专利名称：一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法
技术领域：
本发明涉及生物分析领域，特别涉及一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法。
背景技术：
多价结合的相互作用在研究溶液中生物分子之间的相互作用起着非常重要的作用。例如，IgG抗体有两个抗原多肽结合位点，可以结合两种抗原，属于一种二价结合作用。然而，通过色谱分辨1:1和1:2的IgG抗体-肽复合物，在溶液中是非常具有挑战性的，因为在分子量、表面形状和疏水性的差异两者之间是非常接近的。因此，实现两种不同比例的抗体-肽复合物的分离是非常困难的。 FLAG标签多肽是一个与重组蛋白相融合的由8个亲水氨基酸组成的多肽片段，倾向于定位在融合蛋白表面，因此更易与抗体结合。FLAG标签只有8个氨基酸组成，因此它不会占据融合蛋白的其他表位和结合域，导致融合蛋白·的功能、分泌性以及转运发生改变。因此，该标签被广泛的应用于融合蛋白的表达、纯化和检测等方面。抗FLAG单克隆抗体能识别位于氨基端或羧基端的FLAG标签，具有高灵敏度，高特异性和高亲和力。生物分析技术在揭示抗体和多肽的相互作用中起到了至关重要的作用。目前研究抗体与多肽相互作用的方法主要有表面等离子体共振(SPR) (M. Oda, T. Azuma,Mol.1mmunol., 2000，37，1111 - 1122)，酶联免疫吸附试验(ELISA) (F. Hardy, L.Djavad1-Ohaniance, Μ. E. Goldberg, J. Tmmunn1. Methods. , 1997, 200, 155 - 159)和高效凝胶过滤色谱法(HPSEC) (B. J. McFarland, J. F. Katz, A. J. Sant et al.,J. Mol. Biol. , 2005，350，170 - 183)等。其中，SPR和ELISA通常需要将抗体分子固定，操作上带来一定的困难，而且不适合检测溶液中的抗体多肽相互作用。HPSEC色谱适合分离溶液中的蛋白，游离肽和蛋白质-肽复合物，但它无法提供更高的分辨率。因此，目前大多数的分析方法只能测量单个多肽和抗体的结合过程，而无法分析抗体与多肽之间的多价相互作用。毛细管电泳(CE)具有高效、高速、微量、低消耗、操作模式多，分离方法开发容易等优点，由于具备如此多的优点以及分离生物大分子的能力，CE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。尤其是将荧光检测与毛细管电泳相结合，大大提高了检测限，拓展了毛细管电泳的应用。本方法建立的抗体与抗原多肽相互作用的检测方法，克服了已有方法存在的缺陷，可满足大批量检测需要，适用范围较广，有较高的精确性及较好的稳定性，解决了抗体与多肽之间多价相互作用的检测难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术对抗体多肽相互作用检测的不足，本发明提供一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法，是首先将抗体与不同比例的多肽混合，然后进行毛细管电泳检测，同时检测抗体多肽复合物和荧光多肽的出峰时间及荧光强度，对抗体多肽复合物的电泳峰进行积分，根据公式可计算抗体与多肽的解离常数KD。该方法还可以检测两种外源多肽与抗体相互作用的竞争过程。本发明方法中所述的毛细管电泳检测中，电泳缓冲液优选为25mM硼酸缓冲液，PH9.3。所述硼酸缓冲液经O. 22 μ m滤膜过滤。本发明方法可用于检测各种抗体与多肽的相互作用。将抗体与多肽混合后，可根据毛细管电泳谱图的变化检测抗体多肽相互作用。实验证明，该方法操作简单，检测灵敏度高，所需时间短。该方法是对传统抗体与多肽的相互作用检测技术进行改进，结合荧光检测灵敏度高等优点，建立的一种新的高灵敏检测技术。本发明的有益效果是，一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法，操作容易，检测灵敏度高，可实现抗体多肽相互作用检测；可同时检测多个荧光波长，从而减少了 误差，提高了检测的准确性。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。图1 M2与FLAG多肽相互作用示意图。图2毛细管电泳荧光检测M2与FLAG2_Cy5的相互作用。其中，a是FLAG2_Cy5的电泳谱图山是112与FLAG2-Cy5混合物(M2:FLAG2-Cy5=l:2)的电泳谱图。激发光源λ ex=530nm,检测波长为670 nm。图3毛细管电泳荧光检测M2与FLAG1-FAM的相互作用。其中，a是FLAG1-FAM的电泳谱图；b是M2与FLAG1-FAM混合物(M2: FLAG1-FAM=1: 2)的电泳谱图。激发光源λ ex=490nm,检测波长为520 nm。图4毛细管电泳检测M2与不同浓度的FLAGrCy5相互作用。FLAG1-CySz^C: a,1:1; b, 2:1; c，4:1; d, 8:1; e, FLAG「Cy5. ([M2] =1.35 μ Μ)激发光源 λ ex=530 nm，检测波长为670 nm。图5毛细管电泳检测FLAG3多肽取代M2-(FLAG1-CyS)!复合物的FLAG1-CyS15其中，a是M2- (FLAGrCy5) ι复合物的电泳谱图；b是过量FLAG3与M2- (FLAGrCy5) ι复合物混合后的电泳谱图。
具体实施例方式现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。如图1所示，一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法，其特征在于首先将抗体与不同比例的多肽混合，然后进行毛细管电泳检测，同时检测抗体多肽复合物和荧光多肽的出峰时间及荧光强度，对抗体多肽复合物的电泳峰进行积分，根据公式可计算抗体与多肽的解离常数KD。该方法还可以检测两种外源多肽与抗体相互作用的竞争过程。实验证明，该方法操作简单，检测灵敏度高，所需时间短。该方法是对传统抗体多肽相互作用检测技术进行改进，结合多波长荧光检测灵敏度高等优点，建立的一种新的高灵敏抗体多肽相互作用检测技术。
本发明一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法的操作流程如下
I 抗 FLAG M2 单克隆抗体(ANT1-FLAG M2 Monoclonal Antibody，简称 M2)购自Sigma公司(货号为F 3165)。首先将M2抗体与不同比例的FLAG多肽混合。2电泳缓冲液本方法中所用的电泳缓冲液为25 mM硼酸缓冲液(pH9. 3)。3毛细管本方法中所用的毛细管为未涂层毛细管(内径75 μ m,长度60 cm,有效长度35 cm)ο4电泳检测进样电压12 KV，进样10 S，然后停止加压。分离电压18 KV，分离10 min，可同时检测多个通道的荧光强度，收集、分析得到相应的检测结果。5根据电泳峰判断M2多肽复合物的浓度，根据公式(I) (2)，得到M2与多肽的解
离常数。
权利要求
1.一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法，其特征在于首先将抗体与不同比例的经荧光标记的多肽混合，然后分别进行毛细管电泳检测，同时检测抗体多肽复合物和荧光多肽的出峰时间及荧光强度，对抗体多肽复合物的电泳峰进行积分，根据公式可计算抗体与多肽的解离常数KD。
2.如权利要求1所述的一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法，其特征在于所述多肽为两种，不同的多肽分别用不同的荧光分子标记，先将其中一种经标记的多肽与抗体混合，进行毛细管电泳检测；然后再加入下一种经标记的多肽，进行毛细管电泳检测，分别记录不同时间进行的检测结果，根据电泳峰的位置分析两种多肽与抗体之间的竞争过程。
3.如权利要求1所述的一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法，其特征在于所述的毛细管电泳检测中，电泳缓冲液为25 mM硼酸缓冲液，pH9. 3。
4.如权利要求3所述的一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法，其特征在于所述硼酸缓冲液经O. 22 μ m滤膜过滤。
5.如权利要求1所述的一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法，其特征在于所述的抗体为抗FLAG M2单克隆抗体；所述的多肽为FLAG标签多肽，并用荧光染料分子T 己 O
全文摘要
本发明涉及一种毛细管电泳检测抗体与多肽相互作用的方法，属于生物分析领域。首先将抗体与不同比例的多肽混合，然后进行毛细管电泳检测，同时检测抗体多肽复合物和荧光多肽的出峰时间及荧光强度，对抗体多肽复合物的电泳峰进行积分，将积分面积换算为复合物浓度，根据公式可计算抗体与多肽的解离常数KD。该方法还可以检测两种外源多肽与抗体相互作用的竞争过程。实验证明，该方法操作简单，检测灵敏度高，所需时间短。该方法是对传统抗体多肽相互作用检测技术进行改进，结合荧光检测灵敏度高等优点，建立的一种新的高灵敏抗体多肽相互作用检测技术。
文档编号G01N27/447GK102998357SQ201210390038
公开日2013年3月27日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者王建浩, 王车礼, 邱琳, 蒋鹏举, 夏江 申请人:常州大学