专利名称：一种同时检测三种真菌毒素的胶体金速测卡的制备及使用方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的免疫胶体金速测卡的制作及其使用方法，具体是一种同时检测真菌毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素BI)的三联免疫胶体金速测卡的制作及其使用方法。
背景技术：
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)和黄曲霉毒素BI (Aflatoxin BLAFB1)等的真菌毒素是作物在生长及储藏过程中被病原真菌侵染后产生的次级代谢产物，它们对人类、畜禽具有遗传毒性、生殖毒性以及致癌性等毒性效应，是全球范围内最重要的三类真菌毒素。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)又称呕吐毒素，是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、黄色键刀菌(Fusarium cuImorum)、克地键刀菌(FusariumcrookwelIense)以及梨孢镰刀菌(Fusarium poae)等病原真菌侵染谷物(小麦、玉米、大麦以及燕麦)后产生的一种单端孢霉烯B族真菌毒素。研究报道，动物长期食用脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染的谷物及饲料会导致其体重下降，并伴有呕吐现象。此外，DON还具有胚胎致畸毒性、神经毒性、免疫抑制毒性等。DON的熔点为153°C，传统的加热烹调无法将其降解。DON耐热，耐压，弱酸中不分解，加碱及高压处理可以破坏其部分毒力。DON的耐藏力也很强，据报道病麦经4年的贮藏，其中的DON仍能保留原有的毒性。玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN),主要是由禾谷镰刀菌(Fusarium.graminearum)产生。此外据报道，黄色镰刀菌(Fusarium.culmorum)、镰刀菌蜀黍专化型(Fusarium.cerealis),木贼键刀菌(Fusarium.equiseti),克地键刀菌(Fusarium.crookwelIense)以及半裸键刀菌(Fusarium.semitectum)等也可以产生ZEN。ZEN主要发现于镰刀菌污染的小麦、玉米、大麦、燕麦、高梁等谷类作物，在粮食加工和贮藏过程中都会产生。经动物实验证明，ZEN具有类雌激素作用，它主要通过与动物体内的17β雌二醇竞争性结合雌激素受体(ER α和ERi3)而产生类雌激素效应，如雌性化、生殖紊乱和繁殖能力下降，造成动物卵巢萎缩，发情周期延长，死胎等。不同的物种对ZEN的敏感性表现不同。通过研究发现母猪是对ZEN最为敏感的动物，而家禽和反刍动物则对ZEN不敏感。在波多黎各曾有报道，ZEN可能与儿童性早熟有关。随着近年来国内外玉米赤霉烯酮污染粮食作物的案例不断发生，给人类的健康、畜牧业、饲料行业的发展带来了威胁。黄曲霉毒素BI是由黄曲霉(Aspergillus f lavus)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)和集峰曲霉(Aspergillus nomius)等真菌产生的次级代谢产物。主要发现于霉变的花生、玉米、水稻、坚果、可可豆、棉籽等粮食及其制品中。据文献报道，在中国，黄曲霉毒素BI主要的暴露途径是人和动物通过食用霉变的花生以及花生油、玉米和水稻。另夕卜，豆类、肉制品、水产品、乳制品中也有检出黄曲霉毒素BI的报道。其中，花生和玉米污染最为严重。发酵食品中也能检测到黄曲霉毒素BI，多发生于我国南方高温高湿地区。20世纪60年代，在英国发生的十万只火鸡突发性死亡事件被确认与从巴西进口的花生柏污染黄曲霉毒素有关。1993年世界卫生组织(WHO)将黄曲霉毒素列为I类致癌物，其中黄曲霉毒素B I是目前自然界中存在的最强的致癌物质，对人类及动物的肝脏有强烈的毒害作用，可诱导急性肝炎、肝癌，严重时可导致死亡。AFBl的降解温度为268°C，传统的蒸煮烹饪无法将其彻底降解。我国食品安全国家标准《食品中真菌毒素限量》(GB2761-2011)中明确规定玉米、小麦及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量标准为1000yg/kg。玉米、小麦及其制品中玉米赤霉烯酮的限量标准为60 μ g/kg。黄曲霉毒素BI的限量标准涵盖的食品范围较多，包括玉米及其制品、花生及其制品(20 μ g/kg);大米及其制品(10 μ g/kg);小麦及其制品、豆类、熟制坚果以及调味品(5yg/kg)。以侧向流动为检测原理的金标卡检测方法已在我国食品以及饲料检测实践中广泛应用。但未见针对同时检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素BI的快速检测试纸条的公开报道。本发明提供了一种快速、现场、灵敏的同时检测食品及饲料中三种真菌毒素残留的方法，可以在一条检测卡上同时检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1，其检测限分别为200 μ g/kg、50y g/kg和5μ g/kg,为食品及饲料中真菌毒素多残留的快速筛查提供了一种低成本、高效的途径。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备同时检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素BI的免疫胶体金检测方法，并应用其针对食品以及饲料样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素BI进行快速、现场和灵敏的检测。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明的制备方法包括以下步骤:I)在上层的塑料板有两个的孔，分别为加样孔和结果观察孔，加样孔大小为3mmX7mm,观察孔大小为4mmX 18mm。2)在塑料板下方从加样孔往上依次为并排粘贴的玻璃纤维膜和的固定有胶体金标记抗体的试纸条、NC膜、吸收垫。玻璃纤维膜大小为4_X 15mm ;金标记抗体试纸条大小为3_X4mm ;NC膜大小为4mmX 28mm ;吸收塾大小为4_X19mm。3)金标垫上每种单克隆抗体的量为5ng-50ng ；NC膜上抗原-BSA的量为
0.4 μ g-1.2 μ go4)试纸条干燥温度为37°C，时间为30分钟。本发明上述方法制备的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素BI三联速测卡，实际食品和饲料样品的快速检测具体步骤如下:首先于加样孔中加入50 μ L样品提取溶液，然后水平放置。样品溶液会沿样品垫渗透至胶体金标记抗体的玻璃纤维膜，并进一步与NC膜上的特异性抗原竞争结合试纸条上固定的特异性单克隆抗体。室温下放置8分钟后，于结果观察孔中观察颜色变化，作出判断。结果判断:如果出现I条控制线C线和3条酒红色的的检测线T线(D0N/ZEN/AFB1)，则为阴性；控制线C线显示酒红色，任何一条或者几条T线显色不明显或无显色，则表明对应的待检测物质的含量超出其对应的检测限，对应的真菌毒素为阳性；如果控制线C线不显色，则表明检测卡已经失效。本发明制得的真菌毒素三联速测卡对食品、饲料样品中的复杂基质具有较好的抗干扰效果，可广泛应用于食品及饲料中三种真菌毒素多残留的快速检测。较现有的速测卡操作相此，具有以下特有优势。(I)同一张卡上能同时检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素BI三种真菌毒素的残留，而不是三张单种卡的简单物理性胶连，加样仅需I次，而且反应均在同一条件下进行。(2)样品前处理完全统一(克服了不同食品、饲料类样品检测中的不同前处理方法)，操作简单，50 μ L上样量即可满足一次检测。通常地，脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素BI单种免疫胶体金速测卡在检测食品及饲料样本时，样品前处理的程序是不一样的；如单种依次处理，具有前处理时间长、操作繁琐等缺陷。(3)检测时间短，只需要8分钟，结果判定标准统一。完全阴性结果(出现I条C线+3条酒红色的的T线(D0N/ZEN/AFB1);阳性(+):只要其中任何一条T线显色不明显或无显色，则表明该种待测物质为阳性。本发明提供的同时检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素BI的三联免疫胶体金速测卡可为实际食品及饲料检测部门提供快速、现场和灵敏的免疫学检测方法。
:附图是真菌毒素三联免疫胶体金速测卡的平面样品外观图，具体代表名称如下:1-质控线 C 线(Control line)2-黄曲霉毒素 BI 检测线 T3 (Test line 3 for aflatoxin BI)3_ 玉米赤霉烯酮检测线 T2 (Test line 2 for zearalenone)4_ 脱氧雪腐键刀菌烯醇 Tl (Test line I for deoxynivalenol)5-加样孔6-结果观察孔
具体实施例方式结合本发明的内容提供以下实施例:(I)真菌毒素三联速测卡的制作在上层的塑料板卡条上有两个孔,加样孔和观察孔,加样孔大小为3mmX7mm,观察孔大小为4mmX18mm。在塑料卡条下方并排粘贴的样品垫和固定有胶体金标记的特异性单克隆抗体的金标垫、NC膜以及吸收垫。在金标垫上固定25ng-50ng三种单克隆抗体，NC膜上固定0.4 μ g-1.2 μ g三种抗原-BSA。然后置于37°C真空干燥30min。(2)真菌毒素三联速测卡检测标准品效果评价①加样孔中加入50 μ L空白PBS溶液(pH 7.4,0.2mol/L PBS:8g氯化钠、3.35g十二水合磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，双蒸水溶解定容至1L)，在室温条件下反应8分钟后在结果观察孔中观察显色结果。实际结果表明，观察孔中控制线C线、检测线Tl线、T2线、Τ3线都呈现明显的酒红色。②加样孔中加入50 μ L 5ng/mL的黄曲霉毒素BI标准品(采样同上的PBS溶液稀释配成)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线Tl线、检测线T2线呈现酒红色，检测线T3线无色。③加样孔中加入50 μ L 50ng/mL的玉米赤霉烯酮标准品(采样同上的PBS溶液稀释配成)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线Tl线、检测线T3线呈现酒红色，检测线T2线无色。④加样孔中加入50 μ L 200ng/mL的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品(采样同上的PBS溶液稀释配成)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T2线、检测线T3线呈现酒红色，检测线Tl线无色。⑤加样孔中加入50 μ L 200ng/mL的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品和5ng/ml的黄曲霉毒素B I混合标准品(采样同上的PBS溶液稀释配成)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T2线呈现酒红色，检测线Tl线、检测线T3无色。⑥加样孔中加入50 μ L的200ng/ml的脱氧雪腐镰刀菌烯醇和50ng/mL玉米赤霉烯酮标准品混合标准品(采样同上的PBS溶液稀释配成)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线T3线呈现酒红色，检测线Tl线、检测线T2线无色。⑦加样孔中加入50 μ L 50ng/mL的玉米赤霉烯酮标准品和5ng/mL的黄曲霉毒素BI混合标准品(采样同上的PBS溶液稀释配成)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线Tl线呈现酒红色，检测线T2线、检测线T3线无色。⑧加样孔中加入50 μ L 200ng/ml脱氧雪腐镰刀菌烯醇、50ng/mL的玉米赤霉烯酮标准品和5ng/mL的黄曲霉毒素BI混合标准品(采样同上的PBS溶液稀释配成)，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线呈现酒红色，检测线Tl线、检测线T2线、检测线T3线均无色。(3)真菌毒素三联速测卡实际食品样品效果评价①加样孔中加入50 μ L空白玉米样品提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线、检测线Tl线、Τ2线、Τ3线呈现明显的酒红色。②加样孔中加入50 μ L添加了 200ng/mL脱氧雪腐镰刀菌烯醇、50ng/mL的玉米赤霉烯酮标准品和5ng/mL的黄曲霉毒素BI混合标准品的空白玉米样品提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线呈现酒红色，检测线Tl线、检测线T2线、检测线T3线均无色。(4)真菌毒素三联速测卡实际饲料样品效果评价①加样孔中加入50μ L空白饲料样本，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线和检测线Tl线、Τ2线、Τ3线呈现明显的酒红色的。②加样孔中加入50 μ L添加了 200ng/mL脱氧雪腐镰刀菌烯醇、50ng/mL的玉米赤霉烯酮标准品和5ng/mL的黄曲霉毒素BI混合标准品的饲料样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤。结果表明，观察孔中控制线C线呈现酒红色，检测线Tl线、检测线T2线、检测线T3线均无色。
注:如果混合标准品溶液中脱氧雪腐键刀囷紐醇、玉米赤霉紐丽标准品和黄曲霉毒素B I和含量分别大于200ng/mL、50ng/mL和5ng/mL，则控制线C线显示酒红色，对应的检测线不显色；反之，控制线C线显示酒红色，对应的控制线显示酒红色。发明的专利保护范围内。
权利要求
1.一种同时检测三种真菌毒素的胶体金速测卡的制备及使用方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)将DON-BSA、ZEN-BSA、AFBl-BSA以及酶标记抗体分别固定于NC膜上； (2)在偏碱性条件下将胶体金颗粒与特异性单克隆抗体通过静电作用力相互结合； (3)速测卡的组装:以下均以加样孔作为试纸条的下方。首先将固定有特异性单克隆抗体的金标垫盖在NC膜的下方其前沿搭在NC膜的底部处；玻璃纤维膜大小为4mmX 15mm盖在金标试纸条的下方lmm-1.5mm处,其前沿搭在金标垫的下部；吸收垫位于试纸条的最上方，其下部盖在NC膜的上方； (4)在上层的塑料板有两个的孔，分别为加样孔和结果观察孔； 在塑料卡条下方靠近加样孔的位置依次往上并排粘贴的样品垫和固定有胶体金标记的针对DON、ZEN、AFBl的特异性单克隆抗体的金标垫、NC膜以及吸收垫； 在NC膜上固定从加样孔往上依次固定DON-BSA、ZEN-BSA、AFB1-BSA、羊抗鼠IgG，在金标垫上固定三种胶体金标记的单克隆抗体混合液。
2.如权利要求1所述的免疫金标速测卡的使用方法，其特征在于:首先在加样孔中加入50 μ L样品溶液并水平放置。样品溶液的待测真菌毒素会治样品垫渗透至含有胶体金标记特异性单克隆抗体的金标垫，并随后与NC膜上的特异性抗原-BSA竞争结合金标试纸条上的特异性单克隆抗体。8分钟后，于结果观察孔中观察颜色变化，作出判断:如果只有控制线C线显示酒红色，T线不显色，则表明为待检真菌毒素为阳性；控制线C线显示酒红色，对应的检测线T线也显示酒红色，则表明待检真菌毒素含量低于相应的检测限，为阴性样品O
全文摘要
本发明涉及一种免疫胶体金速测卡，应用竞争抑制免疫层析的原理同时检测食品及饲料中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)和黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)。检测时，首先向加样孔中加入待检样本，如果样本中含有待检测真菌毒素，则样本中的真菌毒素在侧向移动的过程中与位于金标垫上的胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，从而抑制了金标抗体和NC膜检测线上相应的抗原-BSA偶联物的结合，则该检测线(T线)不显色，多余的金标单克隆抗体则与多余的酶标记抗体结合，控制线(C线)显色；反之，检测线(T线)为酒红色，控制线(C线)显色。并应用真针对食品和饲料样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1等真菌毒素残留的快速、现场和灵敏的检测。
文档编号G01N33/577GK103105495SQ20121035019
公开日2013年5月15日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者武爱波, 刘刚, 韩铮, 聂冬霞, 杨宪立, 周昌艳 申请人:上海科立特农产品检测技术服务有限公司