一种用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物川续断皂苷Ⅵ代谢的新方法

专利名称：一种用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物川续断皂苷Ⅵ代谢的新方法
技术领域：
本发明涉及一类化合物的代谢研究方法，具体涉及一种用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物川续断皂苷VI代谢的新方法。
背景技术：
糖苷类化合物常指苷元与糖结合成的苷类化合物，如皂苷、黄酮苷等，是重要的天然产物，广泛分布于植物中，具有重要的生物活性，如保护心血管系统、抗菌及抗病毒、抗肿瘤活性、抗炎、抗氧化、保肝、补肾壮骨等活性，糖苷类化合物在体内通常经体内胃肠道菌群作用脱去糖基，转化成次糖苷甚至是苷元，提高活性同时提高生物利用度。药物代谢通常分为I相代谢(氧化、还原、水解等)和II相代谢(结合反应)，糖
苷化合物的的主要代谢途径为脱糖基的水解反应，此类反应通常由胃肠道菌群介导。研究方法亦采用常见的药物代谢研究方法体内实验法和体外实验法。体内实验法动物给药后，在一定时间内将动物处死，取消化道各部分内容物进行分析，并检查血液、尿、粪便、胆汁，检测代谢物的结构变化，研究药物的代谢转化，并推断其在消化道内的代谢过程。体内代谢试验能客观的反应药物在体内的转化，但一般药物用量较大，不利于少量药物的快速代谢研究；有些体内成分含量低微，即使采用现代分析手段有时也难以满足体内复杂体系的检测需求，而加大药量或进一步富集、纯化样本等手段对结果的改善也是有限的；体内代谢劳动强度相对较大，常需多人合作完成。体外实验法胃肠道菌群代谢粪便温孵法和离体消化道内容物温孵法是研究药物在消化道内脱糖基水解代谢的方法。许多中药成分是在消化道菌丛作用下代谢的，特别是肠道内细菌的苷键水解酶或人的粪便悬浮液与药物在厌氧条件下温孵，检查原型成分及其代谢物的种类和含量，是研究肠内菌对药物代谢的有效方法。体外实验法虽然较有效的模拟了药物在体内代谢的不同环节，有益于富增、制备代谢产物，但脱离了完整的代谢体系对药物的作用，难以体现在体代谢的综合结果；体外实验条件要求相对较高，需保证肠菌的活性，一般实验室难以进行。因此，建立一种既能体现在体代谢的综合效应，又能实现条件简单，低劳动强度，化合物用量少的高通量代谢研究方法具有重要意义。斑马鱼是一种极好的模式生物，是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜，所需空间场地不大，易于室内大规模繁殖。成体鱼长3 4cm，养殖成本仅为养小鼠的O.斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠相当，且在蛋白质水平上，其关键部位的同源性几乎是100%，所以可用斑马鱼模拟人类疾病[P. Goldsmith, Curr Opin Pharmacol, 4, 504-12 (2004)]。目前，人们已成功的用斑马鱼建立许多人类疾病模型，如神经系统、循环系统、听觉、视觉、癌症等方面的疾病[S. Sumanasand S.Lin，DDT :TARGETS，3，89-96 (2004) ·]。如中国专利 200810019040. 5 公开了一种用斑马鱼研究药物毒性的方法；专利200780051025. 2公开了一种通过干细胞营养进行的器官的形成和以及酒精损伤器官的再生方法，200310108710. 8公开了利用斑马鱼基因治疗截瘫等疾病；我们在201010258459. 3公开了利用斑马鱼研究丹参中丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I相代谢的新方法，发现丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I的羟基化和脱氢反应的I相代谢产物，此方法建立系根据斑马鱼具有药物代谢的细胞色素P450s相关酶系目前已克隆到的斑马鱼P450s基因主要包括CyplA、Cyp2K6、Cyp3a65和Cyp3Cl、CypllaUCyp 19, Cyp26Al、Cyp26Bl和Cyp26Dl几个家族的成员，它们与人类相应基因的同源性约为40% 73% [P. Collodi, C. L. Miranda, X. Zhao, D. R. Buhler, D. ff. Barnes. Xenobiotica,24 (6), 487-493 (1994)] o近年研究表明，斑马鱼尚具有II相代谢酶[Y. Morcillo,G. Janer.S. C. Μ. O’ Hara, D. R. Livingstone, C. Porte. Environmental Toxicology and Chemistry,23 (4), 990-996 (2004) ；D. V. Almeida, B. F. Nornberg, L. A. Geracitano, D. M. Barros,J. M. Monserrat, L. F. Marins. Fish Physiol Biochem. 36(3) :347-53(2010)],我们在201210187191. 8公开了利用斑马鱼研究黄酮化合物白杨素、5-羟基黄酮和7-羟基黄酮的II相代谢，发现它们的葡萄糖醛酸结合物和硫酸结合物的II相代谢产物；此外斑马鱼还具有肠道菌群[吕爱军，杨正行，刘欢，胡秀彩，张艳华，程超.中国农学通报，2010，26 (24)412-415]，这类菌群能否使糖苷类化合物发生与哺乳动物肠道菌群类似的脱糖基水解反
应，国内在这方面的研究尚属空白。

发明内容
发明目的本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作方便、成本低、化合物用量少、劳动强度低，且仅需在一般实验室就可进行的快速模式生物斑马鱼研究药物如糖苷化合物川续断皂苷VI脱糖基代谢的新方法。技术方案为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为—种用模式生物斑马鱼研究药物如糖苷化合物川续断皂苷VI脱糖基代谢的新方法，它包括以下步骤(I)取斑马鱼的成体鱼放入盛有水的容器里，分为空白溶剂组、空白鱼组、空白糖苷化合物组和糖苷化合物鱼组，空白鱼组和糖苷化合物鱼组斑马鱼数量相等，将受试糖苷化合物配成所需浓度，加入到糖苷化合物鱼组的水溶液中，空白鱼组加入等量的溶媒，空白溶剂组只加等量溶媒不放斑马鱼、空白糖苷化合物组加溶媒溶解的等量糖苷化合物不放斑马鱼，在糖苷化合物鱼组的斑马鱼暴露于药液后Oh 48h，在不同时间点取鱼药液，于_70°C冰箱放置；在末次取鱼药液24h或48h时间点将鱼取出，用纯净水迅速洗涤2 3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于-70 0C冰箱放置，空白溶剂组、空白鱼组和空白糖苷化合物组于0h、24h或48h时同法取样，备用；(2)取步骤(I)得到的各时间点鱼药液冷冻干燥或用氮气、空气吹干，残渣加适量50% -100%甲醇或乙腈溶解，过0. 45μπι或0. 22 μ m滤膜或15000转/min离心10 20min,取滤液或上清液进行高效液相色谱HPLC分析或高效液相色谱与质谱联用LC-MS分析；取24h或48h时间点斑马鱼鱼体剪碎，称重，匀浆，匀浆液加甲醇或乙腈除蛋白，3000 4000转/min离心10 20min取上清，上清液用氮气或空气吹干，残渣加50% 100%甲醇溶解，过0. 45 μ m或0. 22 μ m滤膜或约15000转/min离心10 20min,滤液或上清液进行HPLC分析或HPLC-MS分析。作为优选方案，以上所述的用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物代谢的新方法，其中步骤(I)中的空白溶剂组、空白鱼组、空白糖苷化合物组和糖苷化合物鱼组均平行设3个组，保证实验的科学性。作为优选方案，以上所述的用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物代谢的新方法，步骤⑴中糖苷化合物鱼组的斑马鱼暴露于药液后0h，3h，6h，9h，12h，18h，24h时间点取鱼药液，必要时可将取样时间延长至48h。采用连续时间间隔点取样可以充分明确药物的代谢方式和代谢特点，为指导药物的临床用药和药物剂型的选择提供科学依据。作为优选方案， 其中步骤(I)所述的溶媒为水或者是含有O 1%二甲基亚砜助溶剂的水溶液。对于水溶性较差的药物，采用二甲基亚砜助溶，可以有效提高药物的水溶性，使药物均匀分散于水溶中。作为优选方案，以上所述的用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物代谢的新方法，步骤(2)根据被分析药物的性质，根据相似相溶原则选择溶剂溶解受试药物，如药液残渣加50% -100%甲醇或乙腈溶解，斑马鱼鱼体剪碎，称重，匀浆，匀浆液加甲醇或乙腈除蛋白，离心取上清液，氮气或空气吹干，残渣加50% -100%甲醇或乙腈溶解。本发明考察了将药液减压回收至干、直接冷冻干燥及氮气或空气吹干三种方法，结果表明将药液直接冻干或氮气、空气吹干可最大限度的减少样品处理过程的损失及误差，实验结果更准确，因此步骤(2)优选将各时间点鱼药液冷冻干燥或氮气、空气吹干，50% -100%甲醇或乙腈溶解干燥残渣，然后过滤或离心处理，上清液进行高效液相色谱HPLC分析或高效液相色谱与质谱联用LC-MS分析。本发明所述的用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物川续断皂苷VI代谢的新方法，其中步骤(2)采用Agilent 1100型系列高效液相色谱仪或采用灵敏度高的WatersAlliance 2695-ZQ2000高效液相色谱-质谱联用仪来测定斑马鱼水溶液中糖苷化合物及代谢物和斑马鱼体内组织中糖苷化合物及代谢物的含量和结构的变化情况。作为优选方案，本发明所述的用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物川续断皂苷VI代谢的新方法，筛选的受试药物可为黄酮苷、皂苷及其它能发生脱糖基水解代谢反应的化合物等。如川续断皂苷VI。续断为川续断科植物川续断(Dipsacus asper Wall, ex Henry)的干燥根,具补肝肾，强筋骨，续折伤之功效。现代研究表明续断主要活性成分为皂苷类成分，其中川续断皂苷VI是主要活性三糖皂苷，具有促进骨折愈合，防治骨质疏松，促进成骨细胞生成，及抗癌等活性。因此研究川续断皂苷VI的代谢情况，可以有效了解糖苷类化合物的体内代谢情况。与小鼠、大鼠、犬等哺乳动物不同，斑马鱼的体积较小，口服或注射给药方式很困难，因此，步骤(I)中本发明将受试药物溶解于斑马鱼所生活的水中，斑马鱼会自主连续的从溶液中吸收受试药物并在体内进行代谢，药物的代谢物也会随着斑马鱼的排泄物被连续的排到水中，这样就可通过分析溶液中药液成分的变化来掌握药物的部分代谢信息；斑马鱼成体鱼长约3 4cm，其体内血液量极微量，难以实现采血，通过取血来分析血样的可行性存在问题，而对整体鱼内成分进行分析也能掌握药物在鱼体内的变化情况，这样，就能通过定时取样分析药物在斑马鱼体内及体外的变化规律来较为全面的探索斑马鱼对药物的代谢情况，此法简单可行。
有益效果本发明提供的用模式生物斑马鱼研究糖苷类化合物代谢的新方法和现有技术相比具有以下优点本发明提供的用模式生物斑马鱼研究糖苷类化合物代谢的新方法，选用斑马鱼作为药物代谢研究的对象，通过优化的实验分组方法，保证实验结果的准确性，尤其是对药物给药方式的优选、药物经斑马鱼代谢后提取方法和分析方法的优选，整个实验方法可操作性强，能客观的反应药物在体内的真实代谢情况，实验结果准确度高，能克服一般体外肠道菌群代谢实验条件苛刻，且难以体现在体代谢综合结果的缺点，且能克服一般哺乳动物体内代谢实验所用药量大、劳动强度大的缺点，且实验方法可重复性强，尤其是所需受试药物量少，成本低，劳动强度低，应用范围广泛，且可成批量进行实验研究，工作效率高。


图I为川续断皂苷VI药液经斑马鱼作用24h时的药液与鱼体总离子流2为川续断皂苷VI药液经斑马鱼作用24h时的川续断皂苷VI与其代谢产物的
提取离子流图。图3为川续断皂苷VI的正离子模式质谱图。图4为川续断皂苷VI的负离子模式质谱图。图5为川续断皂苷VI经斑马鱼代谢后脱I分子阿拉伯糖基产物BMl的质谱图。图6为川续断皂苷VI经斑马鱼代谢后脱I分子葡萄糖基产物BM2的质谱图。图7为川续断皂苷VI经斑马鱼代谢后脱I分子阿拉伯糖基和I分子葡萄糖基产物BM3的质谱图。图8为川续断皂苷VI经斑马鱼代谢后脱2分子葡萄糖基产物BM4的质谱图。图9为川续断皂苷VI经斑马鱼代谢后脱I分子阿拉伯糖基和2分子葡萄糖基产物BM5的质谱图。图10为川续断皂苷VI经斑马鱼代谢后羟基化产物BM6的质谱图。图11为大鼠口服川续断皂苷VI后大鼠胆汁、血液、尿液和粪便的总离子流图。图12为大鼠口服川续断皂苷VI后在大鼠体内的川续断皂苷VI与其代谢产物的提取离子流图。图13为川续断皂苷VI经大鼠代谢后脱I分子阿拉伯糖基产物RMl的质谱图。图14为川续断皂苷VI经大鼠代谢后脱I分子葡萄糖基产物RM2的质谱图。图15为川续断皂苷VI经大鼠代谢后脱I分子阿拉伯糖基和I分子葡萄糖基产物RM3的质谱图。图16为川续断皂苷VI经大鼠代谢后脱2分子葡萄糖基产物RM4的质谱图。图17为川续断皂苷VI经大鼠代谢后脱I分子阿拉伯糖基和2分子葡萄糖基产物RM5的质谱图。图18为川续断皂苷VI经大鼠代谢后羟基化产物RM6的质谱图。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例一用模式生物斑马鱼研究川续断皂苷VI的代谢I.材料与仪器受试药物川续断阜苷VI (Asperosaponin VI)配制方法称取相当于川续断阜苷VI3 4mg溶于Iml 二甲亚砜(DMSO)中，力口250ml乐百氏纯净水，摇匀。动物斑马鱼，由南京大学模式生物研究所提供。试剂乙腈、甲酸为色谱纯(德国,Merck公司)，二甲基亚砜(DMS0，国药集团化学试剂有限公司)，超纯水乐百氏纯净水。仪器Agilent 1100型系列高效液相色谱仪，包括G1311A四元梯度泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B DAD检测器；Chemstation 6. 01色谱工作站(美国，Agilent公司)。Waters Alliance 2695-ZQ 2000液相色谱-质谱联用仪,包括双高压泵，自动进样器，柱温箱，电喷雾离子化接口，2695型液相色谱仪，Masslynx 4. O色谱工作站(美国，Waters 公司)。METTLER TOLEDO AB I35-S 分析天平(瑞士，METTLER TOLEDO 公司)，KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。LABC0NC0冷冻干燥机(美国，LABC0NC0公司)，TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。2.实验方法2. I给药与取样方法取斑马鱼,分别置于含有30mL溶液的棕色瓶中，平均分成2组,每组5条鱼。其中I组为0. 4% DMSO纯净水(空白鱼组)，另一组为川续断皂苷VI的0. 4% DMSO纯净水溶液(药物鱼组)。同时设空白溶剂组(0. 4% DMSO纯净水)和空白药物组(0. 4% DMSO川续断皂苷VI纯净水溶液)。药物鱼组分别于斑马鱼暴露药液后0h，3h，6h，9h，12h，18h，24h时间点每条鱼取药液0. 4ml，各时间点药液分别混合，于-70°C冰箱放置。于末次取样时间点24h同时将鱼取出，用纯净水迅速洗涤3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于_70°C冰箱放置(平行3次实验)。空白溶剂组，空白鱼组和空白药物组于0h，24h时同法取样。2. 2样品处理药液处理将不同时间点鱼药液各2mL，冷冻干燥，残渣加0. 5mL90%甲醇溶解，过0. 22 μ m滤膜，滤液进样20 μ L进行HPLC-MS分析。斑马鱼体处理取24h时斑马鱼平行组间混合，剪碎,称取Ig,加5mL生理盐水匀衆,3500r/min离心IOmin,上清液加4倍量甲醇润旋混勻除蛋白，3500r/min离心IOmin,上清液氮气吹干，残渣加lmL90%甲醇溶解制成Ig鱼/mL的溶液，过0. 22 μ m滤膜，滤液进样20 μ L进行HPLC-MS分析。2. 3分析条件液相条件AgilentC18 柱(5 μ m, 150mmX4. 6mm)和 C18 预柱(4. 6X12. 5mm, ID5ym);柱温25°C;流动相Α为乐百氏纯净水(与质谱联用时改为0.05%甲酸水)，Β为乙腈(与质谱联用时改为0. 05%甲酸乙腈)，Α十B= 100%，采用梯度洗脱0 12min，25 27% B, 12 30min，27 50% B, 30 40min，50 80% B, 40 45min，80 90% B, 45 50min,90% B ;流速1. OmL/min ;全波长扫描检测；记录时间50min ;进样量为20 μ L0质谱条件毛细管电压2. 50kV,锥孔电压35V，干燥气流速320L/h，离子源温度120°C，辅助气温度350°C ;离子检测方式全扫描检测(SCAN)，离子极性正离子(positive)和负离子(positive)同时检测,提取离子流(TIC) [M-H]-, [M+HCOO]-, [M+H]+和[M+Na]+，离子化方式气动辅助电喷雾离子化(ESI)，扫描范围100-1200m/z。3.实验结果采用HPLC-MS法正、负离子模式同时检测川续断皂苷VI经斑马鱼作用后的代谢产物，其中负离子模式灵敏。如图I-图9所示，发现川续断皂苷VI经斑马鱼作用后的主要代谢路径为脱糖基反应，检测到24h内川续断 皂苷VI斑马鱼药液或斑马鱼体内中的川续断皂苷VI原形成分及川续断皂苷VI的5个脱糖基代谢产物(BMl BM5)(具体实验结果见表I)。已有研究表明，大鼠口服川续断皂苷VI后，在大鼠粪便中检测到5个脱糖基代谢产物，这与斑马鱼作用的川续断皂苷VI脱糖基产物具一致性[LI Kai，YANG Xiao-Lin, ZHANGChun-Feng and YANG Zhong-Lin. Chin J Nat Med, 2009, 7 (6) :440-443.],此外，本研究还检测到川续断皂苷VI经斑马鱼作用后的I个羟基化的I相代谢产物(BM6)，羟基化反应通常由细胞色素P450s相关酶系介导，表明斑马鱼可反应在体动物模型综合的代谢结果。采用本发明提供的用模式生物斑马鱼研究川续断皂苷VI代谢实验结果全面、准确可靠，实验方法可行。表I川续断皂苷VI经斑马鱼作用后的代谢产物鉴定
tR负离了·模式iF离子模式I &外丨佳
代谢产物---——--- MW T； '代谢机制质谱图
(mm) [M-H]- [M+HCOO]— [M+H]+ [M+Na]+药液体内
川续断
14.4 927.86 973.88929.85 951.83 928 + +原形图 3,4
皂苷VI
BMl 20.53 795.89 841.23796 +脱 I 阿拉扪糖图 5
BM2 20.89 765.80 811.49766 +脱 I 葡萄糖图 6
脱I阿拉伯糖~
BM3 25.03679.39634 +图 7
和I葡萄糖
BM4 30.31 603.62 649.99604 +脱 2 葡萄糖图 8
脱I阿拉扪糖
BM5 34.38 470.7 517.00473.24 494.95 472+图 9
__和2葡萄糖 -
BM6 5.15 943,79 989.89944 +羟难化图 10实施例二用大鼠研究川续断皂苷VI的代谢现有川续断皂苷VI的在体哺乳动物代谢研究尚不全面，除了文献[LI Kai，YANGXiao-Lin,ZHANG Chun-Feng and YANG Zhong-Lin. Chin J Nat Med,2009,7(6) :440-443.]报导大鼠口服川续断皂苷VI后粪便中的代谢产物外，尚未见血浆、胆汁、尿液中的代谢产物分析，为了全面分析、比较斑马鱼与大鼠对川续断皂苷VI的代谢差异，我们对川续断皂苷VI在大鼠体内的代谢进行了系统研究。I.材料与仪器受试药物川续断皂苷VI化合物供试药配制称取川续断皂苷VI适量，加0. 8% CMC-Na配成IOmg · mL—1的溶液，供大鼠灌胃用。肝素购于江苏万邦生化医药股份有限公司，生理盐水(氯化钠注射液，南京小营药业集团有限公司，批号2010070203)。乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)、超纯水(Milli-Q)，乐百氏纯净水。其余试剂为分析纯。动物SD大鼠，体重200 300g。上海斯莱克实验动物有限责任公司。仪器WatersAlliance 2695-ZQ 2000 液相色谱-质谱联用仪(美国 Waters公司)，包括双高压泵，自动进样器，柱温箱，电喷雾离子化接口，2695型液相色谱仪，Masslynx 4. O色谱工作站。TGL-16G型高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；TDZ5B_WS低速自动平衡离心仪(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);XW-80A旋涡混合器(上海青浦泸西仪器厂器厂)；天平(1/10万，METTLER AB135-S型，梅特勒2托利多仪器有限公司)，OrganomationN-EVAPTM 112 氮吹仪(Organomation Associates, Jnc. USA)2.实验方法2. I给药方法和样品采集大鼠尿样取SD大鼠6只，3，体重200 300g，分为2组，每组3只大鼠，空白组和给药组。实验前禁食不禁水12小时。给药组单次灌胃IOOmg -kg^1川续断皂苷VI的O. 8%CMC-Na溶液，空白组给予等体积O. 8% CMC-Na水溶液。分别收集24小时尿液。置_70°C冰箱保存备用。大鼠粪便上述SD大鼠。收集24小时尿液同时，分别收集24小时内大鼠粪便。置-70°C冰箱保存备用。大鼠血浆上述SD大鼠在收集尿样和粪便同时，分别于给药后O. 5h、lh、2h、4h、6h，眼眶取血，置肝素试管中，充分混匀。3000r .HiirT1离心IOmin后取上清液，各时间点血浆分别合并，置_70°C冰箱中保存备用。大鼠胆汁上述SD大鼠经取血后饲养10天以上的恢复期。给药前禁食不禁水12小时，用乌来糖Ig^kg-1肌肉注射麻醉，腹部胆管插管手术。待大鼠清醒时分别灌胃给药和O. 8% CMC-Na水溶液，各药分别收集12h胆汁，置_70°C冰箱中冷冻保存备用。2. 2样品处理大鼠尿样、血浆、胆汁处理分别取大鼠各时间段混合尿液7mL、血浆I. 5mL或胆汁3mL,各加4倍甲醇，润旋混勻3min, 3000r · mirT1离心15min后取上清液，N2下40°C吹干,残渣分别加2. Om L，0. 8mL或I. 5mL70%甲醇溶解，13000r · mirT1离心15min后取上清液，进样20 μ L分析。大鼠空白尿液、血浆或胆汁同法处理。大鼠粪便处理各时间段粪便混合，用研钵研碎，称取I. 6g，加20mL 70%甲醇浸泡并超声30min，3000r .mirT1离心15min后取上清液，N2下40°C吹干，残渣加lmL70%甲醇溶解，15000r · mirT1离心15min后取上清液，进样20 μ L分析。大鼠空白粪同法处理。2. 3分析条件同实施例一。3.实验结果采用HPLC-MS法正、负离子模式同时检测川续断皂苷VI经大鼠作用后的血浆、尿液、胆汁和粪便中的代谢产物，其中负离子模式灵敏。如图11-图18所示，在血浆、尿液、胆汁和粪便中均检测到原形成分，脱糖基反应是川续断皂苷VI的主要代谢路径，检测到5种川续断皂苷VI脱糖基代谢产物(RMl RM5)，与文献报导的代谢产物一致[LI Kai,YANG Xiao-Lin, ZHANG Chun-Feng and YANG Zhong-Lin. Chin J Nat Med,2009,7 (6)440-443.]，这与实施例一的5种脱糖基产物一致。此外，首次在大鼠胆汁中发现川续断皂苷VI的I个羟基化产物，提示这种羟基化反应主要由肝微粒体细胞色素P450S酶系介导，这与实施例一中斑马鱼对川续断皂苷VI的羟基化反应具相似性(具体实验结果见表2)。大鼠代谢研究全面、系统的反应了川续断皂苷VI的体内综合代谢结果，且与斑马鱼对川续断皂苷VI的代谢具一致性。表2川续断皂苷VI经大鼠作用后的代谢产物鉴定
权利要求
1.一种用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物川续断皂苷VI脱糖基代谢的新方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)取斑马鱼的成体鱼放入盛有水的容器里，分为空白溶剂组、空白鱼组、空白糖苷化合物组和糖苷化合物鱼组，空白鱼组和糖苷化合物鱼组斑马鱼数量相等，将受试糖苷化合物配成所需浓度，加入到糖苷化合物鱼组的水溶液中，空白鱼组加入等量的溶媒，空白溶剂组只加等量溶媒不放斑马鱼、空白糖苷化合物组加溶媒溶解的等量糖苷化合物不放斑马鱼，在糖苷化合物鱼组的斑马鱼暴露于药液后Oh 48h，在不同时间点取鱼药液，于-70°c冰箱放置；在末次取鱼药液24h或48h时间点将鱼取出，用纯净水迅速洗涤2 3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于_70°C冰箱放置，空白溶剂组、空白鱼组和空白糖苷化合物组于0h、24h或48h时同法取样，备用； (2)取步骤(I)得到的各时间点鱼药液冷冻干燥或用氮气、空气吹干，残渣加适量50% -100%甲醇或乙腈溶解，过O. 45 μ m或O. 22 μ m滤膜或15000转/min离心10 20min,取滤液或上清液进行高效液相色谱HPLC分析或高效液相色谱与质谱联用LC-MS分析；取24h或48h时间点斑马鱼鱼体剪碎，称重，匀浆，匀浆液加甲醇或乙腈除蛋白，3000 4000转/min离心10 20min取上清；上清液用氮气或空气吹干,残洛加50% 100%甲醇溶解，过O. 45 μ m或O. 22 μ m滤膜或约15000转/min离心10 20min,滤液或上清液进行HPLC分析或HPLC-MS分析。
2.根据权利要求I所述的用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物代谢的新方法，其特征在于， 所述的高效液相色谱与质谱联用HPLC-MS分析条件为液相条件规格为 5 μ m, 150mmX 4. 6mm 的 Agilent C18 柱和规格为 4. 6 X 12. 5mm, ID5 μ m的C18预柱；柱温25°C ;流动相A为O O. I %甲酸水，B为O O. I %甲酸乙腈，A十B=100%，采用梯度洗脱0 12min，25 27% B, 12 30min，27 50% B, 30 40min，50 80% B, 40 45min，80 90% B，45 50min，90% B ;流速1. OmL/min ;全波长扫描检测；记录时间50min ;进样量为20 μ L ; 质谱条件毛细管电压2. 50kV，锥孔电压35V，干燥气流速320L/h，离子源温度120°C，辅助气温度350°C ;离子检测方式全扫描检测，离子极性正离子和负离子同时检测，离子化方式气动辅助电喷雾离子化，扫描范围100-1200m/z。
3.根据权利要求I所述的用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物代谢的新方法，其特征在于，步骤(I)中糖苷化合物鱼组的斑马鱼暴露于药液后011，311，611，911，1211，1811，2411或4811时间点取鱼药液，在末次取药液时间点24h或48h时同时取鱼体。
4.根据权利要求I所述的用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物川续断皂苷VI代谢的新方法，其特征在于，步骤(I)所述的溶媒为水或者是含有O 1%二甲基亚砜助溶剂的水溶液。
5.根据权利要求I所述的用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物代谢的新方法，其特征在于，所述的糖苷化合物为川续断皂苷VI。
全文摘要
本发明公开了用模式生物斑马鱼研究糖苷化合物川续断皂苷VI脱糖基代谢的新方法，该方法通过选用斑马鱼作为药物代谢研究的对象，通过优化的实验分组方法进行实验分组设计，采用优选的药物给药方式进行给药，并采用优选的方法提取经斑马鱼代谢后的川续断皂苷VI代谢物，尤其采用优选的分析方法对代谢物进行分析，整个实验方法可操作性强，能客观的反应药物特别是糖苷化合物川续断皂苷VI在体内真实的脱糖基代谢情况，此外还发现川续断皂苷VI的羟基化代谢，实验结果准确度高，能克服一般体外代谢实验难以体现在体代谢综合结果的缺点和一般体内代谢实验所用药量大、劳动强度高的缺点，实验方法可重复性强，所需受试药物量少，成本低，劳动强度低，应用范围广泛，且可成批量进行实验研究，工作效率高。
文档编号G01N33/15GK102879539SQ20121020246
公开日2013年1月16日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者韦英杰, 李萍, 贾晓斌, 齐炼文, 王长梅, 彭蕴茹, 舒娈 申请人:江苏省中医药研究院, 中国药科大学