专利名称：一种利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法
技术领域：
本发明涉及食品安全检测领域，尤其涉及一种利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法。
背景技术：
目前，国内外已建立的检测方法主要采用了液相色谱-质谱联用法(GB/T21311-2007)和酶联免疫法。以上两种均存在前处理时间长，提取操作繁琐、费时等缺点。在检测方面，酶联免疫法主要用于快速筛选，但检测方法单一，只能分别检测一次待测物，检测设备虽比较便宜，但检测试剂昂贵。《中华人民共和国国家标准农业部1077号公告-2-2008》“水产品中硝基呋喃类代 谢物残留量-高效液相色谱法”采用了新型衍生剂与SPE柱提取净化技术，与现有的国标相比，衍生化时间由不少于16小时缩短到I个小时,提取净化由2小时缩短到0. 5小时，整体检测时间由20小时缩短为2小时。新的方法突出了新的机理，前处理过程简化掉原有标准中难控制的衍生化酸度调节和繁琐的提取净化操作。方法准确、可靠，灵敏度高，且大幅度降低检测成本(时间、仪器、试剂)，总体技术达到了国际先进水平。该标准已在08年8月在水产行业成功推广使用，对硝基呋喃代谢物的控制起到了积极的推进作用。对于全国范围的大规模监控检测来说，使用上述几种方法是可行的。但其中仍然存在不足。(I)目前各地的检测条件还不完全统一，具有液相色谱-串联质谱仪、液相色谱仪的实验室很少，原因是这些仪器都很昂贵，需要进行大量的投资才可行；(2)样品处理和检测周期过长，不能对源头及时监控，无法满足大量的硝基呋喃代谢物普查工作的需求。因此，行业内急需一种无需大型精密仪器、价格低廉，并且能够快速便捷的现场检测方法，来弥补此领域的技术空白。
发明内容
为解决上述中存在的问题与缺陷，本发明提供了一种利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法。所述技术方案如下一种利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法，包括A通过提取剂提取样品，并将提取的样品通过上清液进行液化；B将液化后的样液进行衍生化，得到衍生化样液；C将衍生化样液通过萃取柱进行萃取及洗脱剂的洗脱，得到洗脱液；D通过萃取剂对洗脱液进行萃取，得到萃取后的萃取液；E吸取下层萃取液于点滴板一孔上，在该孔上加入定性试剂并混合均匀，形成待测样品混合液；F吸取对照液或阴性样液于点滴板对照孔上；G将点滴板置入硝代速测仪中，通过待测样品混合液的荧光强度与对照液或阴性样液的荧光强度判断所述待测样品中含有的硝基呋喃类代谢物的含量。
本发明提供的技术方案的有益效果是具有操作简便、成本低廉、可现场判定结果的特点。可满足农业、质检、工商、卫生、检验检疫等食品安全监管部门的现场监督检查需要，对畜禽及水产品养殖、生产与经营企业控制产品质量也有重要意义。
图I是利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法流程图。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述本实施例提供了一种用荧光强度检测硝基呋喃代谢物方法，所述方法包括
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步骤20将液化后的样液进行衍生化，得到衍生化样液；步骤30将衍生化样液通过萃取柱进行萃取及洗脱剂的洗脱，得到洗脱液；步骤40通过萃取剂对洗脱液进行萃取，得到萃取后的萃取液；步骤50吸取下层萃取液于点滴板一孔上，在该孔上加入定性试剂并混合均匀，形成待测样品混合液；步骤60吸取对照液或阴性样液于点滴板对照孔上；步骤70将点滴板置入硝代速测仪中，通过待测样品混合液的荧光强度与对照液或阴性样液的荧光强度判断所述待测样品中含有的硝基呋喃类代谢物的含量。其上述方法具体检测步骤如下提取称取已绞碎或匀质的样品IOg与50mL的离心管中，倒入一瓶固体提取剂和一瓶液体提取剂，振摇I分钟使样品完全分散开与提取剂充分接触后，在37 40°C条件下超声提取15分钟取出，振摇约I分钟后，过滤或离心，取上清液IOmL于另一支50mL的离心管中。上述过滤过程为取一块脱脂棉，塞住漏斗上颈口，加3mL净化剂润洗脱脂棉，用一次性吸管吸取IOmL样液过滤并收集。上述离心是在5000r/min离心5分钟后，取上清液10mL。上述固体提取剂为酸性氧化铝，硅胶C18键合材料和吸附型离子交换树脂按30 40 30比例混和。上述液体提取剂为5%三氯乙酸-甲醇溶液。上述净化剂为乙酸乙脂。衍生化取2mL激活剂完全溶解衍生化试剂3备用；如鱼和猪肉样品向收集的样液中依次加入0. 5mL衍生化试剂I和0. 82mL衍生化试剂2，摇匀后再加入0. ImL衍生化试剂3和0. 5mL衍生化试剂4，摇匀后于37 40°C条件下超声衍生化30min (超声过程中摇动样液4 5次)，取出冷却至室温待过柱，如果衍生化样液中有浑浊或白色沉淀物时，加0. SmL的净化剂溶解，摇匀待样液清凉后再过柱。虾和鸡肉样品向收集的样液中依次加0. 5mL衍生化试剂I和0. 75mL衍生化试剂2，摇匀后再加0. ImL衍生化试剂3和0. 5mL衍生化试剂4，摇匀后于37 40°C条件下超声衍生化30min (超声过程中摇动样液4_5次)，取出冷却至室温待过柱，如果衍生化样液中有浑浊或白色沉淀物时，加0. 8mL的净化剂溶解，摇匀待样液清凉后再过柱。上述衍生化试剂I为2%柠檬酸钠水溶液，衍生化试剂2为5%磷酸二氢氨水溶液、衍生化试剂3为I. 0%邻氯水杨醛甲醇溶液，衍生化试剂4为I. 0%三氯化铽。过柱取固相萃取柱一支，依次加入5mL乙酸乙酯、2mL激活剂和2mL蒸馏水激活(激活柱子不挤干)后，加入全部衍生化样液(如果衍生化样液中有浑浊或白色沉淀物时，力口A 0. 8mL的净化剂溶解，摇匀待样液清凉后再过柱，以2 3mL/min速度过柱，弃去流出液并挤干，加入2mL洗涤剂弃去流出液并挤干；再加入0. 6mL洗脱剂(移液枪取)洗脱，5mL离心管收集洗脱液。上述激活剂为50%甲醇水溶液，上述洗脱剂为5%冰乙酸甲醇溶液。萃取向收集的洗脱液中加入ImL萃取剂I和ImL萃取剂3，剧烈震摇约I分钟， 静止3分钟或2000R/min离心2分钟，弃去下层液体(下层一定要弃去干净)。再加ImL萃取剂2和ImL萃取剂3，剧烈振摇I分钟，静止4分钟或2000R/min离心2分钟，弃去上层液体；再加2mL萃取剂3，剧烈振摇I分钟，静止4分钟或2000R/min离心2分钟，弃去上层液体；再加2mL萃取剂3，剧烈振摇I分钟，静止4分钟或2000R/min离心2分钟，弃去上层液体；再加2mL萃取剂3，剧烈振摇I分钟，静止5分钟或2000R/min离心2分钟，待观察；上述萃取剂I为饱和食盐水；萃取剂2为I :1甲醇水溶液；萃取剂3 :为苯。观察判断用一次性吸管或移液枪吸取0. 75mL下层(切忌取到上层)液体到点滴板的一个孔上，加IOOuL或3滴定性试剂混匀，同时用一次性吸管吸取0. 75mL对照液或阴性样液于点滴板的另一个孔上；将点滴板放入硝代速测仪中对照观察，荧光强度强于阴性样品或对照液的荧光强度则样品中含有硝基呋喃类代谢物大于或等于I. Oug/kg ;荧光强度相同或弱于阴性样品或对照液的荧光强度则样品中硝基呋喃类代谢物的含量小于I.0ug/kgo上述定性剂0. 01%氯化铽水溶液。上述实施例提供的对硝基呋喃代谢物的检测包括呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物及呋喃妥因代谢物。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法，其特征在于，所述方法包括 A通过提取剂提取样品，并将提取的样品通过上清液进行液化； B将液化后的样液进行衍生化，得到衍生化样液； C将衍生化样液通过萃取柱进行萃取及洗脱剂的洗脱，得到洗脱液； D通过萃取剂对洗脱液进行萃取，得到萃取后的萃取液； E吸取下层萃取液于点滴板一孔上，在该孔上加入定性试剂并混合均匀，形成待测样品混合液； F吸取对照液或阴性样液于点滴板对照孔上； G将点滴板置入硝代速测仪中，通过待测样品混合液的荧光强度与对照液或阴性样液的荧光强度判断所述待测样品中含有的硝基呋喃类代谢物的含量。
2.根据权利要求I所述的利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法，其特征在于，所述步骤A具体包括将获取的样品与提取剂混合超声提取，并振摇过滤或离心后，取上清液于离心管中。
3.根据权利要求I所述的利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法，其特征在于2种提取剂提取剂I为固体提取剂其配比为酸性氧化铝、硅胶C18键合材料和吸附型离子交换树脂按30 40 30比例混和物； 提取剂2为三氯乙酸-甲醇溶液； 洗脱剂为5%冰乙酸-甲醇溶液。
4.根据权利要求I所述的利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法，其特征在于，步骤B具体包括所述液化后的样液通过衍生化试剂进行超声衍生化并振摇，取出冷却至室温。
5.根据权利要求I或4所述的利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法，其特征在于，所述衍生化试剂包括4种衍生化试剂I为2%柠檬酸钠水溶液、衍生化试剂2为5%磷酸二氢氨水溶液、衍生化试剂3为I. 0%邻氯水杨醛甲醇溶液、衍生化试剂4为I. 0%三氯化铽。
6.根据权利要求I所述的利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法，其特征在于，所述步骤C中，萃取衍生化样液的萃取柱中衍生化样液的萃取柱中设置有乙酸乙酯、激活剂为50%甲醇水溶液。
7.根据权利要求I所述的利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法，其特征在于，所述步骤D具体包括向收集的洗脱液中加入萃取剂振摇并离心处理，弃去下层液体和上层液体。
8.根据权利要求I或7所述的利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法，其特征在于，所述萃取剂包括3种萃取剂I为饱和食盐水、萃取剂2为一甲醇水溶液、萃取剂3为苯。
9.根据权利要求I所述的利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法，其特征在于，所述定性剂为0. 01%氯化铽水溶液。
10.根据权利要求I所述的利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法，其特征在于，所述硝基呋喃代谢物包括呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物及呋喃妥因代谢物。
全文摘要
本发明公开了一种利用荧光强度检测硝基呋喃代谢物的方法，包括通过提取剂提取样品，并将提取的样品通过上清液进行液化；将液化后的样液进行衍生化，得到衍生化样液；将衍生化样液通过萃取柱进行萃取及洗脱剂的洗脱，得到洗脱液；通过萃取剂对洗脱液进行萃取，得到萃取后的萃取液；吸取下层萃取液于点滴板一孔上，在该孔上加入定性试剂并混合均匀，形成待测样品混合液；吸取对照液或阴性样液于点滴板对照孔上；将点滴板置入硝代速测仪中，通过待测样品混合液的荧光强度与对照液或阴性样液的荧光强度判断所述待测样品中含有的硝基呋喃类代谢物的含量。
文档编号G01N21/64GK102759519SQ20121026870
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者王亚军, 贾东芬 申请人:六角体科技(天津)有限公司