人类血液和血液制品中非典型抗体的鉴定的制作方法
【专利摘要】本文描述了用于鉴定血液或血液制品制造过程中非典型抗体的方法，所述非典型抗体可在对中间产物或终产物的质量控制测试中产生假阳性。
【专利说明】人类血液和血液制品中非典型抗体的鉴定
【技术领域】
[0001]本文描述了用于鉴定血液和血液制品(blood product)中非典型抗体的方法。
[0002]背景
[0003]在USP热原测试中已经鉴定出导致致热反应(pyrogenic response)的天然人类抗体。一些人类供体天然地产生这些“非典型抗体”，可能是暴露于兔、啮齿类动物、或猎食此类宿主动物的寄生昆虫(即，跳蚤)导致的。非典型抗体是异常和不常见的，但对人类无害。非典型抗体可与兔白血细胞抗原交叉反应并在兔热原测试中导致致热反应。然而，致热反应是“假阳性”结果，因为其他方法诸如鲎阿米巴样细胞溶解物检验(LAL)显示，在兔检验中给出致热反应的可疑血浆样品并不包含内毒素。此外，体外热原测试(又称单核细胞活化测试)的结果指示不存在非内毒素热原。因此，人类血液或血浆中的非典型抗体导致错误的兔热原测试结果，并可导致丢弃被错误地测试为“致热的(pyrogenic)”阳性的单独或汇集的血液或血浆。
[0004]本文描述的方法允许鉴定包含在热原检验中导致假阳性的非典型抗体的血液或血浆样品。这一方法是有利的，因为包含非典型抗体的样品可在与其他血液或血浆汇集并污染池之前被清除。因此，该方法通过阻止血液或血浆池被由于存在非典型抗体而表现“致热的”样品的不必要的污染，减少制造成本。本文描述的高通量测试方法允许鉴定可疑的假阳性样品。此类样品可在与其他样品汇集之前被丢弃并阻止池被非典型抗体污染。
[0005]概述
[0006]本文描述了用于鉴定血液和血液制品中非典型抗体的方法。
[0007]本文描述的一个方面是用于鉴定血液制品制造过程中非典型反应性抗体的方法，所述方法包括:(a)获得血液或血浆的样品；(b)利用以下的任何一种或多种测试所述样品和对照:细胞凝集、荧光显微术、免疫沉淀、免疫扩散、免疫荧光法、ELISA、流式细胞术、FACS或蛋白质印迹法；(c)比较所述样品和对照的测试结果；(d)确定所述样品是否包含反应性非典型抗体；和；(e)如果所述样品包含反应性非典型抗体，则阻断(interdicting)为所述样品来源的血液或血浆装置(unit)。
[0008]本文描述的另一方面是用于鉴定血液制品制造过程中非典型反应性抗体的方法，所述方法包括:(a)获得血液或血浆的样品；(b)利用细胞凝集检验测试所述样品和对照；(C)比较所述样品和对照的测试结果；(d)确定所述样品是否包含反应性非典型抗体；和；
(e)如果所述样品包含反应性非典型抗体，则阻断为所述样品来源的血液或血浆装置。
[0009]本文描述的另一方面是用于鉴定血液制品制造过程中非典型反应性抗体的方法，所述方法包括:(a)获得血液或血浆的样品；(b)利用流式细胞术测试所述样品和对照；(C)比较所述样品和对照的测试结果；(d)确定所述样品是否包含反应性非典型抗体；和；(e)如果所述样品包含反应性非典型抗体，则阻断为所述样品来源的血液或血浆装置。
[0010]本文描述的另一方面是用于鉴定血液或血衆制品(plasma product)制造过程中非典型反应性抗体的方法，所述方法包括:(a)获得血液或血浆的样品；(b)利用蛋白质印迹法测试所述样品和对照；(C)比较所述样品和对照的测试结果；(d)确定所述样品是否包含反应性非典型抗体；和；(e)如果所述样品包含反应性非典型抗体，则阻断为所述样品来源的血液或血浆装置。
[0011]本文描述的另一方面是用于评价血液制品制造过程中可能的假阳性热原测试结果的方法，所述方法包括:(a)获得血液或血液制品的样品；(b)利用以下测试所述样品和对照:荧光显微术、免疫沉淀、免疫扩散、免疫荧光法、ELISA、流式细胞术、FACS或蛋白质印迹法；(C)利用鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)或类似的检验测试所述样品和对照；(d)比较两种检验中所述样品和对照的测试结果；(e)评价所述样品是否给出假阳性热原测试结果；和(f)如果所述样品包含反应性非典型抗体，则阻断为所述样品来源的血液或血浆装置。
[0012]附图简述
[0013]图1:兔WBC凝集检验的显微术。将供体X和对照血浆与兔WBC —起培养，且然后利用显微术观察。用供体X血浆(A、c)或对照血浆(B、D)培养的兔白血细胞的光(A、B)和相差(C、D)显微照片。用供体X血浆观察到凝集(A、C)，但用血浆对照未观察到(B、D)。
[0014]图2:人类WBC凝集检验的显微术。将供体X和对照血浆与人类WBC —起培养，且然后利用显微术观察。用供体X血浆(A、C)或对照血浆(B、D)培养的人类白血细胞的光(A、B)和相差(C、D)显微照片。用供体X血浆(A、C)或血浆对照(B、D)未观察到凝集。
[0015]图3:供体X兔WBC凝集的相差和荧光显微术。将供体X和对照血浆与兔WBC —起培养，与荧光素标记的抗人类IgG反应，且然后利用相差或荧光显微术观察。图(A)显示用供体X血浆培养的兔WBC的相差显微照片。图(B)显示用供体X血浆培养且然后用荧光素标记的抗人类IgG处理的兔WBC的荧光显微照片。在凝集的细胞簇中观察到强荧光，说明来自供体X血浆的人类IgG负责细胞凝集。
[0016]图4:兔WBC凝集检验的荧光显微术。将供体X和对照血浆与兔WBC —起培养且然后与荧光素标记的抗人类IgG反应。图(A)显示兔WBC的阳性荧光。图(B)显示对照血浆的结果。
[0017]图5:兔WBC凝集检验的荧光显微术。将供体X和对照血浆与兔WBC —起培养，与荧光素标记的抗人类IgG反应，且然后利用荧光显微术观察。图(A)显示用荧光素标记的抗人类IgG培养的兔WBC的阳性荧光和凝集的细胞的40X图(底图)。这些结果说明，供体X的血浆包含与兔WBC细胞表面抗原反应性的IgG。图(B)显示用对照血浆观察的弱荧光和兔WBC的相差显微照片，未显示凝集(底图)。
[0018]图6:人类WBC凝集检验的荧光显微术。将供体X和对照血浆与人类WBC —起培养，与荧光素标记的抗人类IgG反应，且然后利用荧光显微术观察。(A，供体X)和(B，对照血浆)都不具有强荧光或凝集(底图)，说明供体X的血浆包含不与人类WBC细胞表面抗原反应性的IgG。
[0019]图7:荧光流式细胞术柱状图。用供体X或对照血浆培养兔WBC，与荧光素标记的抗人类IgG反应，且然后通过流式细胞术分析。柱状图显示观察的相对荧光。图A和B显示两个分别的实验。供体X血浆给出最大信号，相对荧光是对照血浆的至少三倍。参见表4和5的定量结果。
[0020]图8:荧光流式细胞术柱状图。用供体X或对照血浆培养人类WBC，与荧光素标记的抗人类IgG反应，且然后通过流式细胞术分析。柱状图显示观察的相对荧光。图A和B显示两个分别的实验。供体X血浆与对照血浆无显著不同。参见表6和7的定量结果。
[0021]图9:包含致热的IGIV-C的供体X血浆分离物样品的电泳和蛋白质印迹法分析。泳道1:丽标志；泳道2:致热的IGIV-C (供体X);泳道3:无热原IGIV-C ;泳道4:兔血清；泳道5:胎牛血清；泳道6:马血清。(A)速蓝(Instant Blue)染色的凝胶。(B)用抗人类IgG碱性磷酸酶免疫共轭物(IgG-AP)探测的蛋白质印迹对照(无一抗)。(C)利用包含致热的IGIV-C的供体X血浆分离物作为一抗和抗人类IgG-AP的蛋白质印迹。(D)利用无热原IGIV-C作为一抗和抗人类IgG-AP的蛋白质印迹。
[0022]图10:包含致热的IGIV-C的供体X血浆分离物样品的电泳和蛋白质印迹法分析。泳道1:丽标志；泳道2:胎牛血清；泳道3:兔血清；泳道4:1:5稀释的兔血清；泳道5:1:10稀释的兔血清；泳道6:1:50稀释的兔血清。(A)用抗人类IgG碱性磷酸酶免疫共轭物(IgG-AP)探测的蛋白质印迹对照(无一抗)。(B)利用包含致热的IGIV-C的供体X血浆分离物作为一抗和抗人类IgG-AP的蛋白质印迹。(C)利用无热原IGIV-C作为一抗和抗人类IgG-AP的蛋白质印迹。(D)速蓝染色的凝胶。
[0023]图11:供体X的血浆与大鼠WBC交叉反应:大鼠WBC凝集检验的荧光显微术。用供体X或对照血浆培养大鼠WBC，与荧光素标记的抗人类IgG反应，且然后利用荧光显微术观察。图(A)显示用荧光素标记的抗人类IgG培养的大鼠WBC的阳性荧光和凝集，和凝集的细胞的40X图(底图)。这些结果说明，供体X的血浆包含与大鼠WBC细胞表面抗原反应性的IgG。图(B)显示用对照血浆观察的弱荧光和大鼠WBC的40X图，未显示凝集(底图)。
[0024]详述
[0025]本文描述了用于鉴定血液和血液制品中非典型抗体的方法。在本文称为“供体X”的个体捐赠与其他装置汇集的血浆，用于制造生物治疗蛋白制品。在加工期间，利用USP致热原性兔检验来检验汇集的血浆的致热原性。意外地，汇集的血浆在USP兔测试中被测试为致热阳性的。进一步的检验追踪致热因素到供体X的血浆。鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)检验显示，供体X血浆未被细菌内毒素污染。相反，本文描述的检验证明，供体X的血浆包含负责致热反应的非典型抗体。具体地，光和荧光显微镜检查显示，供体X血浆使得兔和大鼠WBC而非人类WBC凝集。兔WBC交叉反应性是对供体X特异性的，因为来自供体X的父母、同胞和子女的血浆不反应。荧光流式细胞术实验显示，供体X血浆包含与兔WBC细胞表面抗原反应性的IgG抗体且蛋白质印迹实验证实该IgG与兔血清的反应性。总之，这些结果说明，供体X可能已经被暴露于可具有与兔WBC的诱导的体液免疫交叉反应性的啮齿类动物或啮齿类动物的虫媒。如此，来自一些个体的血浆在USP兔热原测试可被测试为阳性，不是因为它们被细菌污染，而是因为它们包含与兔WBC抗原交叉反应性的非典型抗体。
实施例[0026]实施例1
[0027]美国药典(USP)热原检验
[0028]现有的美国药典§ 151概述了热原检验。测试包括在静脉注射测试溶液后测量兔体温的升高。这一检验旨在确定产物(product)以在不多于10分钟的时间段内静脉注射不超过10mL/kg的剂量是否可被测试兔耐受。最初注射三只兔。如果任何兔显示单独的体温升高≥0.5°C，则利用五只另外的兔继续测试。如果八只兔中的三只或更多显示单独的体温升高≥ 0.5°C和/或八个单独的体温升高的总和超过3.3°C，则认为所检查的材料是致热的。
[0029]将供体X血浆或无任何供体X血浆的汇集样品的样品1:100稀释到IOmL氯化钠溶液(0.9%NaCl)中，并注射到三只健康成年兔的耳静脉中。在注射10分钟内直肠测量兔的体温。体温数据显示在表1中。无供体X的血浆样品在任何兔中都不引起体温增加。与之相比，当测试供体X血浆时，测量到1.1 - 1.2°C之间的体温增加。因为3只兔的总体温增加是3.4°C，认为供体X血浆是致热的，且不需要扩展测试到另外5只兔。
[0030]利用蛋白A柱捕获包含0%或10%供体X血浆的池中的免疫球蛋白并测试致热原性。无供体X的血浆样品未引起体温增加，但包含供体X血浆的样品是高度致热的。这些结果说明，兔中的致热反应可与供体X血浆中的免疫球蛋白关联。
[0031]
【权利要求】
1.一种用于鉴定血液制品制造过程中非典型反应性抗体的方法，所述方法包括: (a)获得血液或血浆的样品； (b)利用以下的任何一种或多种测试所述样品和对照:细胞凝集、荧光显微术、免疫沉淀、免疫扩散、免疫荧光法、ELISA、流式细胞术、FACS或蛋白质印迹法； (c)比较所述样品和对照的测试结果； (d)确定所述样品是否包含反应性非典型抗体；和； (e)如果所述样品包含反应性非典型抗体，则阻断为所述样品来源的血液或血浆装置。
2.一种用于鉴定血液制品制造过程中非典型反应性抗体的方法，所述方法包括: (a)获得血液或血浆的样品； (b)利用细胞凝集检验测试所述样品和对照； (C)比较所述样品和对照的测试结果； (d)确定所述样品是否包含反应性非典型抗体；和； (e)如果所述样品包含反应性非典型抗体，则阻断为所述样品来源的血液或血浆装置。
3.一种用于鉴定血液制品制造过程中非典型反应性抗体的方法，所述方法包括: (a)获得血液或血浆的样品； (b)利用流式细胞术测试所述样品和对照； (C)比较所述样品和对照的测试结果； (d)确定所述样品是否包含反应性非典型抗体；和； (e)如果所述样品包含反应性非典型抗体，则阻断为所述样品来源的血液或血浆装置。
4.一种用于鉴定血液或血浆制品制造过程中非典型反应性抗体的方法，所述方法包括: (a)获得血液或血浆的样品； (b)利用蛋白质印迹法测试所述样品和对照； (C)比较所述样品和对照的测试结果； (d)确定所述样品是否包含反应性非典型抗体；和； (e)如果所述样品包含反应性非典型抗体，则阻断为所述样品来源的血液或血浆装置。
5.一种用于评价血液制品制造过程中可能的假阳性热原测试结果的方法，所述方法包括: (a)获得血液或血液制品的样品； (b)利用以下测试所述样品和对照:荧光显微术、免疫沉淀、免疫扩散、免疫荧光法、ELISA、流式细胞术、FACS或蛋白质印迹法； (c)利用鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)或类似检验测试所述样品和对照； (d)比较两种检验中所述样品和对照的测试结果； (e)评价所述样品是否给出假阳性热原测试结果；和 (f)如果所述样品包含反应性非典型抗体，则阻断为所述样品来源的血液或血液制品>j-U ρ?α装直。
【文档编号】G01N33/80GK103814296SQ201280046051
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月22日 优先权日:2011年12月21日
【发明者】克拉克·塞沃斯, 约安·霍塔 申请人:基立福有限公司