静脉内皮细胞加入线粒体荧光探针JC-1(购自碧云天生物技术有限公司)，用DMSO溶解至终浓度为5mg/mL，在温度为25°C条件下处理30分钟；在激发波长为322nm，最大接收波长为405nm条件下检测白藜芦醇发光位点，同时在激发波长为514nm，发射波长为585nm条件下检测JC-1的发光位置，结果如图5所示。由图5可知，红色点状荧光所示为JC-I的位置，与白藜芦醇的蓝色荧光少量重叠，表明白藜芦醇能分布在人脐静脉内皮细胞的线粒体中。将白藜芦醇预处理的人脐静脉内皮细胞加入细胞核荧光探针，具体为细胞DNA的荧光探针PI (购自Sigma公司)，用DMSO溶解至终浓度为lmg/mL，在温度为4°C条件下处理10分钟；在激发波长为322nm，最大接收波长为500nm条件下检测白藜芦醇发光位置，同时在激发波长为540nm，发射波长为600nm条件下检测PI的发光位置，结果如图6所示。由图6可知,红色荧光所示为细胞核荧光探针的位置,无蓝色荧光存在,表明白藜芦醇不能定位于人脐静脉内皮细胞的细胞核内。综上所述，白藜芦醇在人脐静脉内皮细胞中主要定位于内皮细胞的细胞浆，在细胞膜和线粒体中有少量分布，在细胞核中未见分布。实施例2、激光共聚焦显微镜检测白藜芦醇在肝细胞定位
取肝细胞H印G2至活细胞培养皿中培养，向培养基中加入白藜芦醇至白藜芦醇的终浓度为I U M，然后在温度为37°C、100%饱和湿度，体积分数为5%的CO2培养箱中处理I. 5小时，得白藜芦醇处理的肝细胞；将所得白藜芦醇预处理的肝细胞加入细胞膜红色荧光探针Dil (购自碧云天生物技术有限公司)，用DMSO溶解至终浓度为5 PM，在温度为25°C条件下处理20分钟；在激发波长为322nm，接收波长为350nm条件下检测白藜芦醇发光位点，结果如图7所示；同时在激发波长为549nm，发射波长为565nm条件下检测Dil的发光位置，结果如图8所示。由图7可知，I u M白藜芦醇处理肝细胞I. 5小时后能够检测到白藜芦醇的蓝色荧光。由图8可知，细胞膜红色荧光探针的红色荧光与蓝色荧光有部分重叠，表明白藜芦醇在细胞膜有分布。将白藜芦醇预处理的肝细胞加入线粒体荧光探针JC-I (购自碧云天生物技术有限公司)，用DMSO溶解至终浓度为5mg/mL，在温度为25°C条件下处理60分钟；在激发波长为322nm，接收波长为400nm条件下检测白藜芦醇发光位点，同时在激发波长为514nm，发射波长为585nm条件下检测JC-I的发光位置，结果如图9所示。由图9所示，红色点状荧光所示为线粒体，蓝色荧光为白藜芦醇，可见两种荧光存在少量重叠，表明在肝细胞的线粒体有白藜芦醇分布。将白藜芦醇预处理的肝细胞加入细胞核荧光探针,具体为细胞DNA的荧光探针PI(购自Sigma公司)，用DMSO溶解至终浓度为lmg/mL，在温度为4°C条件下处理5分钟；在 激发波长为322nm，接收波长为405nm条件下检测白藜芦醇发光位点，同时在激发波长为540nm，发射波长为600nm条件下检测PI的发光位置，结果如图10所示。由图10可知，红色荧光示细胞核，与白藜芦醇的蓝色荧光无重叠，表明白藜芦醇在肝细胞的细胞核无分布。综上所述，白藜芦醇在肝细胞IfepG2中主要定位于细胞浆，在细胞膜和线粒体存在少量分布，在细胞核中无分布。实施例3、激光共聚焦显微镜检测白藜芦醇在乳腺癌细胞的定位
取乳腺癌细胞MDA-MB-231至活细胞培养皿中培养，向培养基中加入白藜芦醇至白藜芦醇的终浓度为40 u M,然后在温度为37°C、100%饱和湿度，体积分数为5%的CO2培养箱中处理2小时，得白藜芦醇处理的肿瘤细胞；将所得白藜芦醇处理的乳腺癌细胞加入细胞膜红色荧光探针Dil (购自碧云天生物技术有限公司)，用DMSO溶解至终浓度为8 u M，在温度为25°C条件下处理10分钟；在激发波长为322nm，接收波长为500nm条件下检测白藜芦醇发光位点，结果如图11所示；同时在激发波长为549nm，发射波长为565nm条件下检测细胞膜荧光探针Dil的发光位置结果如图12所示。由图11可知，40 白藜芦醇处理乳腺癌细胞2小时后能够检测到白藜芦醇的蓝色荧光。由图12可知，所示红色荧光标记的细胞膜，与白藜芦醇的蓝色荧光有少部分重叠，表明白藜芦醇在乳腺癌细胞膜有分布。将白藜芦醇处理的肿瘤细胞加入线粒体荧光探针JC-I (购自碧云天生物技术有限公司)，用DMSO溶解至浓度为5mg/mL，在温度为25°C条件下处理45分钟；在激发波长为322nm，接收波长为500nm条件下检测白藜芦醇发光位点，同时在激发波长为514nm，发射波长为585nm条件下检测JC-I的发光位置，结果如图13所示，红色点状荧光所示为线粒体，蓝色荧光为白藜芦醇，可见两种荧光存在较多重叠，表明白藜芦醇在乳腺癌细胞中存在分布。将白藜芦醇处理的肿瘤细胞加入细胞核荧光探针，具体为细胞DNA的荧光探针PI(购自Sigma公司)，用DMSO溶解至终浓度为lmg/mL，在温度为4°C条件下处理8分钟；在激发波长为322nm，接收波长为500nm条件下检测白藜芦醇发光位点，同时在激发波长为540nm，发射波长为600nm条件下检测PI的发光位置，结果如图14所示。由图14可知，由红色荧光显示的细胞核，与白藜芦醇的蓝色荧光明显无重叠，表明白藜芦醇在乳腺癌细胞核中无分布。综上所述，白藜芦醇在乳腺癌细胞中主要定位于细胞膜和线粒体上，在细胞膜上有少量分布，而在细胞核中无分布。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
1.检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法，其特征在于，包括以下步骤 a.将靶细胞用浓度为I 40μ M的白藜芦醇处理，得白藜芦醇处理靶细胞； b.将步骤a所得白藜芦醇处理靶细胞加入细胞器探针，得细胞器探针标记的靶细胞； c.将步骤b所得细胞器探针标记的靶细胞在激光共聚焦显微镜观察白藜芦醇与细胞器探针的荧光位置，根据荧光重叠情况确定白藜芦醇在靶细胞的定位。
2.根据权利要求I所述检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法，其特征在于所述步骤a是将靶细胞加入浓度为I 40 μ M白藜芦醇中，在温度为37°C、100%饱和湿度，体积分数为5%的CO2培养箱培养至少I小时。
3.根据权利要求I所述检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法，其特征在于所述靶细胞为血管内皮细胞，肝细胞或肿瘤细胞。
4.根据权利要求I所述检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法，其特征在于所述步骤b中，所述细胞器探针为细胞膜荧光探针、线粒体荧光探针或细胞核荧光探针。
5.根据权利权利要求4所述检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法，其特征在于所述细胞膜荧光探针为细胞膜红色荧光探针，所述线粒体荧光探针为线粒体膜电位荧光探针，所述细胞核荧光探针为标记细胞DNA的荧光探针。
6.根据权利要求5所述检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法，其特征在于所述步骤c中白藜芦醇激发波长为322nm，接收波长为350 500nm条件下检测。
7.根据权利要求6所述检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法，其特征在于所述接收波长为405nm。
全文摘要
本发明公开了检测白藜芦醇在靶细胞定位的方法，具体为，利用白藜芦醇的自发荧光特性，首先用白藜芦醇预处理靶细胞；再利用的特异性荧光标记的亚细胞器探针处理靶细胞；最后利用激光共聚焦显微镜观察白藜芦醇自发荧光与亚细胞器探针的荧光在细胞内的重叠情况，以确定白藜芦醇在靶细胞的亚细胞器分布；利用本发明公开的方法可以用于检测白藜芦醇在靶细胞中的分布，具有广泛的应用前景。
文档编号G01N21/64GK102680446SQ20121016584
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者易龙, 糜漫天, 金鑫, 陈明亮 申请人:中国人民解放军第三军医大学