血浆乙酰哈巴苷含量的测定方法
【专利摘要】本发明针对目前血浆中乙酰哈巴苷的测定方法中存在的不足之处，提供一种具有良好的精密度和准确性，灵敏简便快捷的测定方法，包括步骤（1）：血浆样品的处理：含有乙酰哈巴苷成分的含药血浆，加入内标溶液和甲醇涡旋混匀后离心，取上层澄清溶液于30-70℃水浴中以氮气流吹干，以流动相复溶，涡旋后离心，上层澄清溶液待测；和步骤(2)：LC-MS/MS检测。本发明具有良好的精密度和准确性，简便快捷，不受筋骨草中其他成分的干扰，符合生物样品分析要求，可灵敏测定血浆中乙酰哈巴苷的含量，适用于乙酰哈巴苷的药代动力学研究。
【专利说明】血浆乙酰哈巴苷含量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及血浆中乙酰哈巴苷含量的测定方法，属于体内药物分析和体内药代动力学领域。
【背景技术】
[0002]筋骨草为唇形科植物筋骨草属金疮小草Ajuga decumbens Thunb的全草,筋骨草又名活血草、散血草、苦地胆等，分布于我国的长江以南各省区，全草可供药用。我国南方民间用于治疗痈疽疗疮、火眼、乳痈、鼻衄、咽喉炎、肠胃炎、急性结膜炎、烫伤、狗咬伤、毒蛇咬伤以及外伤出血等症。现代药理研究证明，筋骨草具有收缩血管、抑菌、抗肿瘤等活性。其主要有效成分为环烯醚萜类，而乙酰哈巴苷是其中含量较高且有明显抗病毒、抗肿瘤活性的成分之一。因此建立一种快速、灵敏、简便的血浆中乙酰哈巴苷的测定方法将对今后筋骨草的深入研究提供理论基础和实验依据。
[0003]目前测定乙酰哈巴苷的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳法(CE)，但由于乙酰哈巴苷的最大紫外吸收波长在200nm附近，容易受到血浆中内源性物质干扰；而CE的检测灵敏度又不高。有文献报道采用HPLC法测定大鼠静脉注射乙酰哈巴苷后的大鼠血浆中乙酰哈巴苷含量，但未检测到大鼠口服给予乙酰哈巴苷后血浆中的乙酰哈巴苷，可能由于该HPLC法灵敏度不够所致。
【发明内容】
[0004]本发明即是针对目前对血浆中乙酰哈巴苷的测定方法中所存在的上述不足之处，提供一种具有良好的精密度和准确性，灵敏简便快捷的测定方法。
[0005]本发明解决的技术问题通过以下技术方案来实现:
[0006]本发明提供一种血浆乙酰哈巴苷含量的测定方法，所述方法包括以下步骤:
[0007]1、血浆样品预处理:
[0008]含乙酰哈巴苷成分的含药血浆，加入内标溶液，再加入3飞倍血浆体积的100%的醇溶液涡旋混匀，高速离心，取上层澄清溶液于3(T70°C水浴中以氮气流吹干，用广2倍血浆体积的流动相复溶，涡旋静置后高速离心，上层澄清溶液用LC-MS/MS法检测；
[0009]2、LC-MS/MS 色谱条件:
[0010]色谱柱:Z0RBAXXDB-C18column,流动相:Α:0.1~1.0% 的甲酸水溶液和 B: 100% 的乙腈溶液，Α:Β=85:15~40:60，流速:0.1~0.5mL/min ;质谱条件:MRM模式，正离子扫描，检测对象:乙酰哈巴苷429.2 — 369.2 ;肉桂酸149.2 — 103.1。 [0011]LC-MS/MS是液相色谱质谱/质谱联用的英文简称，是一种高灵敏度的检测分析方法，在物质的检测领域有着广泛的应用。MRM模式是多反应检测扫描(multi reactionmonitoring)的简称,表示多个化合物同时测定时,多个SRM (选择反应监测)一起做。
[0012]进一步的，所述方法中，步骤I中的内标溶液为肉桂酸溶液。
[0013]更进一步的，所述肉桂酸溶液的浓度为l(T100yg/mL。[0014]进一步的，所述方法中，步骤I中加入的含药血浆与内标溶液的体积比为10:1。
[0015]进一步的，所述方法中，步骤I中的醇溶液为甲醇、乙醇或甲醇和乙醇的混合溶液。
[0016]进一步的，所述方法中，步骤I中的高速离心的转速大于或等于10，000r/min。
[0017]进一步的，所述方法中，步骤2采用电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，干燥气流速为5.0-15.0L/min ;干燥气温度为150^500°C ;喷雾器压力为15~40psi ;毛细管电压为2000~5000V。
[0018]本发明为确保血浆样品测定结果的可信度，在每批血样测定时均随机加入并平行测定低、中、高3个浓度(24.1,241.0,2410.0ng/mL)的标准质控样品，共测试15个分析批样品，每一分析批次质控测定结果误差百分率均小于±15%，符合体内药物分析要求。
[0019]本发明所述的血浆乙酰哈巴苷含量的测定方法，具有以下的优点:
[0020]1、使用肉桂酸作为内标物，采用肉桂酸作为内标，既不干扰乙酰哈巴苷的测定，同时能够有效的消除血浆样品处理及测定过程中所带来的系统误差；
[0021]2、本发明具有良好的精密度和准确性，简便快捷，不受筋骨草中其他成分的干扰，符合生物样品分析要求，可灵敏测定血浆中乙酰哈巴苷的含量，适用于乙酰哈巴苷的药代动力学研究。 【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为乙酰哈巴苷和肉桂酸的质谱图；
[0023]A为乙酰哈巴苷，B为肉桂酸；
[0024]图2为乙酰哈巴苷的色谱图；
[0025]A:空白血浆，B:给药IOmin后血衆，I为乙酰哈巴苷；2为肉桂酸。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例仅用于说明本发明，便于公众更好的理解本发明的技术内容，而不是用于限制本发明的范围。
[0027]实施例1
[0028]大鼠血浆中乙酰哈巴苷含量的测定方法
[0029]1、血浆样品预处理
[0030]含乙酰哈巴苷成分的大鼠血浆200 μ L，加入10 μ g/mL的肉桂酸20 μ L，再加入600 μ L的100%的甲醇涡旋混匀，10，000r/min高速离心，取上层澄清溶液于30°C水浴中以氮气流吹干，用200 μ L的流动相复溶，涡旋静置后10，000r/min高速离心，吸取上层澄清溶液待测。上层澄清溶液用LC-MS/MS法检测。
[0031 ] 2、LC-MS/MS 色谱条件:
[0032]色谱柱:Z0RBAX XDB_C18column，流动相:A:0.1%的甲酸水溶液和B: 100%的乙腈溶液，A:B=85:15，流速:0.lmL/min ;质谱条件:MRM模式，正离子扫描，检测对象:乙酰哈巴苷 429.2 — 369.2 ;肉桂酸 149.2 — 103.1。
[0033]所述步骤2米用电喷雾尚子源,米用正尚子模式,干燥气流5.0L/min ;干燥气温度1500C ;喷雾器压力15psi ;毛细管电压2000V。[0034]测定结果:
[0035]如图1和图2所示。
[0036]标准曲线:取大鼠空白血浆0.2mL，加适量乙酰哈巴苷标准溶液，配制成相当于乙酰哈巴苷血浆浓度为 2.40，24.10，48.20，241.00，482.00，2410.00 和 4820.00ng/mL 的含药血浆，按照测定步骤，记录色谱图，以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归预算，求的回归方程为y=0.5463x+0.0144，血浆中乙酰哈巴苷的最低定量限为2.4ng/mL,其检测限为0.81ng/mL。
[0037]精密度:取空白血浆加入适量的乙酰哈巴苷标准溶液，分别配制成低、中、高3个浓度(24.1,241.0,2410.0ng/mL)的标准质控样品，按样品测定方法日内重复测定5次，日内精密度分别为2.5%、1.3%和5.0%，同法配制的3个浓度样品连续测定3天，每一浓度重复测定5次，H间精密度分别为4.3%、7.2%和4.5%。
[0038]实施例2
[0039]犬血浆中乙酰哈巴苷含量的测定方法
[0040]1、血浆样品预处理
[0041 ] 含乙酰哈巴苷成分的犬血浆400yL，加入100μ g/mL的肉桂酸40 μ L，再加入1600 μ L体积的100%的乙醇涡旋混匀，10，OOOfmin高速离心，取上层澄清溶液于70°C水浴中以氮气流吹干，用400 μ L的流动相复溶，涡旋静置后10，000r/min高速离心，吸取上层澄清溶液待测。上层澄清溶液用LC-MS/MS法检测。
[0042]2、LC-MS/MS 色谱条件:
[0043]色谱柱:Z0RBAX XDB_C18column，流动相:A: 1%的甲酸水溶液和B: 100%的乙腈溶液，A:B=40:60，流速:0.5mL/min ;质谱条件:MRM模式，正离子扫描，检测对象:乙酰哈巴苷429.2 — 369.2 ;肉桂酸 149.2 — 103.1。
[0044]所述步骤2米用电喷雾尚子源(ESI),正尚子模式,干燥气流速为15.0L/min ;干燥气温度为500°C ;喷雾器压力为40psi ;毛细管电压为5000V。
[0045]实施例3
[0046]小鼠血浆中乙酰哈巴苷含量的测定方法
[0047]1、血浆样品预处理
[0048]含乙酰哈巴苷成分的小鼠血浆300 μ L，加入80 μ g/mL的肉桂酸30 μ L，再加入1000 μ L体积的浓度为100%的乙醇和甲醇混合溶液涡旋混匀，10，000r/min高速离心，取上层澄清溶液于50°C水浴中以氮气流吹干，用300 μ L的流动相复溶，涡旋静置后10，OOOr/min高速离心，吸取上层澄清溶液待测。上层澄清溶液用LC-MS/MS法检测。
[0049]2、LC-MS/MS 色谱条件:
[0050]色谱柱:Z0RBAX XDB_C18column，流动相:A:0.5%的甲酸水溶液和B: 100%的乙腈溶液，A:B=65:35，流速:0.3mL/min ;质谱条件:MRM模式，正离子扫描，检测对象:乙酰哈巴苷 429.2 — 369.2 ;肉桂酸 149.2 — 103.1。
[0051]所述步骤2米用电喷雾尚子源(ESI),正尚子模式，干燥气流速为10.0L/min ;干燥气温度为350°C ;喷雾器压力为20psi ;毛细管电压为3500V。
[0052]虽然，上文中已经 用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种血浆乙酰哈巴苷含量的测定方法，其特征在于:所述方法包括以下步骤: 1)血浆样品预处理: 含乙酰哈巴苷成分的含药血浆,加入内标溶液,再加入3飞倍血浆体积的100%的醇溶液涡旋混匀，高速离心，取上层澄清溶液于3(T70°C水浴中以氮气流吹干，用f 2倍血浆体积的流动相复溶，涡旋静置后高速离心，上层澄清溶液用LC-MS/MS法检测； 2)LC-MS/MS色谱条件: 色谱柱:ZORBAX XDB-C18column,流动相:Α:0.0-1.0%的甲酸水溶液和B:100%的乙腈溶液，A:B=85:15~40:60，流速:0.1-θ.5mL/min ;质谱条件:MRM模式，正离子扫描，检测对象:乙酰哈巴苷429.2 — 369.2 ;肉桂酸149.2 — 103.1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤I)中的内标溶液为肉桂酸溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述肉桂酸溶液的浓度为10-?00μg/mL。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤I)中加入的含药血浆与内标溶液的体积比为10:1。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤I)中的醇溶液为甲醇、乙醇或甲醇和乙醇的混合溶液。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤I)中的高速离心的转速大于或等于 10, 000r/min。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述方法中，步骤2)采用电喷雾离子源，正离子模式，干燥气流速为5.0-15.0L/min ;干燥气温度为15(T50(TC ;喷雾器压力为15~40psi ;毛细管电压为200(T5000V。
【文档编号】G01N30/88GK103901146SQ201210573019
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月25日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】温彬宇, 王锡娟 申请人:北京康辰药业有限公司