筛选方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及改善的筛选方法以及，具体地，涉及鉴定特异性针对差异的和/或不经常表达的配体的抗配体的筛选抗配体文库的方法。
【专利说明】筛选方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及改进的筛选方法以及，具体地，涉及筛选抗配体文库的方法，以鉴定对差异化表达的和/或不经常表达的配体特异的抗配体。
【背景技术】
[0002]基于蛋白质或多肽的文库经常用于对某些配体具有特异性的抗配体分子的选择。
[0003]此类文库的构造使蛋白质分子以某种方式物理地连接到(physically linkedto)编码特定蛋白质分子的遗传信息。因此，该蛋白分子与其基因一起被展示。
[0004]常用的展示形式依赖于细胞或病毒宿主颗粒来提呈所述蛋白分子；并且包括细菌展不(Francisco 等，1993)和卩遼菌体展不(Smith, 1985 ；Smith 和 Scott, 1993 ；ffinter 等，1994)。这些系统在宿主颗粒的表面展示潜在的抗配体分子，同时所展示分子的遗传信息藏于颗粒内部并且所述方法已被成功应用于基于特异性蛋白质的抗配体的筛选。
[0005]存在依赖于体外翻译的其他展示形式；包括各种形式的依赖于遗传信息与蛋白质分子的非共价连接的核糖体展示(Mattheakis等，1994 ；Hanes和Pluckthun, 1997 ；He和Taussig, 1997);并且其他展示形式也依赖于体外翻译，借此，在遗传信息和潜在抗配体蛋白质分子之间存在共价连接，例如Profusion (Weng等,2002)或共价展示技术(Gao等，1997)。
[0006]所展示的肽或蛋白质类抗配体库可以是完全随机化的，例如，当使用肽文库时，或它们可以基于插入赋予变异性的其他结构的恒定区的支架结构(constant regionscaffold structure)。
[0007]通常使用的支架结构基于抗体重链和轻链可变结构域(McCafferty等，1990),但还可以基于其它支架例如纤维连接蛋白(fibronectin) (Jacobsson和Frykberg,1995 ；Koide等，1998)、蛋白A结构域(Stahl等，1989)或小的稳定蛋白结构域，例如BPTI(Markland 等，1991)。
[0008]从展示文库选择显示一定的结合特异性的抗配体通常通过使用所谓“生物淘选(biopanning)”的方法来进行。
[0009]靶配体可以固定于固相表面并且文库的特异性抗配体成员暴露给固定的靶配体以使感兴趣的抗配体与靶配体结合。未结合的文库成员随后被洗去并且感兴趣的抗配体被回收并扩增。
[0010]除了抗配体文库成员之外的蛋白质类颗粒，例如表达抗体片段的噬菌体，可能是“粘性的(Sticky)”，导致一些非靶特异性分子的结合与分离。非特异性结合可以通过以下方式最小化:加入某些化合物至抗配体展示构建体/配体混合物中以用作阻断剂从而减少非特异性抗配体的背景结合，例如牛奶、牛血清白蛋白、血清(人/胎牛)、明胶以及对于某些(非细胞)应用，去污剂(detergent)。
[0011]许多洗涤程序已经被设计用来减少文库成员与细胞的非特异性结合，并帮助细胞从污染和/或非特异性结 合的文库成员上分离。[0012]此类方法包括洗涤通过磁力固定于柱子上的细胞(Siegel等，1997)，以最小化剪切力并允许解离的噬菌体的重新结合。洗涤细胞的另一个方法是在更高密度介质例如Ficoll或Percoll中离心，以选择性去除非特异性和低亲和力抗配体，并且进一步在空间上从游离抗配体和非特异性结合的抗配体中分离细胞和细胞结合的抗配体(Carlsson等，1988 !Williams和 Sharon，2002)。
[0013]取决于筛选方法(selection process)的有效性,可能需要几轮淘选来去除或至少充分减少非特异性抗配体至期望的水平(Dower等，1991)。
[0014]在另一个筛选方法(selection method)中，祀配体结合同处于溶液中的特异性抗配体文库成员。然后结合的抗配体通过采用例如可回收的标签而分离，所述标签附加至靶配体。最常使用的标签是生物素，其允许靶分子和所展示的特异性文库成员之间的复合体(complex)通过采用结合至固相支持物例如珠子上的亲和素而得到回收(Siegel等，1997)。
[0015]当靶配体是公知的且以纯化的形式提供时采用这些方法。一次针对一个单独靶配体的筛选是常规的。针对几种限定的靶配体的筛选可同时进行。靶配体可以是一种或更多种的小的半抗原、蛋白质、碳水化合物、DNA和脂类。
[0016]对于许多应用，针对差异表达的配体的特异性抗配体是感兴趣的。例如，当与那些健康对照相比，蛋白质可在源自患有疾病的患者的细胞和组织上差异表达。这些疾病包括微生物、病毒或寄生虫感染，哮喘，慢性炎症和自身免疫性疾病，癌症，神经、心血管或胃肠道疾病。相似的，体液的蛋白质组成，例如，血浆、脑脊液、尿液、精液、唾液和粘液，可能在健康对照和患有疾病的患者之间存在差异。
[0017]因此，除了它们作为鉴定差异表达的配体的研究工具的常规应用，特异性针对差异表达的配体的抗配体可以用作诊断、预防和/或治疗疾病的工具。
[0018]基因组学和蛋白质组学领域中的最新进展已经表明了许多至今尚未确定为差异表达的分子的存在，强调了用于针对这些潜在的靶配体产生特异性的抗配体的方法的重要性。
[0019]许多这些差异表达的分子被期望着表达在细胞表面上，借此组成采用例如特异性抗体的靶向治疗的潜在靶标，所述特异性抗体可以偶联至生物活性(例如细胞毒性)试剂上。
[0020]巨大并且高度多样性的抗配体展示文库提供特异性针对碳水化合物、蛋白质、月旨类或其组合作用的未知细胞配体的抗配体的分离方法。
[0021]原则上，当前可用的生物淘选过程包括基于全细胞、细胞部分和细胞膜的方法，其允许显示特异性针对天然构型的细胞膜配体的抗配体的展示构建体的分离。
[0022]人类和人源化的治疗性抗体日益被用于治疗各种疾病，包括急性和慢性炎症性疾病、免疫和中枢神经系统疾病以及癌症。人类治疗性抗体被认为是治疗人类疾病最吸引人的方式，这是由于它们完全的人类来源以及相关的免疫原性的缺乏，参与抗体Fe依赖的宿主免疫效应机制的优化能力，以及它们与其鼠源、嵌合和人源化的相似抗体相比优异的体内半衰期。现在人类抗体通常通过不同的技术产生，包括人源化小鼠和高度多样性的噬菌体抗体文库。
[0023]大的(>105独特 的(unique)抗体克隆)人类抗体文库足够多样性，包含特异性针对显著数量的抗原的高亲和力抗体，所述抗原包括几乎所有种类的自体抗原。在自体免疫疾病中，自体抗原是除了作为正常组织成分之外还是体液或细胞介导的免疫反应的靶标，代表了突出的治疗意义上的抗原种类。
[0024]人类抗体文库还被认为与携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠相比，当选择结合人类和小鼠之间结构上保守的受体表位的抗体时，提供了优势，因为这类抗体在体内是通过自身耐受机制负向选择的。这些保守的区域尤其具有治疗意义，因为保守区域经常是功能相关的(例如结合所必须的配体结合结构域并且赋予配体/受体诱导的细胞反应)，并且靶向这些保守表位的抗体可被筛选为协同实验疾病模型系统内的体内治疗活性。
[0025]特异性针对几乎所有种类人类可溶性抗原(例如细胞因子、趋化因子、生长因子、脂类、碳水化合物和缀合分子等)，以及细胞表面受体(例如1TM、4TM、7TM和多TM跨膜受体等)的高亲和力抗体已经成功从高度多样性人类抗体文库中分离出来。
[0026]细胞表面受体组成了一类具有突出的治疗意义的靶标，并且结合不同癌症细胞相关受体的几种抗体已被证实用于癌症治疗，包括利妥昔单抗(rituximab)(抗⑶20)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(抗 Her2)和西妥昔单抗(cetuximab)(抗 EGFR)。
[0027]但是，从抗体受体特异性并不能很容易地预测治疗的有效性；针对相同靶受体的抗体可能在治疗有效性上差别很大，不依赖于它们的结合亲和力(Beers等，2008 ；Cragg和Glennie，2004)，并且针对替代的分子靶标的抗体可能显示是有希望的，并且有时是意想不到的治疗潜力(Beck等，2010 ;Cheson和Leonard，2008)。例如，不同CD20特异性抗体克隆与CD20抗原具有相似的结合亲和力并携带相同的小鼠IgG2a恒定区，但在体内消耗B细胞的能力根本上不同(Beers等，2008 ；Cragg和Glennie，2004)，并且针对其他不是CD20的肿瘤相关细胞表面 受体的抗体可能具有针对B细胞癌症的显著抗肿瘤活性(综述请参见Cheson 和 Leonard,2008)。
[0028]因此，在高度多样性的抗体文库中，对任何给定类型的癌症最具治疗有效性的、强力的和最耐受的抗体很可能是特异性针对几种不同受体的任何一种，并且在高度多样性的文库中鉴定治疗性优化的抗体克隆需要对多个并且理想状况下所有的特异性针对不同疾病细胞相关的受体的文库成员进行功能筛选。
[0029] 申请人:之前已经开发了能够从人类噬菌体抗体文库回收结合至不同表面受体的抗体克隆的筛选技术(生物淘选方法)，与其他细胞群体(非靶细胞)相比所述受体在一种细胞群体(靶细胞)上差异表达(W02004/023140，Fransson 等，2006 ；Frendeus, 2006)(在下文中被称为差异生物淘选)。W02004/023140的公开内容(和其所有国家阶段递交的衍生内容)全文作为参考引入本发明。
[0030]这个筛选方法实质上包括六个步骤，如图1所示。重要的是，这个方法包括以下顺序的筛选步骤:
[0031]I)差异生物淘选，然后
[0032]2)筛选靶标对非靶标的特异性，然后
[0033]3)更小量的克隆通过Sanger技术进行常规测序
[0034]采用这个技术，使得产生显示针对差异表达表面受体的靶细胞对非靶细胞的高特异性的抗体池成为可能。
[0035]Sanger测序是当前用于在“低通量”方式下鉴定独特结合物的技术的一个例子。其他例子包括在限制性酶消化之前和之后跑抗体基因DNA的胶，并通过对不同的限制性酶(间接地，不同的序列)不同的敏感性揭示独特大小。
[0036]当用于分离靶向癌症B细胞(靶标)对T细胞(非靶标)差异表达的表面受体的抗体时(“B非T” (BnonT)差异淘选)，该方法鉴定了针对不同靶细胞差异表达的表面受体的抗体，包括HLA-DR、表面Ig和ICAM-1 (表1)。
[0037]表1.通过现有筛选方法分离的抗体的频率和特异性，例如连续差异生物淘选、结合筛选和Sanger测序，靶向癌症B细胞对T细胞差异表达的表面受体(“B非T”差异淘选)
[0038]
【权利要求】
1.一种分离针对至少一种差异表达的靶配体的至少一种抗配体的方法，包括以下步骤: (a)对抗配体的文库进行差异生物淘选以分离至少一种抗配体；以及 (b)对步骤(a)中分离的抗配体进行高通量测序。
2.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤: (c)对特异性针对差异表达的配体的抗体进行验证筛选。
3.如前述权利要求任一项所述的方法，其中差异生物淘选步骤包括以下子步骤: (i)提供抗配体的文库； (ii)提供含有固定至或整合入减法配体构建体的配体的第一配体群； (iii)提供含有固定至或整合入靶配体构建体的、与步骤(ii)的配体相同的配体的第二配体群； (iv)通过使用从质量作用的普遍规律得出的一个或多个方程确定群中减法配体构建体和靶配体构建体的量:
4.如前述权利要求任一项所述的方法，其中高通量测序步骤利用454测序、Illumina、SOLiD方法或Helicos系统进行。
5.如前述权利要求任一项所述的方法，其中验证筛选步骤利用流式细胞术、FMAT、ELISA、MSD 或 CBA 进行。
6.如权利要求3所述的方法，其中配体不表达于靶构建体或减法构建体之一。
7.如权利要求3或6所述的方法，包括从配体释放抗配体的进一步步骤。
8.如权利要求3或6或7所述的方法，其中步骤(ii)至(ix)平行进行，以分离针对多个不同配体的多个抗配体。
9.如权利要求3或6-8所述的方法，其中步骤(ii)至(ix)重复一次或多次。
10.如权利要求3或6-9所述的方法，其中减法构建体或靶构建体之一的量以过量于减法构建体或靶构建体另一个的方式提供。
11.如权利要求10所述的方法，其中配体的过量在10和1000倍之间或在2和10倍之间或1000和I, 000，000倍之间。
12.如权利要求3或6-11所述的方法，其中步骤(iv)的方程是:
13.如权利要求3或6-12所述的方法，其中分离装置选自固相支持物、细胞膜和/或其部分、合成膜、珠子、化学标签和自由配体的至少一种。
14.如权利要求3或6-13所述的方法，其中减法构建体和靶构建体的分离装置具有不同的密度。
15.如权利要求3或6-14所述的方法，其中减法构建体的分离装置为膜囊或整个细胞膜。
16.如权利要求3或6-15所述的方法，其中步骤(ix)利用密度离心、固相支持封存、磁珠封存、化学标签结合和水相分配的至少一种进行。
17.如前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(a)的文库是包含多个展示抗配体的文库成员的展示文库。
18.如前述权利要求任一项所述的方法，其中文库是噬菌体展示文库。
19.如前述权利要求任一项所述的方法，其中配体是抗原；受体配体；以及含有碳水化合物、蛋白质、肽、脂类、多核苷酸、无机分子和缀合分子的至少一种的酶靶标的至少一种。
20.如前述权利要求任一项所述的方法，其中抗配体文库可通过抗体和抗原结合性变体、其衍生物或其片段；具有工程化的可变表面的支架分子；受体；和酶的至少一种进行构建。
21.如权利要求3或6-20所述的方法，其还包括暴露配体及其分离装置至影响靶配体在所述配体构建体上的表达的刺激物的进一步步骤。
22.—种制备药物组合物的方法，其包括，在通过前述权利要求任一项所述的方法鉴定具有期望性质的抗配体后，将所述抗配体加至药学上可接受的载体。
23.由权利要求22的方法制备的药物组合物，其用于医药中。
24.权利要求23的药物组合物在制备用于预防、治疗、成像、诊断或预后疾病的药物中的用途。
25.实质上如本发明·实施例和附图所述的方法。
【文档编号】G01N33/68GK103827302SQ201280046053
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年9月20日 优先权日:2011年9月22日
【发明者】比约恩·弗伦多斯, 詹妮·马特森 申请人:生物发明国际公司