专利名称：双酚a的胶体金检测卡及其制备方法
技术领域：
本发明涉及工业化合物类环境激素检测技术领域，特别是涉及双酚A的免疫胶体金检测卡及其制备方法。
背景技术：
双酚A(Bisphenc)I A，缩写BPA)是已知的内分泌干扰素(环境荷尔蒙)，一种重要的化工原料，工业上又叫作聚碳酸酯，主要用于生产环氧树脂、聚碳酸酯、聚砜树脂的单体；又可用作酚醛树脂、可塑性树脂的生产原料和橡胶、塑料、农药、油漆、油墨等的抗氧化剂及稳定剂；在食具、食品包装材料、塑料制品、防腐涂料、输配水及贮水材料等方面应用广泛。每年，全世界生产2700万吨含有双酚A的塑料。双酚A会导致内分泌失调，威胁胎儿和儿童的健康，癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与此有关。欧盟认为双酚A奶瓶会诱发性早熟，从2011年3月2日起，禁止生产含化学物质双酚A的婴儿奶瓶。中国也于2011年5月30日，禁止双酚A (BPA)用于婴幼儿奶瓶的生产。双酚A与雌激素受体具有一定的亲和力，会诱导人体乳癌细胞的孕酮受体表达并刺激其增生，可能存在着抗雄激素毒性。在一定条件下会因溶出、迁移、排放及事故等原因进入水体，可影响人或动物的中枢神经系统和生殖免疫系统，降低人或动物的生殖繁衍能力，并被怀疑诱发生殖系统和心血管系统的癌变等。因此，水样中双酚A的检测技术研究具有十分重要的意义。目前，水样中双酚A的常规检测方法主要有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱法(LC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)以及液相色谱-多级质谱联用法(LC-MS-MS)等。但这些方法所用仪器昂贵、操作复杂，样品前处理耗时长，且对操作人员的专业技能提出很高的要求。因此，建立一种具有较高灵敏度，又简便、经济、易于操作、便于现场使用的技术与方法，是极其必要的。本发明的目的是研发一种快捷简便、成本低廉、结果准确的检测方法。
发明内容
针对以上情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种双酚A的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决、快速简便地检测出工业化合物类环境激素双酚A的问题。本发明的双酚A胶体金检测卡，由包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了双酚A-BSA和兔抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水棉、PVC胶板(及塑料模具)等组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水棉。本发明的双酚A胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现
(I)单克隆抗体取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代后，用双酚A-BSA注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以亲和层析法提纯单克隆抗体；
(2)胶体金溶液制备取IL三角烧瓶I个,加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL,继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用；
(3)抗体的预处理将要标记的双酹A抗体在1000r/min, 4°C条件下,离心20 min,取上清，用O. 01 mol/L PBS稀释成I mg/mL ;或者用O. 01 mol/L PBS稀释成I mg/mL,过
O.22 Mm 滤膜；
(4)胶体金标记物的制备取步骤(2)中的胶体金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,继续搅拌反应10 min ;金标抗体溶液常温低速(1500 r/min)离心20 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C,12000 r/min离心20 min,弃上清,收集沉淀,将沉淀用金标抗体稀释液定容至I mL,制备成双酚A单克隆抗体胶体金标记物；
(5)胶体金膜的制备将步骤(4)双酚A单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5PL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含双酚A单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；
(6)兔抗鼠IgG抗体用双酚A-BSA多次免疫小鼠，提取抗血清免疫兔子，纯化后得兔抗鼠IgG抗体；
(7)包被膜制备将兔抗鼠IgG抗体、双酚A抗原稀释成Img/mL，用划膜仪依次以IPL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37°C包被2 h后，室温自然晾干或者37°C烘干；
(8)样品垫前处理将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
(9)检测卡的组装PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。所述步骤(7)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；
所述步骤(8)中的样品垫处理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和O. 8 g氯化钠(NaCl),用含有 O. 5%TRIT0N-100 的 O. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL ；
所述步骤(9)中的试纸条大小为3. 2 mm X 60 mm。本发明的试纸条进行定性检测操作简单，可分批或单个样品及时检测；检测速度快，检测时间为5 10 min ;易于推广使用，按说明书即可完成操作。
图1为本发明双酚A的免疫胶体金检测卡的结构图图中1.加样孔 2.检测线
3.质控线4.检测孔5.试纸条6.检测卡外壳；
图2为本发明双酚A的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图，图中7.样品垫
8.胶体金结合垫9. PVC胶板10.包被膜11.吸水棉。
具体实施例方式实施例1
图1为本发明双酚A的免疫胶体金检测卡的结构图，图2为本发明双酚A的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图图中9为PVC胶板；7为样品垫；8为胶体金结合垫，该胶体金结合垫上包被了双酚A单克隆抗体胶体金标记物；10为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜上包被了双酚A-BSA和兔抗鼠IgG ；11为吸水棉，由吸水材料如滤纸制成。在PVC胶板9的一端上(样品端)粘附样品垫7、胶体金结合垫8，样品垫7搭接在胶体金结合垫8上。在PVC胶板9的中间粘附包被膜10。在包被膜10上设置有兔抗鼠IgG质控线3 和双酚A-BSA检测线2。在PVC胶板9的另一端粘附吸水棉11。包被膜10的一端与胶体金结合垫8略交叉，另一端与吸水棉11略交叉。该试纸条5可装入有塑料模具制成的检测卡外壳6中，制成检测卡，在检测卡外壳6的上盖上设有加样孔I和检测孔4，样品垫7正对加样孔1，包被膜10正对检测孔4。实施例2
双酚A胶体金检测卡制备，是由以下步骤具体实现
1、单克隆抗体取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代后，用双酚A-BSA注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以亲和层析法提纯单克隆抗体；
2、胶体金溶液制备取IL三角烧瓶I个,加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL,继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用；
3、抗体的预处理将要标记的双酹A抗体在1000r/min, 4°C条件下,离心20 min,取上清，用 O. 01 mol/L PBS稀释成 I mg/mL ;或者用 O. 01 mol/L PBS 稀释成 I mg/ml,过O. 22Mm滤膜；
4、胶体金标记物的制备取步骤(2)中的胶体金溶液40mL，用O. 25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,继续搅拌反应10 min ;金标抗体溶液常温低速(1500 r/min)离心20 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C, 12000r/min离心20 min,弃上清,收集沉淀,将沉淀用金标抗体稀释液定容至I mL,制备成双酹A单克隆抗体胶体金标记物；
5、胶体金膜的制备将步骤(4)双酚A单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5PL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含双酚A蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；
6、兔抗鼠IgG抗体用双酚A-BSA多次免疫小鼠，提取抗血清免疫兔子，纯化后得兔抗鼠IgG抗体；
7、包被膜制备将兔抗鼠IgG抗体、双酚A抗原稀释成Img/mL，用划膜仪依次以I μι/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37°C包被2 h后，室温自然晾干或者37 °C烘干；8、样品垫前处理将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
9、检测卡的组装PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。实施例3 最低检出限量试验
双酚A最低检出限量试验· 准确称量O. 500 g双酚A标准品溶于超纯水并定容至100 mL,标为A1溶液，取A1溶液I mL于容量瓶加超纯水并定容至1000 mL，形成A2溶液，取A2溶液I mL于容量瓶加超纯水并定容至1000 mL,形成A3溶液，则A3溶液的浓度为5 ng/mL (5ppb)。取A3溶液I mL于4支试管中，并分别标号f 4，往试管中分别加入9 mL、4 mL、l mL、0 mL超纯水，配成双酚A标准品溶液浓度分别是0. 5 ng/mL、l ng/mL、2. 5 ng/mL、5 ng/mL ;另取一支空试管,加入5mL超纯水，标为5号试管。取上述f 5号试管中液体作为样品滴加到双酚A检测卡上，加样后5 min观察结果，检测线2和质控线3的显色结果见表I。表I双酚A最低检出限量试验
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醒(ng/raL》
10.5
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32.5顏T显色f淡
45不麗色
3C 11T与廣控线显包相同
经多次检验，双酚A的检出率达99%，最低检出限量为5 ng/mL。
权利要求
1.双酚A胶体金检测卡，其特征在于由包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了双酚A-BSA和兔抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水棉、PVC胶板及塑料模具组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水棉。
2.权利要求1所述的双酚A胶体金检测卡的制备方法，其特征在于由以下步骤实现 单克隆抗体取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代后，用双酚A-BSA注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以亲和层析法提纯单克隆抗体；胶体金溶液制备取I L三角烧瓶I个,加入超纯水495 mL，而后加入质量浓度1%氯金酸5 mL，配制成500 mL质量浓度O. 01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入质量浓度1%柠檬酸三钠溶液5-7 mL,继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8°C保存备用；抗体的预处理将要标记的双酹A抗体在1000 r/min, 4°C条件下,离心20 min,取上清，用 O. 01 mol/L PBS 稀释成 I mg/mL ;或者用 0.01 mol/L PBS 稀释成 I mg/ml,过 O. 22 Mm滤膜；胶体金标记物的制备取步骤(2)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K2C03调节胶体金溶液pH至8. 5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,继续搅拌反应10 min ;金标抗体溶液常温 1500 r/min离心20 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4°C, 12000 r/min 离心20 min,弃上清,收集沉淀,将沉淀用金标抗体稀释液定容至I mL,制备成双酹A单克隆抗体胶体金标记物；胶体金膜的制备将步骤(4)双酚A单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 PL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含双酚A单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；兔抗鼠IgG抗体用双酚A-BSA多次免疫小鼠，提取抗血清免疫兔子，纯化后得兔抗鼠 IgG抗体；包被膜制备将兔抗鼠IgG抗体、双酹A抗原稀释成I mg/mL,用划膜仪依次以I PL/cm 的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37°C包被2 h后，室温自然晾干或者37°C烘干;样品垫前处理将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；检测卡的组装PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
3.根据权利要求2所述的双酚A胶体金检测卡的制备方法，其特征在于所述步骤(7) 中所包被的检测线T设在质控线C的下方；所述步骤(8)中的样品垫处理液是由I g小牛血清蛋白和O. 8 g氯化钠，用含有质量浓度O. 5%TRIT0N-100的O. 01 mol/L PBS定容至100 mL ;所述步骤(9)中的试纸条大小为 2 mm X 60 mm。
全文摘要
本发明双酚A的胶体金检测卡及其制备方法，涉及工业化合物类环境激素检测技术领域。本发明的检测卡外壳中的试纸条，由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水棉组成；胶体金膜为含双酚A单克隆抗体的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有T线和C线，T线包被有双酚A蛋白偶联物，C线包被有兔抗鼠IgG抗体。本发明有效用于快速检测双酚A，简单方便、快捷、结果准确。
文档编号G01N33/74GK103018467SQ201210368878
公开日2013年4月3日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者杜道林, 洪霞, 张祯, 薛永来 申请人:江苏维赛科技生物发展有限公司