专利名称：基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测牛奶中三聚氰胺的方法。
背景技术：
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，是基本有机化工的中间产品，广泛运用于木材、塑料、涂料和医药等行业。近年来，三聚氰胺常被人为掺杂进食品或饲料中，以提升乳制食品或饲料检测中的蛋白质含量指标。三聚氰胺进入人体后可引起结石，损伤相应的器官。掺杂三聚氰胺对整个乳品行业产生了严重冲击。从大量的样本中采用简单有效的方法迅速检出掺杂三聚氰胺的乳品样本是非常必要的。目前采用的纳米金测定三聚氰胺 方法，通常是利用三聚氰胺可导致纳米金颗粒发生聚集的特性。这些方法需要复杂的纳米金制备、纯化、修饰和保护步骤，三聚氰胺含量由纳米金溶液染色由酒红色变为紫红色或蓝色的程度判定，颜色梯度变化不明显。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的采用的纳米金测定三聚氰胺方法需要复杂的纳米金制备、修饰和纯化的技术问题，提供了一种基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法。基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. 1-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在室温下放置，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 : 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以lOOOOr/min的转速离心lOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为0. 1-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mOl/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在室温下放置，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；其中所述的还原剂为对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm 365nm的条件下进行紫外光照射，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 : 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mol/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm 365nm的条件下进行紫外光照射，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；其中所述的还原剂为对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶体积的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值 为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物用可见光谱检测，对照样混合物在波长为530 570nm内出现吸收峰，待检测牛奶混合物在波长为530 570nm内未出现吸收峰或出现的吸收峰小于对照样混合物，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 : 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mOl/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物用可见光谱检测，当对照样混合物在波长为530 570nm内出现吸收峰，而待检测牛奶混合物在波长为530 570nm内未出现吸收峰或出现的吸收峰小于对照样混合物，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；其中所述的还原剂为对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶体积的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；
二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液，反应lOmin，然后再分别加入浓度为IX 10_2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm 365nm的条件下进行紫外光照射并用可见光谱检测，当对照样混合物在波长为530 570nm内出现吸收峰，而待检测牛奶混合物在波长为530 570nm内未出现吸收峰或出现的吸收峰小于对照样混合物，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 : 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mOl/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm 365nm的条件下进行紫外光照射并用可见光谱检测，当对照样混合物在波长为530 570nm内出现吸收峰，而待检测牛奶混合物在波长为530 570nm内未出现吸收峰或出现的吸收峰小于对照样混合物，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；其中所述的还原剂为对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶体积的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。本方法在纳米金的合成过程中实现三聚氰胺的检测，无需纳米金的修饰和纯化过程，三聚氰胺的存在可直接从其抑制纳米金合成引起的颜色变化即肉眼水平进行识别，灵敏度高，专一性强，为食品中三聚氰胺的检测提供了快速、高效、易于推广的新方法。本方法牛奶中三聚氰胺的含量大于O. 2X IOVL就能够检测出来(牛奶中三聚氰胺的含量小于
2.5X IOVL就符合国家标准)。
图I是实验二中对照样和待检测的牛奶的吸光度谱图，图中a表示待检测的牛奶的吸光度谱图，b表示对照样的吸光度谱图；图2是实验三中对照样和待检测的牛奶的吸光度谱图，图中a表示对照样的吸光度谱图，b表示三聚氰胺的浓度为I X 10_6g/L的待检测的牛奶的吸光度谱图，c表示三聚氰·胺的浓度为9X 10_7g/L的待检测的牛奶的吸光度谱图，d表示三聚氰胺的浓度为8X 10_7g/L的待检测的牛奶的吸光度谱图，e表示三聚氰胺的浓度为7Xl(Tg/L的待检测的牛奶的吸光度谱图，f表示三聚氰胺的浓度为6X 10_7g/L的待检测的牛奶的吸光度谱图；图3是实验四中对照样和待检测的牛奶的吸光度谱图，图中a待检测的牛奶的吸光度谱图，b表示表示对照样的吸光度谱图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式中基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在室温下放置，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 : 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。本实施方式中所用的甲烷氧化菌素采用公知技术即可制得。
具体实施方式
二 本实施方式中基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行
一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mOl/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在室温下放置，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；其中所述的还原剂为对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚；甲烷氧化菌素水溶液与经 过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。本实施方式中所用的甲烷氧化菌素的制备方法如下将IL甲烷氧化细菌发酵液在4°C条件下使用Z-16K高速冷冻离心机(Sigma公司)以9000r/min的速度离心，然后取上清液.上清液使用活化的Diaion HP-20大孔径树月旨(美国Supelco公司，I. IcmXSOcm层析柱)进行动态吸附，分别用2倍柱体积的双蒸水和30%乙醇洗涤除去未被吸附的杂质，再用60%乙醇洗脱吸附的甲烷氧化菌素，洗脱液经透析除乙醇后60°C旋转蒸发后真空冷冻干燥得白色粉末状甲烷氧化菌素。
具体实施方式
三本实施方式中基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm 365nm的条件下进行紫外光照射，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 : 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。
具体实施方式
四本实施方式中基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行
一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mOl/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm 365nm的条件下进行紫外光照射，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；其中所述的还原剂为对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚；甲烷氧化菌素水溶液与经·过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶体积的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。
具体实施方式
五本实施方式中基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行—、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物用可见光谱检测，当对照样混合物在波长为530 570nm内出现吸收峰，而待检测牛奶混合物在波长为530 570nm内未出现吸收峰或出现的吸收峰小于对照样混合物，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 : 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。
具体实施方式
六本实施方式中基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行—、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；
二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mOl/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物用可见光谱检测，当对照样混合物在波长为530 570nm内出现吸收峰，而待检测牛奶混合物在波长为530 570nm内未出现吸收峰或出现的吸收峰小于对照样混合物，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；其中所述的还原剂为对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶体积的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。
具体实施方式
七本实施方式中基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三 聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液，反应lOmin，然后再分别加入浓度为IX 10_2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm 365nm的条件下进行紫外光照射并用可见光谱检测，当对照样混合物在波长为530 570nm内出现吸收峰，而待检测牛奶混合物在波长为530 570nm内未出现吸收峰或出现的吸收峰小于对照样混合物，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 : 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。
具体实施方式
八本实施方式中基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. Ι-lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mOl/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm 365nm的条件下进行紫外光照射并用可见光谱检测，当对照样混合物在波长为530 570nm内出现吸收峰，而待检测牛奶混合物在波长为530 570nm内未出现吸收峰或出现的吸收峰小于对照样混合物，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；其中所述的还原剂为对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶体积的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。采用下述实验验证本发明效果实验一基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行 一、牛奶的预处理向O. 4mL对照样和O. 4mL待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶，所述待检测的牛奶中三聚氰胺的浓度为I X 10_6g/L ；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. lmmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入0. ImL浓度为I X 10_2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在室温下放置，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺。实验二基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向0. 4mL对照样和0. 4mL待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶，所述待检测的牛奶中三聚氰胺的浓度为2Xl(Tg/L ；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入0. 4mL浓度为0. 2mmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为IX 10_2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物用可见光谱检测，对照样混合物在波长为544nm内出现吸收峰，吸光度值为0. 498，待检测牛奶混合物在波长为544nm内未出现吸收峰，吸光度值仍为0. 154，证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。实验三基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向O. ImL对照样和5个O. ImL待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶，所述5个待检测的牛奶中三聚氰胺的浓度分别为 IX 10_6g/L、9X l(Tg/L、8X l(Tg/L、7X 10_7g/L、6X 10_7g/L ；步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入O. ImL浓度为 O. 5mmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入O. ImL浓度为I X 10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X 10_4mol/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物用可见光谱检测，对照样混合物在波长为544nm内出现吸收峰，待检测牛奶混合物在波长为544nm内未出现吸收峰，证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；其中所述的还原剂为对苯二酚；还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。实验四基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向O. ImL对照样和O. ImL待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心IOmin,取出上清液,然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶，所述待检测的牛奶中三聚氰胺的浓度为6X10_7g/L;步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不
含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入O. 4mL浓度为O. 5mmol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为IX 10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mol/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm的条件下进行紫外光照射，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；其中所述的还原剂为对苯二酚；氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶体积的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I0
权利要求
1.基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行 一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心lOmin，取出上清液，然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶； 步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不含三聚氰胺的牛奶； 二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O.I-Immol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为I X l(T2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在室温下放置，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺； 甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。
2.基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行 一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心lOmin，取出上清液，然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶； 步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不含三聚氰胺的牛奶； 二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O.I-Immol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为I X 10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mol/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在室温下放置，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺； 其中所述的还原剂为对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。
3.基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行 一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心lOmin，取出上清液，然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶； 步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不含三聚氰胺的牛奶；二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O. I-Immol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为I X l(T2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm 365nm的条件下进行紫外光照射，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺； 甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。
4.基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行 一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心lOmin，取出上清液，然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶； 步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不含三聚氰胺的牛奶； 二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O.I-Immol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mol/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm 365nm的条件下进行紫外光照射，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺； 其中所述的还原剂为对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶体积的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。
5.基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行 一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心lOmin，取出上清液，然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶； 步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不含三聚氰胺的牛奶； 二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O.I-Immol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为I X l(T2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物用可见光谱检测，对照样混合物在波长为530 570nm内出现吸收峰，待检测牛奶混合物在波长为530 570nm内未出现吸收峰或出现的吸收峰小于对照样混合物，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。
6.基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行 一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心lOmin，取出上清液，然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶； 步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不含三聚氰胺的牛奶； 二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O.I-Immol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为I X 10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mol/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物用可见光谱检测，当对照样混合物在波长为530 570nm内出现吸收峰，而待检测牛奶混合物在波长为530 570nm内未出现吸收峰或出现的吸收峰小于对照样混合物，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺； 其中所述的还原剂为对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶体积的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。
7.基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行 一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心lOmin，取出上清液，然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶； 步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不含三聚氰胺的牛奶； 二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O.I-Immol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为I X l(T2mol/L的氯金酸溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm 365nm的条件下进行紫外光照射并用可见光谱检测，当对照样混合物在波长为530 570nm内出现吸收峰，而待检测牛奶混合物在波长为530 570nm内未出现吸收峰或出现的吸收峰小于对照样混合物，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺； 甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : I。
8.基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法，其特征在于基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法按照以下步骤进行一、牛奶的预处理向相同体积的对照样和待检测的牛奶中分别加入三氯乙酸，20min后以10000r/min的转速离心lOmin，取出上清液，然后向上清液中加入NaOH至pH值为7，得到经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶； 步骤一中三氯乙酸的加入量为待检测的牛奶体积的1/5 ;步骤一中的对照样为不含三聚氰胺的牛奶； 二、向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入浓度为O.I-Immol/L的甲烷氧化菌素水溶液,反应lOmin，然后再分别加入浓度为lX10_2mol/L的氯金酸溶液和浓度为5X10_4mol/L的还原剂溶液，得到对照样混合物和待检测牛奶混合物，然后将对照样混合物和待检测牛奶混合物在紫外光波长范围为254nm 365nm的条件下进行紫外光照射并用可见光谱检测，当对照样混合物在波长为530 570nm内出现吸收峰，而待检测牛奶混合物在波长为530 570nm内未出现吸收峰或出现的吸收峰小于对照样混合物，即证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺； 其中所述的还原剂为对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚；甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的对照样的体积比为I 4 1，甲烷氧化菌素水溶液与经过预处理的待检测牛奶的体 积比为I 4 1，氯金酸溶液与经过预处理的对照样的体积比为I : 1，氯金酸溶液与经过预处理的待检测牛奶的体积比为I : 1，还原剂溶液与经过预处理的待检测牛奶体积的体积比为5 1，还原剂溶液与经过预处理的对照样的体积比为5 I。
全文摘要
基于甲烷氧化菌素介导纳米金合成检测牛奶中三聚氰胺的方法，它涉及一种检测牛奶中三聚氰胺的方法。本发明解决了现有的采用的纳米金测定三聚氰胺方法需要复杂的纳米金制备、修饰和纯化的技术问题。本方法如下向经过预处理的对照样和经过预处理的待检测牛奶中分别加入甲烷氧化菌素水溶液，然后再加入氯金酸溶液，放置，对照样混合物颜色变为酒红色的同时待检测牛奶混合物没有变为酒红色，证明所检测的牛奶中含有三聚氰胺。本方法在纳米金的合成过程中实现三聚氰胺的检测，无需纳米金的修饰和纯化过程，三聚氰胺的存在可直接从其抑制纳米金合成引起的颜色变化即肉眼水平进行识别，灵敏度高，专一性强。
文档编号G01N21/78GK102944556SQ20121048248
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者辛嘉英, 张帅, 王艳, 陈林林, 张铁男, 张兰轩, 陈丹丹, 董静 申请人:哈尔滨商业大学