蛋白偶联的试剂化合物的整体分子量测定的制作方法

蛋白偶联的试剂化合物的整体分子量测定的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于快速测定药物偶联物连接于链间半胱氨酸残基所致的非共价结合抗体重链(HC)和抗体轻链(LC)的完整分子量的方法和系统。通过使用天然脱盐条件分析抗体-药物偶联物(ADC)，ADC的完整-二价结构得以维持，该二价结构通常会因LCMS常用的变性色谱条件而降解。随后使用去溶剂化和离子化的ESI-MS条件测定脱盐ADC的分子量。本文中描述的方法用于直接测量在链间半胱氨酸残基上偶联的ADC的完整分子量。本文描述的方法也用于个体ADC种类的相对定量测得。
【专利说明】蛋白偶联的试剂化合物的整体分子量测定
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年9月29日提交的美国临时申请序列号61/540，839和2012年9月12日提交的美国临时申请序列号61/701，489的优先权和利益，二者通过引用的方式将它们整体引入在此。
[0003]发明背景
[0004]抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates, ADC)是将有效负荷祀向递送至革巴标的化合物。在许多实例中，靶标是肿瘤相关的抗原(TAA)，有效负荷是药物。
[0005]抗体分为许多类别，包括IgGl和IgG2。IgGl和IgG2抗体的结构包括2条重链(HC)和2条轻链(LC)。两条重链和两条轻链表现为一复合体组成完整抗体。各IgGl抗体通过各抗体链上相应的半胱氨酸氧化形成12个链内和4个链间二硫键。在重链和轻链之间具有两个二硫键，在重链和重链之间具有两个二硫键。完全的还原IgG I抗体的链间二硫键会导致抗体复合物依靠非共价相互作用维持。
[0006]完全还原IgG I抗体的链间二硫键会产生八个可使用的(accessible)硫醇以便与药物偶联，一般通过接头。改变还原参数能够得到具有O至8个硫醇以供偶联的抗体同分异构体。例如，使用DTT还原IgG I能够产生具有2、4、6或8个可用硫醇的抗体。充分还原的ADC靠非共价相互作用，例如氢键、离子键、疏水和范德华相互作用维持在一起，在变性条件下(例如，反相色谱)将会分离为轻和重链。非充分还原的ADC靠共价的和非共价相互作用维持在一起。在变性条件下，依靠共价键维持在一起的非充分还原的ADC也可能被分离。
[0007]充分负载的IgG I ADC中的一个药物分子构成抗体的二硫键的每一个半胱氨酸，每个抗体总计有八个药物。部分负载的ADC —般具有2、4或6个药物分子连接在半胱氨酸残基上。也观察到部分负载的ADC具有1、3、5个药物分子连接在半胱氨酸残基上。虽然通过质谱(MS)测定了负载ADC的组成片段的分子量，但本发明所属领域仍存在测定负载ADC的整体分子量的问题。
[0008]虽然缺乏直接测定负载ADC的整体分子量的技术，但已知测量负载ADC的整体分子量的各种间接手段。例如，采用以下方法测量ADC的分子量:在有低浓度有机溶剂或没有有机溶剂存在下，将样品(例如，ADC)结合至加热的反相高效液相色谱柱(rp-HPLC)，所述有机溶剂典型地也包含离子配对酸(例如，三氟乙酸)并且能将不挥发的盐和表面活性剂自样品中洗脱(通常称为脱盐)。在此例中，通过提高溶剂中有机组分的含量至某一点，在该点疏水的蛋白结构域和rp-HPLC色谱柱表面的相互作用被非极性有机溶剂破坏，从而将蛋白从rp-HPLC色谱柱上洗脱下来。该技术的不良影响是蛋白质结构因蛋白样品经历加热、酸和有机溶剂而破坏，其中任一因素都能使蛋白变性并破坏蛋白的结构。当非共价的蛋白复合物经历rp-HPLC时，它们会降解为构成它们的共价实体。以具有8个链间连接的半胱氨酸药物的IgGl抗体为例，在rp-HPLC柱上作脱盐导致ADC完全分解为每链3个药物的重链和每链I个药物的轻链。虽然可以通过质谱(MS)测定组分片段的分子量，但是本发明所属领域缺乏测定完整实体的分子量的方法。[0009]目前的MS技术无法测定ADC整体分子量，部分是因为这些技术导致蛋白的变性和/或就本文考虑的应用而言耗费太多时间。事实上蛋白的所有天然电喷雾电离(nativeelectrospray ionization) (ESI)质谱方法均规定该过程应在纳米喷雾(nanospray)水平(流速为100至500纳升/分钟)以最大程度降低蛋白结构的损坏，而这些损坏在标准ESI所用的加热护套和去溶剂化气体中可能发生。采用常规纳米喷雾ES1-MS技术测定ADC天然分子量的样品处理过程非常耗时并且无法满足高通量。即便不包括抗体去糖基化(deglycosylate)的时间，每个样品至少需要一小时才能获得分子量测定值。
[0010]而且，分析链间半胱氨酸-连接的ADC的已知方法既不能满足在线质谱法(spectrometry)(例如，HIC),又在层析分离和随后的分子量测定(例如，rp-HPLC)过程中导致偶联的重链和轻链变性分解。因此，本发明所属领域需能够常规和快速地测定半胱氨酸-连接ADC的整体分子量的方法。
[0011]令人意外地，通过提供检测非共价结合的蛋白药剂偶联物的分子量的方法、设备和系统，本发明满足了这一需求以及相关领域中其它未满足的需求。
[0012]发明概述
[0013]在第一方面,本发明提供了检测蛋白药剂偶联物(protein agent conjugate)分子量(mass)的方法。该方法包括以下步骤，在挥发性盐且不含非挥发性盐的条件下提供非共价结合且未变性的蛋白药剂偶联化合物(protein agent conjugate compound);将蛋白药剂偶联化合物引入质谱仪；和，通过质谱直接确立所述蛋白药剂偶联化合物的分子量。
[0014]在第二方面，本发明提供了系统，例如，但不限于，设置为用于执行本文所述方法之一的质谱仪。
[0015]附图简述
[0016]图1显示MR为O至8的各种代表性ADC的IgGl结构，包括异构体，将抗体和药剂偶联产生，所述药剂，在一方面为药物，在另一方面为标记物，在还有另一方面为毒素。ADC中抗体(图中示为mAb) (MR = 0)亚基间的二硫连接桥连接于药物，产生非共价结合的2LC-2HC药物-连接的种类。
[0017]图2显示在变性的和非变性条件下，与去糖基化mAb-A的分子量检测值相关的未处理的和去卷积的MS。在变性条件下获得的未处理的和去卷积的MS数据分别显示于图A和C中，在非变性条件下获得的未处理的和去卷积的MS数据分别显示于图B和D中。图B中在200和3500m/z之间(该区域是变性抗体明显的区域)明显的离子是存在用来去糖基化的PNG酶F (PNGase F)和非离子去垢剂吐温_80所致。
[0018]图3显示在变性的和非变性条件下，去糖基化马来酰亚胺己酰基单甲基奥利司他汀 F(deglycosylated maleimidocaproyl monomethyl auristatin F, mcMMAF)偶联物ADC-A的分子量检测值相关的未处理和去积MS。在变性条件下获得的未处理和去卷积MS数据分别显示于图A和C中，在非变性条件下获得的未处理和去卷积MS数据分别显示于图B和D中。完整ADC-A的多个荷电离子在图B中用括号示出；图C和图D中存在的去卷积化人工结果用星号不出。
[0019]图4显示去糖基化马来酰亚胺己酰基单甲基奥利司他汀F (mcMMAF)偶联物ADC-A和相应母体物质，mAb-A的去卷积质谱图。非共价结合的ADC结构显示在MS中相应离子上。
[0020]图5显示去糖基化mc-Val-Cit-PAB单甲基奥利司他汀E(vcMMAE)偶联物ADC-B和相应母体物质，mAb-A的反卷积质谱图。非共价结合的ADC结构显示在MS中相应离子上。
[0021]图6 显示每 IgGlADC-A 的 vcMMAF(图 A)和每 IgG I ADC-B 的 vcMMAE(图 B)的摩尔比的相对水平，通过从去反卷积质谱作基于MS的定量和通过HIC分离诸种类的UV积分测定。
[0022]图7显示脱盐ADC和相应初始材料的双柱SEC分析的色谱图对比。
[0023]图8显示MR值为0、2、4、6、8的偶联物物在各盐浓度下的vcMMAE相对百分比。
[0024]图9显示通过HIC分离mcMMAF ADC (图A)，随后通过SEC-MS分析收集的组分(图B)的表征结果。
[0025]图10显示HIC分离的各组分的分析，显示可采用SEC-MS，通过解离片段的分子量来评估ADC多肽链上的药物连接位置。
[0026]图11显示具有MR = 0、2、4、6或8的蛋白药剂偶联物的去卷积MS分子量检测值。
[0027]图12显示具有MR = 0、2、4、6或8的蛋白药剂偶联物的去卷积MS分子量检测值。
[0028]发明详述
[0029]1.概述
[0030]本发明提出了用于检测非共价结合蛋白药剂偶联化合物分子量的方法。这些方法包括步骤:(a)在基质中提供蛋白药剂偶联化合物；(b)将洗脱的蛋白药剂偶联化合物引入质谱仪；和(C)通过质谱直接确立所述蛋白药剂偶联化合物的分子量。在进一步地实施方式中，在所述蛋白药剂偶联化合物的非变性条件下应用分离介质以实现将所述蛋白药剂偶联化合物与所述基质分离。在部分的这些实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是基本上未变性的。在进一步的实施方式中，所述非变性的蛋白药剂偶联化合物在挥发性盐中从分离介质化合物洗脱。
[0031]1.定义
[0032]除非另有定义，本文中使用的所有的词语、符号和其它科技词语或术语均具有本发明所属领域的技术人员常规理解的含义。在一些例子中，本文定义具有常规理解意义的词语是为了清晰和/或便于参考起见，本文包括这些定义不应当理解为表示与本领域常规理解的有实质性不同。此处描述或引用的很多技术和方法是熟知的，并且可由本领域技术人员采用常规方法加以利用。如果合适，涉及使用商业可得的试剂盒和试剂的方法通常按照供应商确定的方案和/或参数进行，除非另有说明。
[0033]当本文使用商品名时，应独立包括含该商品名产品的配方、通用药物和该商品名产品的一种或多种药学活性成分。
[0034]本文所用的缩写“MR”指偶联于，例如蛋白或抗体的药物分子数量。例如，MR = O意味着没有药物分子偶联至给定的蛋白或给定的抗体。MR = 8意味着有8个药物分子偶联至给定的蛋白或给定的抗体上。MR可以包括0、1、2、3、4、5、6、7和8。
[0035]除非另有陈述，本文中使用的以下术语和短语应具有如下的含义:
[0036]本文所用的术语“ADC”指抗体药物偶联物。ADC的抗体部分对抗原具有特异性。感兴趣的抗原包括但不限于，⑶30、⑶40、⑶19、⑶33和⑶70。
[0037]本文所用的术语“蛋白”指包含一个或更多个通常折叠成三维形式的多肽的化合物，其可以促进生物学功能。
[0038]本文所用的术语“多肽”指氨基酸及其等价物的聚合物，且并不指特定的产物长度；因此，“肽”和“蛋白”包括在多肽的定义中。本文定义的“抗体”也包括在蛋白的定义中。“多肽区域”指多肽的区段，该区段可能包含，例如，一个或多个结构域或基序(例如，抗体的多肽区域可包含，如一个或多个OTR)。
[0039]本文所用的术语“片段”指多肽的一部分，通常具有该多肽的至少20个连续的或至少50个连续的氨基酸。
[0040]本文所用的短语“非共价结合的蛋白”指这样一种蛋白，其中多肽链之间的至少一个共价结合作用被破坏但该蛋白维持其完整的三级或四级结构。例如，参考ADC，非共价结合蛋白是其链间的二硫键经历还原却仍维持其整体结构的蛋白(例如，两条重链仍然维持与两条轻链结合)。ADC为共价和非共价相互作用的复合体。在一些ADC中仍保留共价相互作用，例如，那些具有2、4或6个药物负载的ADC。在具有2个药物负载的ADC例子中，该ADC在两条重链间和一条轻链-重链间具有共价的链间二硫键，在其它轻链-重链存在非共价结构。同样地，在负载有4个药物的ADC中，其也是由重链和轻链间的共价和非共价相互作用构成的复合体。
[0041]本文所用的短语“蛋白药剂偶联化合物”指这样一种化合物，该化合物包含与药剂偶联的蛋白。该蛋白可以但不限于，抗体、抗体片段、Fe融合蛋白、或非共价蛋白复合体，在某些方面，该蛋白可以为抗体。在另一方面，该蛋白是抗体片段。在其它方面，该蛋白可以为Fe融合蛋白。在还有其它方面，该蛋白可以由亚基的复合体组成，而所述亚基不是通过共价键键合。这类蛋白的例子是血红蛋白，其是非共价结合的2条α链和2条β链的四聚体；伴刀豆球蛋白Α，其是四聚体；雌激素受体，其是二聚体。Fe融合蛋白包括将功能蛋白或蛋白结构域嫁接至Fe 二聚体,其中Fe单体由Fe绞链区的半胱氨酸残基键合。该蛋白可以具有四级结构，该四级结构仅由非共价相互作用维持而不是由共价键维持。一个例子是血红蛋白，血红蛋白包含在变性条件下能够解离的4个亚基。血红蛋白的半胱氨酸可以偶联药物，但是，相对于抗体，该半胱氨酸不参与将亚基结构共价结合在一起。
[0042]本文所用的术语“药剂”指药物、标记物、毒素等。
[0043]本文所用的术语“基质(matrix) ”指蛋白或蛋白药剂偶联化合物存在的环境或背景。例如，“基质”包括制剂缓冲液、生物学血清、表面活性剂、赋形剂或细胞培养介质。
[0044]本文所用的短语“非变性条件”指蛋白(例如，抗体)不丧失其二级、三级或四级结构的条件。非变性条件包括不存在超过能引起热解折叠的高温(例如，50°C或更高)和极端pH(例如，低于pH5和高于pH8)。
[0045]本文所用的短语“非变性蛋白”意为维持其二级、三级和，在适用情况下，四级结构的蛋白(例如，抗体)。
[0046]本文所用的术语“还原的蛋白”(例如，抗体)指其链间二硫键已被破坏的蛋白。
[0047]本文所用的短语“变性的蛋白”(例如，抗体)指那些已经丧失了其二级、三级或四级结构的蛋白。
[0048]本文所用的术语“实质性(substantially) ”指测得数量的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的蛋白(如，抗体)在分离介质步骤(例如，通过SEC)后是非变性的，该数量通过通过从去反卷积质谱作基于MS的定量测得和通过HIC分离诸物质的UV积分测定的摩尔比的相对水平测得。
[0049]本文所用的术语“洗脱剂”指将分析物与色谱柱固定相分离的液体流动相。分析物包括但不限于，一种或多种待测量的感兴趣化合物。
[0050]本文所用的术语“直接地”是指确立蛋白(包括蛋白药剂偶联化合物)分子量的前后关系，包括测量完整的四元整体C1Uaternar ensemble),例如完整的实体,如抗体复合物的分子量。
[0051]本文所用的术语“间接地”是指通过以下方式测量蛋白(包括蛋白药剂偶联化合物)的分子量，测量组成四元整体的亚基，如抗体的轻链和重链的分子量，然后将这些分子量相加获得完整实体的分子量。
[0052]“脱盐”是指将蛋白(包括蛋白药剂偶联化合物)样品与非挥发性盐、赋形剂和/或表面活性剂分离。
[0053]“挥发性盐”指在环境大气压下(I个大气压)能够进入气相的盐。挥发性盐包括，例如，甲酸铵、乙酸铵、碳酸铵。
[0054]“表面活性剂”包括，但不限于，基质的非挥发性化合物。例如，表面活性剂包括非离子和两性离子洗涤剂，如聚山梨醇酯20 ( “吐温20”)和聚山梨醇酯80 ( “吐温80”)。
[0055]“离液剂(chaotropic agent) ”指这样一种化学物质,能够使得蛋白间的或蛋白内亚结构间的氢键、范德华力和疏水作用不稳定，并随后导致变性。代表性的化合物包括，但不限于，盐酸胍、尿素和其它本领域技术人员已知的其它化合物。
[0056]“赋形剂”包括例如糖、多元醇等化合物，例如，蔗糖、海藻糖和山梨醇。
[0057]“质谱”(MS)是分析技术，用来测定带电粒子的质荷比。它可用于阐明蛋白的一级结构。
[0058]“液相色谱”或“LC”指分离混合物的方法。混合物溶解在称为流动相的液体中，流动相携带混合物穿过称为固定相的结构。在尺寸排阻色谱(SEC)中，混合物的不同成分以不同速度流动，从而导致它们被分开。分离基于在流动相和固定相间的不同分配情况。
[0059]“尺寸排阻色谱”(SEC)指这样一种层析方法，它根据分子的大小而不是其它分离参数如分子量或极性来分离分子。它被应用于大分子如蛋白。在尺寸排阻色谱中，盐主要用作流动相。在某些实例中，流动相中也可以存在有机或离液剂。固定相经常是但不限于以下中的一种:交联的聚苯乙烯、衍生化二氧化娃(derivitized silica)、丙烯酸、轻基丙烯酸、丙烯酸、琼脂糖或聚轻乙基-天冬酰胺(polyhydroxyethyl-aspartamide)骨架。该树脂的骨架可以用任何数量的种类作衍生，衍生试剂的选择通常由以下需求确定，即，降低待分离的分析物和色谱柱之间不良的分子相互作用，而这种不良的分子相互作用用于基于混合物大小以外的其它分离参数的分离方法中。
[0060]本文所用的短语“质谱相容的挥发性SEC缓冲液(mass spectrometry compatiblevolatile SEC buffer) ”指与MS使用相兼容的SEC流动相。
[0061]本文所用的术语“抗体”指广义的抗体，如本发明所属领域中使用的那样，尤其包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(如，双特异性抗体)、和抗体片段。抗体可以是鼠源的、人源的、人源化的、嵌合的、或衍生自其它物种。
[0062]本文所用的术语“抗体”也指全长的免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点能够免疫特异性地结合感兴趣靶标或其一部分的抗原上，此类靶标包括但不限于，肿瘤细胞或产生与自身免疫性疾病相关自身免疫抗体的细胞。本文中揭示的免疫球蛋白可以是任何类型(如，IgG、IgE、IgM、IgD、和IgA)、类别(如，IgGl, IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。
[0063]本文所用的术语“抗体片段”包括但不限于全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段；Fc、半Fe (1/2FC)、二聚体(diabodies)、线性抗体、Fab表达文库产生的片段、抗-独特型(ant1-1d)抗体、⑶R(互补决定区)、ECD (胞外区)、和任何上述的表位-结合片段，该片段能够免疫特异性地结合到癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原，单链抗体分子、和抗体片段形成的多特异性抗体。
[0064]本文所用的“完整抗体”指包含VL和VH区的抗体，以及完全的轻链和重链恒定区并。“完整的抗体片段”包括通过至少一个非共价相互作用维持结合的全长抗体的一部分。
[0065]就抗体而言，术语“链间二硫键”是指在两条重链间的或重链和轻链间的二硫键。
[0066]就抗体而言，术语“链内二硫键”是指由同一多肽链上的2个半胱氨酸残基形成的~二硫键。
[0067]术语“链间硫醇”指抗体重链或轻链上的硫醇基团，该基团能够参与链间二硫键的形成。
[0068]本文所用的术语“单克隆抗体”或“mAb”指从实质性同源的抗体组群中获得的抗体，即，构成该组群的各抗体是相同的，除了少量存在的可能自然发生的突变。单克隆抗体是高特异性的，能够定向结合单一的抗原位点。而且，多克隆抗体制品包含定向于不同决定簇(表位)的不同抗体，每相比之下，单克隆抗体定向于抗原上的单一决定簇。
[0069]本文中的单克隆抗体尤其包括“嵌合”抗体，在“嵌合”抗体中重链和/或轻链的一部分与衍生于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或是同源的，而链的余下部分与衍生于另一特定物种或属于另一特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或是同源的，以及此类抗体的片段。
[0070]所述完整的抗体可能具有一个或更多个“效应子功能(effector functions)”，“效应子功能”指那些由抗体Fe区(天然序列的Fe区或氨基酸序列不同的Fe区)产生的生物学活性。抗体效应子功能的例子包括，但不限于，Clq结合，补体依赖的细胞毒性、Fe受体结合、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、吞噬作用、和细胞表面受体(如，B细胞受体，BCR)的下调。
[0071]所述抗体可以为抗体的融合蛋白，或其功能活性片段。例如，所述抗体可以通过共价键(如，肽键)，在N端或C端的任一端与并非该抗体的另一蛋白的氨基酸序列(或其部分，例如该蛋白的至少10、20或50个氨基酸的部分)融合。所述抗体或其片段可以在恒定区的N端共价地连接其它蛋白。
[0072]本文所用的术语“融合蛋白”也可以指结合域-1g相融合，其中结合域可以为，例如，配体、受体的胞外域、肽、非自然产生的肽等，前提是结合域不包括抗体的可变域。与本文描述的蛋白和抗体相似，融合蛋白的Ig部分必需包含至少一个可还原的二硫键。在一方面，Ig (结合)域为抗体的Fe区。Ig (结合)域融合蛋白包括，依那西谱(etanercept),其是sTNFRII与Fe区的融合蛋白(美国专利号5，605，690);阿法赛特(alefac印t)，其是抗原呈递细胞表达的LFA-3与Fe区的融合蛋白(美国专利号5，914，111);细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和Fe区的融合蛋白(J.Exp.Med.181:1869(1995));白介素15和Fe区的融合蛋白(J.1mmunol.160:5742(1998)) ;VII 因子和 Fe 区的融合蛋白(Proc.Natl.Acad.Sc1.LISA98:12180 (2001));白介素 10 和 Fe 区的融合蛋白(J.1mmunol.154:5590 (1995))；白介素2和Fe区的融合蛋白(J.1mmunol.146:915 (1991)) ；CD40和Fe区的融合蛋白(Surgeryl32:149 (2002)) ;Flt_3 (fms-样酪氨酸激酶)和抗体Fe区的融合蛋白(Acta.Haeraat0.95:218(1996)) ;0X40 和抗体 Fe 区的融合蛋白(J.Leu.Biol.72:522 (2002))；和与以下分子的融合蛋白:其它CD分子(如，CD2，CD30(TNFRSF8)，CD95 (Fas)，CD106 (VCAM-1)，CD137)、粘附分子(如，ALCAM(活化的白细胞粘附分子))、钙粘素、ICAM((胞间粘附分子)_1、ICAM-2、ICAM-3)细胞因子受体(如，白介素_4R、白介素-5R、白介素-6R、白介素-9R、白介素-10R、白介素-12R、白介素-13Ra 1、白介素-13Ra 2、白介素-15R、白介素-21Ra )、趋化因子、细胞死亡诱导信号分子(如，B7-H1、DR6(死亡受体6)、PD-1 (程序性死亡-1)、TRAIL Rl)、协同刺激分子(如，B7-1、B7-2、B7-H2、ICOS(可诱导协同刺激因子))、生长因子(如，ErbB2、ErbB3、ErbB4、HGFR)、分化诱导因子(如，B7-H3)、活化因子(如，NKG2D)、信号转导分子(如，gpl30)、BCMAJ TAC10
[0073]缩写词“MMAE” 指单甲基 E (monomethyl auristatin E)。
[0074]缩写词“MMAF”指朵缬氨酸-缬氨酸-朵拉异亮氨酸_朵拉脯氨酸_苯丙氨酸(doval ine-val ine-do Iai so I euine-do lapro ine-pheny lalanine),也指单甲基奥利司他汀F(monomethyl auristatin F)。
[0075]术语“标记物”意为能够共价连接于抗体的任何部分，其具有如下功能:(i)提供可检测的信号；(ii)与第二标记物相互作用以改变由第一或第二标记物提供的可检测信号，如FRET(荧光共振能量转移)增加与抗原或配体结合的亲和性或使与抗原或配体的相互作用更加稳定；(iv)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响移动性能，如，电泳移动性能，或细胞-渗透性；或(V)提供捕获部分，以调节配体亲和性、抗体/抗原结合或离子络合。
[0076]抗体可以与任何标记物部分偶联，该标记物部分能够通过半胱氨酸硫醇共价结合至抗体。对于诊断应用，通常可用可检测部分标记抗体。
[0077]“药物”或“药物部分”可以是任何细胞毒性的、细胞抑制的或免疫调节的(如，免疫抑制)药物。在许多实例中，所述药物通过接头(linker)偶联在抗体上。例如，描述接头的文献有美国专利 7, 754，681,7, 375078,7, 829，531,7, 659，241,7, 851，437,7, 829，531、7，659，241,7, 498，298,7, 994，135,7, 964，567 和 7，964，567，所有这些文献均出于所有目的全文引用在此。在一方面，该接头是缬氨酸-瓜氨酸("Val-Cit〃或〃vc〃)。在另一方面，该接头为马来酰亚胺己酰基(〃mc〃)。
[0078]I1.方法
[0079]以下将详细参考某些实施方式。虽然结合列举的实施方式描述本发明，但应理解不应将本发明限制于这些实施方式。相反地，本发明应涵盖所有的可替代的，变形的和等同的技术方案，这些技术方案包含在权利要求所限定的本发明的保护范围内。
[0080]本领域的技术人员会知晓与本文所述相似或等同的很多方法和材料，这些方法和材料能够用于实施本发明。本发明并不仅限于所述的方法和材料。
[0081]在一些实施方式中，本发明提供了测定蛋白药剂偶联化合物分子量的方法。在某些实施方式中，所述方法包括如下步骤:(a)在挥发性盐且不含非挥发性盐中提供非共价结合且未变性的蛋白药剂偶联化合物；(b)将蛋白药剂偶联化合物引入质谱仪；和(C)通过质谱直接确立所述蛋白药剂偶联化合物的分子量。[0082]在一些实施方式中，本发明提供测定非共价结合的蛋白药剂偶联化合物分子量的方法。在某些实施方式中，所述方法包括如下步骤:(a)在挥发性盐且不含非挥发性盐中提供未变性的蛋白药剂偶联化合物；(b)将蛋白药剂偶联化合物引入质谱仪；和(C)通过质谱直接确立所述蛋白药剂偶联化合物的分子量。
[0083]在本文所述的一些方法中，所述方法还包括在所述蛋白药剂偶联化合物的非变性条件下应用分离介质以实现将所述蛋白药剂偶联化合物与基质的分离，由此所述蛋白药剂偶联化合物实质上未变性。在其它实施方式中，本发明提供的方法包括以下步骤:在蛋白药剂偶联化合物的非变性条件下引入分离介质以实现所述蛋白药剂偶联化合物与基质的分离，由此所述蛋白药剂偶联化合物实质上未变性。
[0084]在本文所述方法的一些实施方式中，所述方法包括从分离介质上洗脱未变性的蛋白药剂偶联化合物。在某些实施方式中，所述非变性条件包括质谱相容的挥发性SEC缓冲液。在进一步的实施方式中，所述挥发性盐包括甲酸铵、乙酸铵或碳酸铵。在某些实施方式中，所述挥发性盐为甲酸铵。在某些其它实施方式中，所述挥发性盐为乙酸铵。在其它实施方式中，所述挥发性盐为碳酸铵。在某些其它实施方式中，所述挥发性盐为本文上述挥发性盐的混合物。
[0085]在一些实施方式中，本发明提供本文上述的方法，其中所述基质包括非挥发性的盐、表面活性剂或缓冲液。
[0086]在本文上述方法的进一步实施方式中，本发明提供的方法包括通过去卷积离子强度定量测定蛋白药剂偶联化合物的相对分布。在一些这类的实施方式中，本发明提供的方法包括定量测定蛋白药剂偶联化合物的相对分布。在一些这类的实施方式中，本发明提供的方法包括使得本文所述实验的离子强度去卷积以定量测定蛋白药剂偶联化合物的相对分布。
[0087]在本文上述方法的进一步的实施方式中，本发明提供的蛋白药剂偶联化合物包括抗体药物偶联物。
[0088]在本文上述方法的进一步的实施方式中，本发明提供的基质包括某种制剂。在某些实施方式中，所述基质为某种制剂。
[0089]在本文上述方法的进一步的实施方式中，本发明提供的分离介质包括尺寸排阻色谱(SEC)。在某些实施方式中，所述分离介质为尺寸排阻色谱(SEC)。在本文所述一些方法中，所述方法包括通过尺寸排阻色谱法分离本文上述蛋白药剂偶联物。
[0090]在本文上述方法的进一步的实施方式中，本发明提供的药剂包括药物、毒素、或标记物。在本发明的某些实施方式中，所述药剂为药物。在本发明的另一些实施方式中，所述药剂为毒素。在本发明的另一些实施方式中，所述药剂为标记物。在某些实施方式中，所述药剂为本文上述任何药剂的组合。
[0091]在本文上述方法的进一步的实施方式中，本发明提供的SEC包括二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚轻乙基-天冬酰胺(polyhydroxyethyl-aspartamide)柱。在某些实施方式中，SEC包括二氧化硅柱。在某些其它实施方式中，SEC包括聚苯乙烯-二乙烯基苯柱。在某些其它实施方式中，SEC包括聚羟乙基-天冬酰胺柱。
[0092]在本文上述方法的进一步的实施方式中，本发明提供的非变性条件包括50°C的温度。在某些实施方式中，非变性条件的温度不高于50°C。在一些实施方式中，非变性条件的温度为室温。室温包括，但不限于，20-24°C。
[0093]在本文上述方法的进一步的实施方式中，本发明提供的质谱法在ES1-MS上操作。在其它实施方式中，本发明提供的质谱法在连接有其它设备，例如色谱仪或喷雾喷嘴以便将待分析样品输送至MS的质谱仪上操作。
[0094]在本文上述方法的进一步的实施方式中，本发明提供的挥发性盐的浓度为50至400mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为50mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为400mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、或400mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为约50至约400mM。在本文中，“约”指在用词语“约”修饰的数值的10%范围内的某一数值。例如，约50mM包括45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 55mM。例如，约 400mM 包括 360、370、380、390、400、410、420、430、和440mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为约50至约300mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为约50至约200mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为约50至约100mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为约100至约400mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为约200至约400mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为约300至约400mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为约50至约lOOmM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为约50至约200mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为约50至约300mM。在一些实施方式中，挥发性盐的浓度为约50至约350mM。
[0095]在本文上述方法的进一步的实施方式中，洗脱的蛋白药剂偶联化合物立即弓I入质谱仪。
[0096]在本文上述方法的一些实施方式中，洗脱的蛋白药剂偶联化合物连续引入质谱仪。在某些实施方式中，所述分离介质是在非变性条件下运行的HIC色谱。在其它实施方式中，所述SEC是聚羟乙基-A柱。
[0097]在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述SEC柱尺寸为0.1至7.8mm内径且100至300mm长度。
[0098]在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述方法包括步骤，使用去糖基化试剂(deglycosylating reagent)处理所述蛋白药剂偶联化合物。在某些实施方式中，所述去糖基化试剂为PNG酶F。在其它实施方式中，去糖基化试剂包括外切糖苷酶(exoglycosidase)促处理、内切糖苷酶(endoglycosidase)处理或能在N-聚糖(N-glycan)的第I和第2N-乙酰葡糖胺残基(N-acetylglucosamine residue)之间切割的酶处理。
[0099]在本文所述的一些实施方式中，所述外切糖苷酶促处理包括唾液酸酶(sialidase)或β -半乳糖苷酶(处理)。
[0100]在本文上述方法的进一步的实施方式中，在N-聚糖的第I和第2Ν-乙酰葡糖胺残基之间作切割的酶促处理包括Endo-Fl、F2或F3 (处理)。
[0101]在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述挥发性盐的pH为5.5-7.0。在其它实施方式中，本文所述方法包括的步骤中所述挥发性盐的pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9或7.0。在本文上述方法的一些实施方式中，所述挥发性盐的pH为6.0。在本文上述方法的一些实施方式中，所述挥发性盐的pH为6.5。在本文上述方法的一些实施方式中，所述挥发性盐的pH为7.0。
[0102]在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述方法包括通过质谱对未变性的蛋白药剂偶联化合物进行定量。
[0103]在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述未变性的蛋白药剂偶联化合物包括重链或轻链抗体片段。在一些此类实施方式中，所述重链或轻链抗体片段还包括一个或多个药物。
[0104]在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述抗体药物偶联物的抗体是抗体片段。
[0105]在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述抗体片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、双特异抗体、线形抗体或单链抗体分子。在本文所述的一些实施方式中，所述抗体选自抗-CD30、抗4040、抗-0019、抗-CD33或抗-CD70抗体。在其它实施方式中，所述抗体药物偶联物的抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，所述抗体药物偶联物的抗体包括人源化的抗体。
[0106]在本文上述方法的进一步的实施方式中,所述药物为美登醇(maytansinoid)。在其它一些实施方式中，所述药物为奥利司他汀。在某些实施方式中，所述药物是MMAE。在一些实施方式中，所述药物是MMAF。
[0107]在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在7.0Ta以内。在其它实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在25Da以内。在某些实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在7.0、7.1、
7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、
9.1,9.2,9.3,9.4,9.5,9.6,9.7,9.8,9.9,10.0,10.1,10.2,10.3,10.4,10.5,10.6,10.7、
10.8,10.9、11.0、11.1、11.2,11.3,11.4,11.5,11.6,11.7,11.8,11.9,12.0,12.1,12.2、
12.3,12.4,12.5,12.6,12.7,12.8,12.9,13.0,13.1,13.2,13.3,13.4,13.5,13.6,13.7、
13.8,13.9,14.0,14.1,14.2,14.3,14.4,14.5,14.6,14.7,14.8,14.9,15.0,15.1,15.2、
15.3,15.4,15.5,15.6,15.7,15.8,15.9,16.0,16.1,16.2,16.3,16.4,16.5,16.6,16.7、
16.8,16.9,17.0,17.1,17.2,17.3,17.4,17.5,17.6,17.7,17.8,17.9,18.0,18.1,18.2、
18.3,18.4,18.5,18.6,18.7,18.8,18.9,19.0,19.1,19.2,19.3,19.4,19.5,19.6,19.7、
19.8,19.9,20.0,20.1,20.2,20.3,20.4,20.5,20.6,20.7,20.8,20.9,21.0,21.1,21.2、
21.3,21.4,21.5,21.6,21.7,21.8,21.9,22.0,22.1,22.2,22.3,22.4,22.5,22.6,22.7、
22.8、22.9、23.0、23.1、2、23.3、23.4、23.5、23.6、23.7、23.8、23.9、24.0、24.K24.2、24.3、
24.4,24.5,24.6,24.7,24.8,24.9,25.0,25.1,25.2,25.3,25.4,25.5,25.6,25.7,25.8、或
25.9Da 以内。
[0108]在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在8.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在9.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在10.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在11.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在12.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在13.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在14.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在15.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在16.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在17.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在18.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在19.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在
20.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在21.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在22.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在23.0Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在24Da内。在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在25Da内。
[0109]在本文上述方法的进一步的实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在理论值的IOOppm以内。在其他实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在理论值的 80、90、100、110、120、或 130ppm 以内。
[0110]本发明的上述方法用于分析蛋白药剂偶联物的天然完整分子量。本发明的上述方法也用于测定蛋白药剂偶联物的天然完整分子量。
[0111]本发明提出检测非共价结合的蛋白药剂偶联物的分子量的方法，所述方法在挥发性盐且不含非挥发性盐中提供未变性的蛋白药剂偶联化合物；将蛋白药剂偶联化合物引入质谱仪；和，通过质谱直接确立所述蛋白药剂偶联化合物的分子量。
[0112]本发明提供的方法中将蛋白药剂偶联物引入质谱仪。在进一步的此类实施方式中，直接检测完整蛋白药剂偶联物的分子量。在一个此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联物是未变性的且在甲酸铵中。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联物是未变性的且在乙酸铵中。在其它此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是未变性的且在碳酸铵中。在其它此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，该抗体药剂偶联化合物是未变性的且在碳酸铵中。在其它此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，该抗体药剂偶联化合物是未变性的且在甲酸铵中。在其它此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，该抗体药剂偶联化合物是未变性的且在乙酸铵中。
[0113]本发明提供的方法中蛋白药剂偶联化合物引入质谱仪。在进一步的此类实施方式中，直接测量完整的蛋白药剂偶联化合物的分子量。在其它此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物的片段，其未变性的且在碳酸铵中。在其它此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物的片段，其未变性的且在甲酸铵中。在其它此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物的片段，其未变性的且在乙酸铵中。
[0114]本发明提供的方法中蛋白药剂偶联化合物引入质谱仪。在进一步的此类实施方式中，直接测量完整的蛋白药剂偶联化合物的分子量。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是未变性的。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联物是在甲酸铵中且所述药剂是药物。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联物是在乙酸铵中且所述药剂是药物。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联物是在碳酸铵中且所述药剂是药物。在任何此类实施方式中，中所述药物包括MMAE或MMAF。
[0115]在相关实施方式中，文本描述的方法提供的蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂轭合化合物，该抗体药剂偶联化合物是未变性的。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵中且所述药剂是药物。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在甲酸铵中且所述药剂是药物。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在乙酸铵中且所述药剂是药物。在任何此类实施方式中，本发明提供的方法中所述药物包括，但不限于，MMAE或MMAF。在任何此类实施方式中，本发明提供的方法中所述药物包括MMAE。在任何此类实施方式中，本发明提供的方法中所述药物是MMAF。
[0116]本发明提供的方法中蛋白药剂偶联物引入质谱仪。在进一步的此类实施方式中，直接测量完整的蛋白药剂偶联物的分子量。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是未变性的。在其它此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物在甲酸铵中且所述药剂是毒素。在其它此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物在碳酸铵中且所述药剂是毒素。在其它此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物在乙酸铵中且所述药剂是毒素。在任何此类实施方式中，本发明提供的方法中所述药剂是毒素。在任何此类实施方式中，本发明提供的方法中所述盐浓度任选在50和400mM之间。在任何此类实施方式中，本发明提供的方法中所述药剂是药物。
[0117]本发明提供的方法中蛋白药剂偶联物引入质谱仪。在进一步的此类实施方式中，直接测量完整的蛋白药剂偶联物的分子量。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是未变性的抗体药剂偶联化合物。在任何此类实施方式中，本发明提供的方法中所述盐浓度在50和400mM之间。在一些此类实施方式中，所述药剂是药物。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、乙酸铵或甲酸铵中。
[0118]在本文上述任何实施方式中，上述方法包括步骤:将偶联化合物引入质谱仪；并直接测量完整抗体药剂偶联化合物的分子量。
[0119]本发明提供的方法中蛋白药剂偶联物引入质谱仪。在进一步的此类实施方式中，直接测量完整的蛋白药剂偶联物的分子量。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是未变性的抗体药剂偶联化合物。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、乙酸铵或甲酸铵中。在一些实施方式中，所述盐浓度在50和400mM之间。在一些实施方式中，所述盐浓度为200mM。在其它相关实施方式中，所述药剂是药物。在其它实施方式中，所述缓冲液的PH在5.0和7.0之间。在任何此类实施方式中，本发明提供的方法中所述药剂可以是药物。
[0120]在本文中描述的所述方法的另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，其是未变性的且在甲酸铵中；盐的浓度是200mM ;所述药剂是药物；且缓冲液的pH在5.0和7.0之间。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、或乙酸铵或甲
酸铵中。
[0121]在本发明的另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，其是未变性的且在乙酸铵中。在一些实施方式中，盐的浓度是200mM ;缓冲液pH在5.0和7.0之间；且所述药剂是药物。
[0122]在本文方法的另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，其是未变性的；盐的浓度是200mM ;所述药剂是药物；缓冲液pH是6.5。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、或乙酸铵或甲酸铵中。在一些实施方式中，所述药剂包括药物，其中所述药物是本文中描述的药物。
[0123]在本发明的一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是未变性的，在基质中的所述蛋白药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述蛋白药剂偶联化合物与基质相分离。在一些实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物实质上是未变性的，所述偶联物引入质谱仪，直接检测完整的蛋白药剂偶联化合物的分子量。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、或乙酸铵或甲酸铵中。
[0124]本发明提供的方法中一蛋白药剂偶联物引入质谱仪。在进一步的此类实施方式中，直接检测完整的蛋白药剂偶联化合物的分子量。在本文上述方法的另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是未变性，在基质中的所述蛋白药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述蛋白药剂偶联化合物与基质分离，由此上述蛋白药剂偶联化合物是实质上未变性的。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物在甲酸铵中。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物在碳酸铵中。在一些此类实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物在乙酸铵中。在相关实施方式中，在基质中的所述蛋白药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述蛋白药剂偶联化合物与基质分离。在相关实施方式中，所述分离介质是SEC。
[0125]在任何上述方法中，所述方法可以包括所述蛋白药剂偶联化合物是非变性的，在基质中的所述蛋白药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述蛋白药剂偶联化合物与基质分离，由此所述蛋白药剂偶联化合物是实质上未变性的，并且所述分离介质是在非变性条件下的HIC。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵中。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在乙酸铵中。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在甲酸按中。
[0126]在任何上述方法中，所述方法可以包括所述蛋白药剂偶联化合物是非变性的，在基质中的所述蛋白药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述蛋白药剂偶联化合物与基质分离，由此所述蛋白药剂偶联化合物是实质上未变性的，并且所述分离介质是在非变性条件下的HIC。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、乙酸铵或甲酸铵中。在本文中描述的任何方法中，所述分离介质可以包括SEC。
[0127]在上述方法的另一方面，上述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，是未变性的，在基质中的所述蛋白药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述蛋白药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，并且所述分离介质是SEC。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、甲酸铵或乙酸铵中。
[0128]在所述方法的一方面，所述蛋白偶联物引入质谱仪，直接检测完整的所述抗体药剂偶联化合物的分子量，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，并且所述分离介质是在非变性条件下的HIC。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、甲酸铵或乙酸按中。
[0129]在所述方法的一方面，所述蛋白偶联物引入质谱仪，直接检测完整的所述抗体药剂偶联化合物的分子量，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联物是实质上未变性的，并且所述分离介质是在非变性条件下的HIC。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、乙酸铵或甲酸铵中。在相关实施方式中，所述分离介质是SEC，所述质谱仪是ES1-MS。
[0130]在上述方法的另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，并且所述分离介质是SEC，所述偶联物引入质谱仪，所述质谱仪为ES1-MS，直接检测完整的所述抗体药剂偶联化合物的分子量。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、甲酸铵或乙酸按中。
[0131]在上述方法的另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，所述偶联物是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，并且所述分离介质是SEC。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、甲酸铵或乙酸铵中。
[0132]在上述方法的另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂轭合化合物，所述偶联物是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，并且所述分离介质是在非变性条件下的HIC，所述偶联物引入质谱仪，所述质谱仪为ES1-MS0在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、甲酸铵或乙酸铵中。
[0133]在本文中的任一方法中，所述方法可以包括直接检测完整的所述抗体药剂偶联化合物的分子量的步骤。在本文中的任一方法中，所述蛋白药剂偶联物可以存在于碳酸铵、甲酸铵或乙酸铵中。
[0134]在上述方法的另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，所述偶联物是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，并且所述分离介质是在非变性条件下的HIC。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、甲酸铵或乙酸铵中。在相关实施方式中，所述质谱仪为ES1-MS。在一些其它相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物持续引入质谱仪。
[0135]在本文所述任一方法中，其中所述蛋白药剂偶联物引入质谱仪，所述偶联物可以采用持续的方式引入质谱仪。在本文所述任一方法中，其中所述蛋白药剂偶联物引入质谱仪，所述偶联物可以持续引入。
[0136]在上述方法的另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC，所述质谱仪为ES1-MS。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、甲酸铵或乙酸铵中。
[0137]在一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，并且所述分离介质是在非变性条件下的HIC。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、甲酸铵或乙酸铵中。
[0138]在本文描述的任一方法中，所述质谱仪可以包括ES1-MS。
[0139]在上述方法的另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，所述偶联物是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，并且所述分离介质是在非变性条件下的HIC。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、甲酸铵或乙酸铵中。在相关实施方式中，所述质谱仪是ES1-MS。
[0140]本发明提供的方法中，所述分离介质是SEC，所述蛋白偶联物引入质谱仪，所述质谱仪是ES1-MS，直接检测完整的抗体药剂偶联化合物的分子量并定量测定所述抗体药剂偶联化合物的分子量。在另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，所述蛋白药剂偶联物是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、乙酸铵或甲酸铵中。在其它相关实施方式中，所述分离介质是在非变性条件下的HIC。
[0141]在一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，所述蛋白药剂偶联物是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC，所述SEC柱是二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羟乙基-天冬酰胺(柱)，所述蛋白药剂偶联物引入质谱仪，直接检测完整的抗体药剂偶联化合物的分子量。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、乙酸铵或甲酸铵中。
[0142]在上述方法的一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，所述蛋白药剂偶联物是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC。在相关实施方式中，所述SEC柱是二氧化硅(柱)。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、乙酸铵或甲酸铵中。在其它相关实施方式中，所述SEC包括聚苯乙烯-二乙烯基苯。
[0143]在本文中的任一方法中，所述抗体药剂偶联物引入质谱仪，直接检测完整的所述抗体药剂偶联化合物的分子量，所述方法可以进一步地包括，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，所述蛋白药剂偶联化合物是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC，所述SEC柱是聚羟乙基-天冬酰胺(柱)。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、甲酸铵或乙酸铵中。
[0144]在本文中的任一方法中，所述抗体药剂偶联物引入质谱仪，直接检测完整的所述抗体药剂偶联化合物的分子量，所述方法可以进一步地包括以下方面。在另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，其是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC，所述SEC柱是聚羟乙基-天冬酰胺(柱)。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、甲酸铵或乙酸铵中。
[0145]在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，所述蛋白药剂偶联物是任选去糖基化的，所述蛋白药剂偶联物是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC，所述SEC柱是二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羟乙基-天冬酰胺。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵、甲酸铵或乙酸铵中。
[0146]在所述方法的另一方面，所述抗体药剂偶联化合物引入质谱仪，直接检测完整的所述抗体药剂偶联化合物的分子量，所述方法可以包括以下方面。在另一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，所述蛋白药剂偶联物是去糖基化的，所述蛋白药剂偶联物是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC，所述SEC柱是二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羟乙基-天冬酰胺(柱)。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，其是未变性的。在其它相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在碳酸铵中，所述碳酸铵的浓度在50和400mM之间。在其它相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在乙酸铵中，所述乙酸铵的浓度在50和400mM之间。在其它相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在甲酸铵中，所述甲酸铵的浓度在50和400mM之间。
[0147]在本文中的任一方法中，所述方法提供的蛋白药剂偶联物在碳酸铵中，所述碳酸铵的浓度在50和400mM之间。在本文中的任一方法中，所述方法提供的蛋白药剂偶联物在乙酸铵中，所述乙酸铵的浓度在50和400mM之间。在本文中的任一方法中，所述方法提供的蛋白药剂偶联物在甲酸铵中，所述甲酸铵的浓度在50和400mM之间。
[0148]在本文所述方法的另一方面，所述抗体药剂偶联化合物引入质谱仪，直接检测完整的所述抗体药剂偶联化合物的分子量，所述方法可以包括以下方面。在一方面，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC。在相关实施方式中，所述SEC柱是二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羟乙基-天冬酰胺(柱)。在本文的任一方法中，所述方法提供的蛋白药剂偶联物在碳酸铵中，所述碳酸铵的浓度在50和400mM之间。在本文中的任一方法中，所述方法提供的蛋白药剂偶联物在乙酸铵中，所述乙酸铵的浓度在50和400mM之间。在本文中的任一方法中，所述方法提供的所述蛋白药剂偶联物在甲酸铵中，所述甲酸铵的浓度在50和400mM之间。
[0149]在相关实施方式中，本发明提供的方法中所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，所述蛋白药剂偶联物是未变性的，在基质中的所述抗体药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述抗体药剂偶联化合物与基质分离，由此所述抗体药剂偶联物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC，所述SEC柱是二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羟乙基-天冬酰胺(柱)。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在浓度在50和400mM之间的甲酸铵中，并且pH为6.5 ;所述蛋白药剂偶联物在浓度在50和400mM之间的碳酸铵中，并且pH为6.5 ;或，所述蛋白药剂偶联物在浓度在50和400mM之间的乙酸铵中，并且pH为6.5。在其它相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的甲酸铵中，并且pH为6.5 ;所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的碳酸铵中，并且pH为6.5 ;或，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的乙酸铵中，并且pH为6.5。
[0150]在本文中的任一方法中，本发明提供的方法可任选包括，所述蛋白药剂偶联物在浓度为50mM的甲酸铵中，并且pH为6.5 ;所述蛋白药剂偶联物在浓度为50mM的碳酸铵中，并且pH为6.5 ;或，所述蛋白药剂偶联物在浓度为50mM的乙酸铵中，并且pH为6.5。
[0151 ] 在本文中的任一方法中，本发明提供的方法可任选包括，所述蛋白药剂偶联物在浓度为150mM的甲酸铵中，并且pH为6.5;所述蛋白药剂偶联物在浓度为150mM的碳酸铵中，并且pH为6.5 ;或，所述蛋白药剂偶联物在浓度为150mM的乙酸铵中，并且pH为6.5。
[0152]在本文中的任一方法中，本发明提供的方法可任选包括，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的甲酸铵中，并且pH为6.5 ;所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的碳酸铵中，并且pH为6.5 ;或，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的乙酸铵中，并且pH为6.5。
[0153]在本文中的任一方法中，本发明提供的方法可任选包括，所述蛋白药剂偶联物在浓度为400mM的甲酸铵中，并且pH为6.5 ;所述蛋白药剂偶联物在浓度为400mM的碳酸铵中，并且pH为6.5 ;或，所述蛋白药剂偶联物在浓度为400mM的乙酸铵中，并且pH为6.5。
[0154]在本文方法的另一方面，所述抗体药剂偶联化合物引入质谱仪，直接检测完整的所述抗体药剂偶联化合物的分子量，并且所述质谱仪是ES1-MS，所述方法可以包括以下方面。在一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，且是未变性的。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联化合物在浓度为250mM的甲酸铵中，并且pH为6.5;所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的碳酸铵中，并且pH为6.5 ;或，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的乙酸铵中，并且pH为6.5。
[0155]在本文方法的另一方面，所述抗体药剂偶联化合物引入质谱仪，直接检测完整的所述抗体药剂偶联化合物的分子量，并且所述质谱仪是ES1-MS，所述方法可以包括以下方面。在一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，所述蛋白药剂偶联物是未变性的，在基质中的所述蛋白药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述蛋白药剂偶联化合物与基质分离，由此上述蛋白药剂偶联化合物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC，并且所述SEC柱是聚羟乙基-天冬酰胺(柱)。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的甲酸铵中，并且pH为6.5 ;所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的碳酸铵中，并且pH为6.5 ;或，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的乙酸铵中，并且pH为 6.5。
[0156]在本文方法的另一方面，所述抗体药剂偶联化合物引入质谱仪，直接检测完整的所述抗体药剂偶联化合物的分子量，并且所述质谱仪是ES1-MS，所述方法可以包括以下方面。在一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，且是未变性的，在基质中的所述蛋白药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述蛋白药剂偶联化合物与基质分离，由此上述蛋白药剂偶联化合物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC，并且所述SEC柱是聚羟乙基-天冬酰胺(柱)。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的甲酸铵中，并且pH为6.5 ;所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的碳酸铵中，并且pH为6.5 ;或，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的乙酸铵中，并且pH为6.5。[0157]在本文的一些方法中，所述抗体药剂偶联化合物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC，并且所述SEC柱是聚羟乙基-天冬酰胺(柱)。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的甲酸铵中，并且pH为6.5 ;所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的碳酸铵中，并且pH为6.5 ;或，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的乙酸铵中，并且pH为 6.5。
[0158]在本文方法的另一方面，所述抗体药剂偶联化合物引入质谱仪，直接检测完整的所述抗体药剂偶联化合物的分子量，并且所述质谱仪是ES1-MS，所述方法可以包括以下方面。在本文方法的一方面，所述蛋白药剂偶联化合物是抗体药剂偶联化合物，所述药剂为药物，在基质中的所述蛋白药剂偶联化合物非变性的条件下应用分离介质将所述蛋白药剂偶联化合物与基质分离，由此上述蛋白药剂偶联化合物是实质上未变性的，所述分离介质是SEC，并且所述SEC柱是聚羟乙基-天冬酰胺(柱)。在相关实施方式中，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的甲酸铵中，并且pH为6.5 ;所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的碳酸铵中，并且pH为6.5 ;或，所述蛋白药剂偶联物在浓度为250mM的乙酸铵中，并且pH为
6.5o
[0159]在一些实施方式中，本文所述方法包括快速测定非共价结合的蛋白药剂偶联化合物的完整分子量。在一实施方式中，由重链(HC)和轻链(LC)组成的抗体药剂偶联化合物表现为复合体，该复合体通过还原抗体以及随后将药物偶联在链间的半胱氨酸残基获得。本文中描述的方法可以包括采用天然脱盐条件分析ADC的步骤，其中ADC的完整二价结构得以维持。本发明的进一步地实施方式包括随后采用去溶剂化的和离子化的条件测定脱盐ADC的分子量的步骤。在一些此类实施方式中，所述去溶剂化和离子化条件是标准的去溶剂化和离子化条件。
[0160]本文中描述的方法可以包括通过基于半-天然尺寸-尺寸排阻色谱(SEC)的脱盐和分子量检测方法分析半胱氨酸-连接的ADC。所述方法还可包括测量链间半胱氨酸-连接的ADC的完整分子量,并通过去卷积离子强度(deconvoluted ion intensity)定量测定药物-连接种类的相对分布。本文描述的方法可以适用于ADC的高通量分子量检测。
[0161]本文描述的方法可以包括ADC去糖基化的任选步骤。所述去糖基化步骤可以包括利用PNGase F或其它本领域技术人员已知的其它化合物。本文描述的方法可以包括消除聚糖异质性(glycan heterogeneity)的步骤。在某些实施方式中,所述方法为各药物负载的种类提供改进的或提高的或更大的信号强度。在进一步的实施方式中，所述方法包括定量测定的步骤。因为MS信号强度增强，本发明提供的方法中去糖基化能够得到更好的分子量准确性。
[0162]除了任选的去糖基化，本文描述的方法可以包括介质分离步骤。所述介质分离步骤包括不同的色谱技术，例如SEC或HIC。在该步骤中，ADC从缓冲体系交换至挥发性盐，该挥发性盐能够使碱性氨基酸带正电以供分子量检测。在一些此类实施方式中，从ADC中去除非-挥发性盐、表面活性剂和缓冲液。在另一些实施方式中，在非变性条件下采用SEC进行所述色谱步骤，同时允许ADC的缓冲液交换成挥发性盐。
[0163]本文上述方法可以包括质谱分析步骤。在某些方面，MS步骤可以紧跟介质分离步骤。在其它方面，在介质分离步骤和MS步骤之间可以有间插步骤。然而在其它方面，介质分离步骤后MS步骤可以连续进行。在MS步骤中，测量ADC的分子量。此外，本文上述方法可以提供通过MS离子丰度检测定量性药物负载。在一方面，所述MS是利用TOF-MS、Q-TQF、FTICR、Orbitrap或高分辨率离子阱MS进行。在该步骤中，使用高分辨率质谱仪测量分子量且将多荷电(m/z)的数据去卷积成零电荷质谱。依据去卷积谱的离子强度定量测定负载各药物的种类，该去卷积谱是未处理原始数据的强度的积。通常将源于蛋白的ES1-MS原始数据可视化处理成一系列荷电离子，其中给定的一种分子种类可以具有数个与其相关的离子，且每个相关的离子在正电荷数目上有差异。原始数据的去卷积是指测定每个离子所携带的电荷数，并且将所有相关离子转化为零电荷质谱的过程，所述零电荷质谱表示所分析种类的分子量。在原始数据中与去卷积质谱中特定种类相关的各离子具有与其相关的强度或丰度测量值，因此，与特定种类相关的所有离子的丰度构成了该种类在所分析样品中的近似丰度。定量测定诸种类时，将样品中特定种类的丰度与样品中所有相关种类的丰度总和进行比较，从而给出该特定种类的相对摩尔丰度的测量值。在某些实例中，以这种方式作定量测定假设所有种类具有大致相等的离子化效率。
[0164]III药物代谢动力学
[0165]为确立安全/毒性范围和适宜的给药方案，需要在哺乳动物中监测治疗剂循环水平以供药代动力学(P)检测，包括半衰期、清除率、曲线下面积(AUG)和分布体积(Welling, P.(1997)《药代动力学方法、数学与应用》(PharmacokineticsProcesses, Mathematics, and Applications),第二版，美国化学协会(American ChemicalSociety),华盛顿，哥伦比亚特区)。生物利用度是指所给予的药物从所给予的剂型到达常规循环的程度，通常以给予剂量的百分比表示。化合物的半衰期是指通过排泄或生物转化(代谢)除去该化合物峰值血浆浓度的50%所需要的时间。疗效指数表示化合物在所需治疗活性和不需要的毒副作用之间的选择度。本发明方法得到的药代动力学检测值阐明了抗体和抗体-药物偶联物(ADC)的吸收、分布、代谢和清除(ADME)。
[0166]IV.药物负载
[0167]可以通过本发明方法表征从偶联反应制备ADC中每个抗体的药物平均数量。本发明的方法能够测定ADC中每个抗体结合的药物数量(负载)以及药物部分在片段，例如重链和轻链上的分布。
[0168]V.抗体药物偶联物的施用
[0169]可以通过与待治疗病症相适合的任何途径将ADC与生物源接触或施用于生物源。通常经胃肠外方式，例如输注、皮下、肌肉、静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外方式将ADC施用于动物。
[0170]V1.适用于本文所述方法的药物
[0171]用于偶联到抗体上的示范性药物包括细胞毒性药物或药剂，特别是那些用于癌症治疗的。此类药物通常包括DNA破坏性的药剂，抗-代谢物，天然产物和它们的类似物。细胞毒药剂的示范性类别包括酶抑制剂，例如二氢叶酸还原酶抑制剂、胸苷酸(thymidylate)合成酶抑制剂、DNA嵌入剂、DNA裂开剂、拓扑异构酶抑制剂、蒽环类药物、长春花药物、丝裂霉素、博来霉素、细胞毒核苷类似物、蝶啶类药物、二炔类(diynenes)、足叶草毒素、海兔毒素、美登木素生物碱、变异诱导剂和紫杉酚。示范性药物部分包括但不限于:奥利司他汀(例如MMAF和MMAE)、甲氨喋呤(methotrexate)、甲喋呤(methopterin)、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、美法仑、环氧长春碱、异长春碱(leurosideine)、放线菌素、道诺霉素、阿霉素、丝裂霉素C、丝裂霉素A、美登木素生物碱、洋红霉素、氨喋呤、他利霉素(tallysomycin)、足叶草毒素和足叶草毒素衍生物,例如依托泊苷或依托泊苷磷酸盐、长春花碱、长春新碱、长春地辛、紫杉酚、泰素帝、维甲酸、酪酸、喜树碱、卡里奇霉素(calicheamicin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、烯二炔类(enediynes)和它们的衍生物及类似物。
[0172]ADC的药物部分也能够包括海兔毒素和它们的肽类似物和衍生物，奥利司他汀(美国专利号5，635，483、5，780，588)。海兔毒素和奥利司他汀已经表现出能够干扰微管动力性质、GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents andChemother.45 (12): 3580-3584)，并具有抗癌(美国专利号5，663，149)和抗真菌活性(Pettit 等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。在一些实施方式中，所述药物是奥利司他汀，一种抗-微管蛋白药剂。所述海兔毒素或奥利司他汀药物部分可以通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端连接于抗体(W002/088172)。美国专利5，767，237和美国专利6，124，431公开了奥利司他汀E的变体。
[0173]MMAE和MMAF免疫偶联物，它们的合成和结构公布在美国专利号7，851，437、7，829，531,7, 659，241,7, 498，298,7, 994，135,7, 964，567，它们中每一个均出于所有目的全文引用在此目的。奥利司他汀包括，但不限于奥利司他汀E和其衍生物。AFP、AEB、AEVB、MMAF和MMAE是能用于本文中的奥利司他汀的实例。
[0174]VI1.药物制剂
[0175]通常用药学上可接受的胃肠外载体将治疗用ADC的药物制剂制成适合于胃肠外施用，例如，大丸剂、静脉内、瘤内注射，并制成单位剂量可注射形式。具有所需纯度的抗体-药物偶联物(ADC)任选与药学上可接受的填充剂、运载体、赋形剂或稳定剂(《雷明顿药学科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences) (1980)第 16 版，0sol，A.编)混合成冻干的制剂或水性溶液。
[0176]可接受的填充剂、运载体、赋形剂和稳定剂在所用的剂量和浓度上对生物受体是无毒的，包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如，十Λ烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁基或苯基乙醇、烷基苯甲酸酯类例如甲基或乙基苯甲酸酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于10个残基)的多肽；蛋白，如血清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸盐、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类包括瓜尔豆胶和糊精；糖类如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；螯合剂如EDTA ;成盐反离子如钠；金属复合物(如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂例如TWEEN?、PLUR0NICS?或聚乙二醇(PEG)。
[0177]VII1.去糖基化
[0178]采用任选的去糖基化步骤来降低N-聚糖的末端唾液酸和半乳糖残基的不同程度所致的异质性。通过外切糖苷酶酶处理(如，分别用唾液酸酶和β_半乳糖苷酶)或通过内切糖苷酶处理，使用将被占用的Asn残基上的N-聚糖移除的酶(如，PNGase-F)或在N-聚糖的第I和第2乙酰氨基葡萄糖残基之间切割的酶(如，Endo-Fl、F2或F3)能够降低N-聚糖末端异质性。
[0179]在一方面，降低N-聚糖所致异质性的最简单和最有效的方法是使用PNGase-F进行消化。该去糖基化步骤是任选的，因为在聚糖完整保留的情况下所述测量仍然是可行的。只是会不必要地将MS谱搞复杂，且需要高端质谱仪来进行可重复的测量。
[0180]IX.色谱分析
[0181]在测量分子量前先移除蛋白样品中的非挥发性盐以及离子和非-离子表面活性齐U。在一个实施方式中，将ADC引入质谱仪,该ADC不含非挥发性盐。在另一实施方式中，将ADC弓丨入质谱仪，该ADC实质上不含非挥发性盐。在还有另一实施方式中，将ADC弓丨入质谱仪，该ADC不含除了，例如表面活性剂之外的非挥发性盐。半胱氨酸连接的ADC脱盐技术必须保持天然蛋白结构的完整同时去除非离子性盐和表面活性剂。能够在MS相容缓冲体系中进行脱盐和保护天然结构的色谱柱类型包括尺寸-排阻(SE)和HIC柱。可以预期的是，也能使用SEC-类似型号的没有标明是SEC柱的那些色谱柱，例如HIC色谱。该柱将运行在，例如，等度乙酸铵缓冲液中。该柱的作用方式是，阻止蛋白进入色谱介质的小孔同时允许非挥发性盐进入该色谱介质的小孔，因此导致在流动条件下蛋白被先洗脱而盐被后洗脱。相对于蛋白移动，非挥发性盐的移动得到延迟。
[0182]SEC色谱柱使用的色谱介质通常由颗粒形式的二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羟乙基-天冬酰胺固定相构成，颗粒尺寸在1.7至20微米，孔径在60至2000埃，在一方面，孔径为 60、80、100、120、150、200、300、500、1000、2000 或 4000A。在一方面，任何 SEC色谱柱填充材料均可使用，柱的尺寸可以是0.1至7.8mm内径和50至600_长度。所述柱尺寸可以是 0.1,0.15、0.3、0.5、1、2.0、2.1、3.0、4.0、4.6 或 7.8mm。所述柱长度可以是 50、100、150、200、250 或 300mm。
[0183]此类色谱柱能够基于彼此在尺寸方面的巨大差异而从蛋白中移除非挥发性盐和表面活性剂。具体地，小分子盐和表面活性剂与色谱颗粒中的孔相互作用(如，进入内部)，导致这些粒子延迟通过色谱柱，而具有足够尺寸的蛋白不与颗粒的孔结构相互作用从而在非挥发性盐和表面活性剂之前就很好地洗脱下来。脱盐系统的另一方面是要选择MS相容性SEC缓冲盐和pH以及盐浓度。缓冲盐应当是挥发性的，以防止在MS入口的结晶和腐蚀。常规使用的挥发性MS缓冲盐是甲酸铵/甲酸和乙酸铵/乙酸(如，酸/碱对)。例如，可以使用PH7的乙酸铵冲洗色谱柱，并用乙酸下调pH至6.5。在一方面，所述盐是乙酸铵。
[0184]盐浓度在50和400mM之间。在另一方面，盐浓度是200mM。在另一方面，盐浓度是250mM。缓冲液的pH在5.0和7.0之间。在一方面，pH为从5.5至7.0。在另一方面，pH是6.5。然而在另一方面，pH是7.0。本领域技术人员应当理解，能够产生有用分子量数据的PH是可以预期的(例如，可以在pH7.5或8下获得有用的分子量数据)。
[0185]如果在不含有机溶剂和酸性离子配对试剂的情况下进行分析，可以防止ADC的变性以及随后的断裂。在一方面，pH6.5下的200mM乙酸铵与聚羟乙基-A(polyhydroxyethyl-A)色谱柱联用最去糖基IgGlmAb进行脱盐。
[0186]X.质谱
[0187]在MS步骤中，将样品加载到MS设备中。所述样品包含蛋白药剂偶联化合物。使用酸或碱将所述样品离子化，以分别用于正或负离子化MS。样品以液滴的微小喷雾形式进入源。使用热干燥气体将包含液滴的样品去溶剂化(蒸发)。液滴的尺寸减小到某一点，在该点由于静电排斥作用，带正电的蛋白分子引起液滴爆炸成更小的液滴。在一瞬间该过程重复很多次，直到具有真正气相蛋白离子，该气相蛋白离子随后进入质谱仪来测定分子量。该过程通常称为电喷射-离子化(ESI)。测量出分子离子的质荷比(m/z)，并且通过供应商的特定软件进一步处理(去卷积)该原始数据，得到感兴趣的目标物的零电荷分子量。使用MS研究药物代谢动力学特征，鉴别未知的蛋白或小分子以及鉴别发生在蛋白上的翻译后修饰和降解。典型地 ESI 仪器包括 water Xevo Q-TOF、Agilent6510Q_T0F。
[0188]质谱数据用来确定蛋白的一级结构。当实验测得的蛋白分子量和从预期氨基酸序列确定的理论分子量的匹配在误差范围内时，就能确定一级结构。使用大多数市售可得的飞行时间质谱仪可以测定重组mAb的完整分子量。使用变性的溶剂系统的典型脱盐过程经常产生在理论值的50ppm(大约7.0Ta)以内的实验性mAb分子量数据。在其它方面，该分子量数据在大约25Da以内。在乙酸铵缓冲体系中使用SEC-MS进行mAbs和ADC的天然脱盐，会导致离子化效率较低，因为在中性缓冲液PH下较少的碱性残基会带正电荷。较低强度的原始数据能导致实验测得的分子量和理论分子量间有较大偏离。然而，采用本文所述SEC-MS对脱盐ADC获得的分子量数据常产生在理论值的50ppm(约7.5Da)以内的分子量数据，并且经常小于lOOppm。分子量的高精度表明ADC是完全脱盐的，因为可能与蛋白结合的所有普通盐加合物都会将分子量增加至少18Da(铵离子的分子量)。测量具有非共价结合亚基的ADC分子量的常规方法包括通过离线技术进行脱盐，例如离心过滤、单用凝胶渗透盒和透析，然后对脱盐ADC作纳米喷雾MS。使用该方法，样品的不完全去加合是非常普遍的，能够导致测得的分子量数据偏离理论值最多5000ppm。
[0189]在将挥发性盐(例如乙酸铵)中的蛋白，例如ADC从SEC色谱柱上洗脱后，将蛋白引入质谱仪，该质谱仪使用市售可得的分析型ESI源，能够将1-1000微升/分钟流动的缓冲液中的蛋白去溶剂化和离子化。流速可以由操作者决定，并且可以取决于柱直径。例如，0.1mm柱可以在I微升/分钟的流速下操作，7.8mm柱可以在1000微升/分钟的流速下操作。该流速能更快地测定分子量。毛细管电压、气体流速(去溶剂化和保护)以及锥电压(cone voltages)应当设在足以使ADC去溶剂化(如，蒸发溶剂)的数值，但是应该足够温和以最大程度降低ADC源内断裂(in-source fragmentation)成连接药物的重和轻链。当ADC的天然-折叠结构能维持，原始数据显示的电荷分布(charge envelope)在4800和7000m/z之间。如果没有维持天然结构，则表现为电荷分布在2000和4000m/z之间的显著的ADC群体。使用市售可得的去卷积软件(如，安捷伦的MassHunter maximum entropydeconvolution)将ADC的MS测量值原始数据转化为零电荷质谱，通过将特定连接药物种类的离子丰度除以总离子丰度(所有连接药物种类的丰度之和)来定量测定各连接药物种类的丰度。通常利用飞行时间和四极杆飞行时间(分别为TOF和QT0F)仪器进行完整蛋白的分子量测量，但是也可以利用傅立叶转换离子回旋共振(FT-1CR)和轨道阱质谱仪。在一方面，可以利用基质辅助激光解析电离(MALDI)质谱仪和高分辨率离子阱质谱仪进行该项工作。
[0190]与本发明相反，以往将色谱步骤收集的各组分分别引入MS。通过分析构成每个组分的化合物和偶联物的分子量，计算出所有收集峰的总分子量来决定整体分子量。如前所述，本发明提供了通过MS直接分析完整ADC的分子量的方法。
[0191]X1.电喷雾电离质谱(ESI)
[0192]较高分子量化合物(如，抗体)的分子量可根据利用大多数质谱仪不难确定的质荷比(m/z)测得(典型的m/z范围最高2000，最高3000，最高8000)。具体地说，电喷雾电离质谱ES1-MS适用于荷电的、极性的或碱性化合物，并适用于分析多荷电化合物，具有非常优异的检测限。因此，可以使用ESI检测和表征大的生物分子，例如分子量(MW)在150，OOO或更高的抗体-药物偶联物。
[0193]XI1.系统
[0194]在一些实施方式中，本发明提供设置成执行本文所述方法的系统。在一些此类实施方式中，所述系统包括质谱仪。
[0195]在某些实施方式中，所述质谱仪设置成执行本文所述的方法，包括检测非共价结合的蛋白药剂偶联物分子量的器件。在某些实施方式中，所述器件包括质谱仪。在一些实施方式中，所述系统进一步地包括用于在挥发性盐中以及不含非挥发性盐的情况下提供未变性蛋白药剂偶联化合物的器件。在进一步的实施方式中，所述系统包括用于将蛋白药剂偶联化合物引入质谱仪的器件。在更进一步的实施方式中，所述系统包括用于通过质谱仪直接确立所述蛋白药剂偶联化合物分子量的器件。
[0196]XII1.实施例
[0197]以下实施例用于解释本发明而不造成对本发明的限制。
[0198]材料
[0199]抗体-药物偶联物-在CHO细胞中表达重组单克隆抗体并通过Shukia, A等((2007) J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci848, 28-39)所述的标准程序纯化。根据 Sun, M.等((2005) Bioconjug Cheml6，1282-1290)所述的已有方法，将 mAb 的半胱氨酸残基偶联于Val-Cit单甲基奥利司他汀E(vcMMAE)或马来酰亚胺己酰基单甲基奥利司他汀F (mcMMAF)。每IOOg抗体或ADC添加I μ I PNGase F (新英格兰实验室,伊普斯维奇，马萨诸塞州(New England Biolabs, Ipswich, MA)),并在37°C下孵育至少4小时来使抗体去糖基化。
[0200]实施例1
[0201]SEC-MS色谱-用聚羟乙基-A色谱柱(PolyLC，哥伦比亚市，马里兰州)分离mAb和ADC，该色谱柱维度为2.1 X 200mm并含有川(I \微孔的5微米颗粒。该色谱柱在用于非变性分子量分析的200mM乙酸铵、pH6.5-7.0或者在用于变性分子量分析(对照)的30%乙腈、0.2%甲酸中进行平衡。运行中的流速维持在0.lmL/min,mAb或ADC在3.5和4.5min之间洗脱出。mAb或ADC洗脱后，维持流速和缓冲液组成，总循环时间是IOmin每次运行。
[0202]质谱分析-在1000-8000m/z范围内的正离子ESI模式下，通过安捷伦6510QT0F(安捷伦公司，圣克拉拉，加利福尼亚州)获得mAb和ADC的质谱数据。干燥气体的温度是350°C，干燥气体和喷洒气体的流速和压力分别是12L/hr和35psi。毛细管、碎裂器(fragmentor)和八极 RF (octupole RF)电压分别是 5000、450 和 350。使用 MassHimter工作站软件版本B.03.01中的最高熵去卷积算法将原始数据转化为零电荷质谱。
[0203]疏水相互作用色谱(HIC)-根据McDonagh, C.F.等((2006)Protein Eng DesSel 19，299-307)描述的方法，通过HIC分离vcMMAE和mcMMAF ADC。通过280nm的UV积分定量测定负载药物种类。在图6中，HIC数据用作从本文所述方法的完整分子量数据测得的ADC MR0-8相关百分比的比较。
[0204]除图6外，表I显示了各负载药物种类的MR的离子丰度面积和HIC UV面积值。
【权利要求】
1.一种检测蛋白药剂偶联化合物分子量的方法，包括: (a)在挥发性盐中且不含非挥发性盐中提供非共价结合的且未变性的蛋白药剂偶联化合物； (b)将所述蛋白药剂偶联化合物引入质谱仪；和 (C)通过质谱直接确立所述蛋白药剂偶联化合物的分子量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括，在所述蛋白药剂偶联化合物的非变性条件下应用分离介质以实现将所述蛋白药剂偶联化合物与基质分离，由此所述蛋白药剂偶联化合物是实质上未变性的。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括，从所述分离介质上洗脱所述未变性的蛋白药剂偶联化合物。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非变性条件包括质谱相容的挥发性SEC缓冲液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述挥发性盐包括甲酸铵、乙酸铵或碳酸铵。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基质包括非挥发性的盐、表面活性剂或缓冲液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括，通过去卷积离子强度定量测定蛋白药剂偶联化合物的相对分布。
8.如权利要求1所述的方`法，其特征在于，所述蛋白药剂偶联化合物包括抗体药物偶联物。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基质包括制剂。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离介质包括尺寸排阻色谱(SEC)。
11.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述药剂包括药物、毒素、或标记物。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述SEC包括二氧化硅、聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚羟乙基-天冬酰胺柱。
13.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非变性条件包括不高于50°C的温度。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱在ES1-MS上操作。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述挥发性盐的浓度为50至400mM。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述挥发性盐的浓度为50mM至1M。
17.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述洗脱的蛋白药剂偶联化合物立即引入质谱仪。
18.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述洗脱的蛋白药剂偶联化合物连续引入质谱仪。
19.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离介质包括在非变性条件下运行的HIC 柱。
20.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述SEC包括聚羟乙基-A柱。
21.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述SEC柱尺寸为0.1至7.8mm内径且100至300mm长度。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括使用去糖基化试剂处理所述蛋白药剂偶联化合物的步骤。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述去糖基化试剂包括PNG酶F。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述去糖基化试剂包括外切糖苷酶的酶处理、内切糖苷酶处理或能够在N-聚糖的第I和第2N-乙酰葡糖胺残基之间切割的酶处理。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述外切糖苷酶的酶处理包括唾液酸酶或β -半乳糖苷酶。
26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述在N-聚糖的第I和第2Ν-乙酰葡糖胺残基之间切割的酶处理包括Endo-Fl、F2或F3处理。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述挥发性盐的pH为5.5-7.0。
28.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括，通过质谱对未变性的蛋白药剂偶联化合物进行定量测定。
29.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未变性的蛋白药剂偶联化合物包括重链或轻链抗体片段。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述重链或轻链抗体片段还包含一个或多个药物。
31.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗体药物偶联物的抗体包括抗体片段。`
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述抗体片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、FV片段、双特异抗体、线形抗体或单链抗体分子。
33.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗体选自抗-CD30、抗-CD40、抗-⑶19、抗-⑶33或抗-⑶70抗体。
34.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗体药物偶联物的抗体是人源化的抗体。
35.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述药物为美登醇。
36.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述药物为奥利司他汀。
37.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述药物是MMAE。
38.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述药物是MMAF。
39.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在7.0Ta以内。
40.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在25Da以内。
41.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白药剂偶联化合物的分子量经测量在理论值的IOOppm以内。
42.一种系统，所述系统被设置为执行权利要求1所述的方法。
43.如权利要求42所述的系统，其特征在于，所述系统包括质谱仪。
【文档编号】G01N24/00GK103858003SQ201280047453
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年9月27日 优先权日:2011年9月29日
【发明者】J·F·瓦利耶尔-道格拉斯, O·萨拉斯 申请人:西雅图基因公司