专利名称：一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，尤其涉及一种 HPLC法同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮含量的方法。
背景技术：
止咳宝片中富含多种中药材，具有解表散寒、宣肺除痰，益肺气养肺阴的功效，起到理肺祛痰和止咳平喘的功能。“止咳宝片秘方”入选岭南中药文化遗产保护名录。
止咳宝片现行标准收载于《中国药典》2010年版一部，其鉴别标准中收载了 I个理化鉴别和3个薄层鉴别，而止咳宝片处方中有14味药。通过研究发现多种药味的薄层色谱之间均存在阴性干扰，尚无有效分离方法进行鉴别其有效成分，导致现有的质量控制方法未能有效实现产品质量的控制。且现有的检测方法存在实验步骤繁琐，实验条件不好控制等缺点，且方法的重复性和稳定性也不够理想。
为了更加有效控制本品质量，通过对处方中药味成份研究，应用现代高效液相色谱技术，本发明提供一种采用梯度洗脱、变化检测波长的含量测定方法，其能定性定量的同时测定止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量，方法简便而快捷，有效提高止咳宝片的质量控制水平，相对现有检测方法具有技术领先水平。发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，该方法应用现代高效液相色谱技术，采用梯度洗脱(两个梯度或三个梯度)，同时变化检测波长，可定性定量的同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量，方法简便而快捷，而且专属性强，可有效提高止咳宝片的质量控制水平。
为了实现本发明的目的，所提供的技术方案如下
—种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，所述四种有效成分分别是五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮，所述方法包括如下步骤
( I)确定色谱条件采用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，采用由乙腈为流动相A、水为流动相B组成的洗脱液进行梯度洗脱，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于 5000，梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下
梯度1---0 20min，流动相 A :B=40 65% :60 35%，A+B=100%,流速为1. Oml/min,检测波长为245 255nm ;梯度I为等度洗脱；(五味子醇甲在0_20min内出峰)
梯度2----20 35min，流动相 A B=〔(40 65%) — (90 100%)〕〔(60 35%) — (10 0%)〕，A+B=100%，流速为1. Oml/min，检测波长为 22(T235nm ;梯度 2 为流动相A、B的体积百分比逐渐变化的梯度洗脱， 其中流动相A、B分别由40 65%和60 35%逐渐变化到90 100%和10 0% ;(2(T35min内白花前胡甲素、白花前胡乙素先后出峰)
梯度3——流动相 A :B=9(Tl00% :10 0%，Α+Β=100%，流速为1. (Tl. 3ml/min，检测波长为195 205nm ;梯度3为等度洗脱；待紫菀酮出峰后，继续洗脱至无杂质峰即可。
(2)制备对照品溶液；优选的对照品溶液制备方法是精密称取五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮对照品，用甲醇溶解并配制成对照品溶液，使每Iml对照品溶液中含有3-7 μ g五味子醇甲、60-75 μ g白花前胡甲素、14-20 μ g白花前胡乙素、 5_9μ g紫菀酮。采用这一浓度范围的对照品溶液，有助于准确测定供试品中四种有效成分的含量。
(3)制备供试品溶液；优选的供试品溶液制备方法是取止咳宝片供试品，除去包衣后研成细粉，用甲醇溶解并配制成O. 04或O. 08g/ml的供试品溶液。优选为0.08g/ml。
(4)测定分别精密量取适量(例如10 μ I)对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，并按外标法以峰面积计算，即得检测结果。
一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，所述四种有效成分分别是五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮，所述方法包括如下步骤
(I)确定色谱条件采用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，采用由乙腈为流动相Α、水为流动相B组成的洗脱液进行梯度洗脱，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于 5000，梯度洗脱的程序及流动相Α、Β的体积百分比如下
梯度1-----0 35min，流动相 A :B=〔(40 50%) — (90 100%)〕〔(60 50%) — (10 0%)〕，A+B=100%，流速为1. (Tl. 2ml/min，检测波长为 220 265nm ;梯度 I 为流动相A、B的体积百分比逐渐变化的梯度洗脱 ，其中流动相A、B分别由40 50%和6(Γ50% 逐渐变化到9(Γ100%和1(Γθ% ;梯度I的洗脱时长在(Γ35分钟内，并不代表一定要洗脱35 分钟，也可根据洗脱情况和实际的实验情况提前进入梯度2，例如在25分钟或30分钟时。 ((T35min内，五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素先后依次出峰)
梯度2-----流动相 A :Β=9(Γ100% :1(Γ0%，Α+Β=100%，流速为1. (Tl. 3ml/min，检测波长为195 205nm ;梯度2为等度洗脱；待紫菀酮出峰后，继续洗脱至无杂质峰即可。
(2)制备对照品溶液；优选的对照品溶液制备方法是精密称取五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮对照品，用甲醇溶解并配制成对照品溶液，使每Iml对照品溶液中含有3-7 μ g五味子醇甲、60-75 μ g白花前胡甲素、14-20 μ g白花前胡乙素、 5-9 Ug紫菀酮；采用这一浓度范围的对照品溶液，有助于准确测定供试品中四种有效成分的含量。
(3)制备供试品溶液；优选的供试品溶液制备方法是取止咳宝片供试品，除去包衣后研成细粉，用甲醇溶解并配制成O. 04或O. 08g/ml的供试品溶液。优选为0.08g/ml。
(4)测定分别精密量取适量(例如10 μ I)对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，并按外标法以峰面积计算，即得检测结果。
进一步的，上文所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，制备供试品溶液时，采用温浸超声法，将供试品经研磨后的细粉置于具塞锥形瓶中，加入甲醇，称定总重量，于40°C温浸I小时后，超声lOmin，然后放至室温，并再称定总重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀并过滤，取续滤液作为供试品溶液。也可以采用热回流法制备供试品溶液， 但采用温浸超声法制备供试品溶液，具有操作更为简便的特点，同时可提高效率。
上文所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，所述供试品止咳宝片中四种有效成分的含量限度为所述供试品每Ig含前胡以白花前胡甲素(C21H22O7)和白花前胡乙素(C24H26O7)计分别不得少于700μ g/g和180 μ g/g、含五味子以五味子醇甲 (C24H32O7)计不得少于38 μ g/g和含紫毙以紫毙酮(C3tlH5tlO)计不得少于60 μ g/g。
进一步的，上文所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，制备对照品溶液时，每Iml对照品溶液中含有5μ g五味子醇甲、70 μ g白花前胡甲素、18 μ g白花前胡乙素、7yg紫菀酮。
进一步的，上文所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，当连续进样检测时，追加洗脱时长为5分钟的洗脱梯度，该追加的洗脱梯度将流动相A、B的体积百分比变换为梯度I洗脱时的流动相A、B体积百分比的起始比例，并将检测波长变换到梯度I 的起始检测波长。这样不仅可简化连续进样检测的操作，而且还可最大程度的避免相邻两个样品检测之间的干扰，确保检测的准确性。
优选的，所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，步骤(I)中梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下
梯度I——0 35min，流动相 A B=40% — 96% :60% — 4%, A+B=100%,流速为1. Oml/ min，检测波长为250nm，当洗脱15分钟时波长变换为228nm，梯度I为流动相A、B的体积百分比逐渐变化的梯度洗脱，其中流动相A、B分别由40%和60%逐渐变化到96%和4% ;在梯度I洗脱过程中，在(Γ15分钟内五味子醇甲出峰，在15 35分钟内按白花前胡甲素和白花前胡乙素先后顺序出峰；
梯度2——流动相 A B=96% 4%, A+B=100%,流速为1. 2ml/min,检测波长为 200nm。梯度2为等度洗脱。待紫菀酮出峰后，继续洗脱至无杂质峰即可。
采用这种优选的洗脱程序，可以缩短四种有效成分的出峰时间，提高检测效率；而且，在梯度I中先以250nm为检测波长，之后再变换为228nm的检测波长，从而针对检测浓度较低的五味子醇甲可有最大吸收峰，同时又可有效检测其他几种有效成分，有效提高了检测的灵敏度。
进一步优选的，所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，所述步骤 (O中梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下
梯度I——0 30min，流动相 A B=50% — 100% :50% — 0%,A+B=100%,流速为1. Oml/ min，检测波长为228nm，梯度I为流动相A、B的体积百分比逐渐变化的梯度洗脱，其中流动相A、B分别由50%和50%逐渐变化到100%和0% ;在0 30分钟按五味子醇甲、白花前胡甲素和白花前胡乙素先后顺序出峰；
梯度2——流动相A =B=100% :0%，A+B=100%,流速为1. 2ml/min,检测波长为 200nm;梯度2为等度洗脱。
采用这种进一步优选的洗脱程序，针对五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮均有最佳的检测波长，而且更进一步的缩短四种有效成分的出峰时间，快速而简便，进一步提闻检测效率。
本发明所提供的技术方案具有如下有益效果
本发明提供一种能同时检测止咳宝片中四种有效成分(五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮)含量的方法。该方法应用现代高效液相色谱 技术，在洗脱过程中，将流动相A、B浓度配比逐渐变化的梯度洗脱和流动相A、B配比恒定不变的等度洗脱相结合，形成一个特定的梯度洗脱程序，进行两个梯度或三个梯度洗脱，同时在梯度洗脱时变 化检测波长。采用这种检测方法不仅可精确分离止咳宝片中四种有效成分的检测峰，分离 度好，专属性强，还可同时定量检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素 和紫菀酮的含量。该检测方法简便而快捷，可有效提高止咳宝片的质量控制水平。本发明 提供的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法具有灵敏度高、重现性好、稳定性佳 的特点，可准确的定性定量检测止咳宝片的四种有效成分。采用本发明的方法可更有效的 控制产品的质量，确保药物的疗效。采用两个梯度的检测方法，不仅可以达到与三个梯度的检测方法同样的检测效 果，而且可简化操作，使检测过程更为简便，效率更高。
图I是实施例I测定所得的对照品HPLC图谱(3个梯度)图2是实施例I测定所得的供试品HPLC图谱(3个梯度)图3 :是实施例4测定所得的供试品HPLC图谱(2个梯度)图4 :是实施例5测定所得的对照品HPLC图谱(2个梯度)图5 :是实施例5测定所得的供试品HPLC图谱(2个梯度)图6 :是实施例6测定所得的对照品HPLC图谱(2个梯度)图7 :是实施例6测定所得的供试品HPLC图谱(2个梯度)图8 :是实施例7测定所得的对照品HPLC图谱(2个梯度)图9 :是实施例7测定所得的供试品HPLC图谱(2个梯度)
具体实施例方式本发明提供一种同时测定中成药止咳宝片中4种有效成分(五味子醇甲、白花前 胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮)含量的方法。该方法应用现代高效液相色谱技术，采用梯 度(两个或三个梯度)洗脱，同时变化检测波长，可定性定量的同时检测止咳宝片中五味子 醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量，方法简便而快捷，有效提高止咳宝片 的质量控制水平。该方法用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流 动相B ;进行三个或两个梯度洗脱，进行梯度更替时变换波长的检测法，理论板数按五味子 醇甲峰计算不低于5000。下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明。文中所述的等度洗脱是指在某个时间段内的洗脱过程中，流动相的浓度配比保持 不变；梯度洗脱是指流动相的浓度配比在洗脱过程中按一定程序不断变化。实施例I同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量 方法，详述如下(3个洗脱梯度)I.实验样品及对照品止咳宝片(广东台城制药股份有限公司生产，批号20121101);白花前胡甲素对 照品(批号111711-200602，中国药品生物制品检定所提供)；白花前胡乙素对照品(批号 111904-201102，中国药品生物制品检定所提供)；紫菀酮对照品(批号111581-200604，中 国药品生物制品检定所提供)；五味子醇甲对照品(批号110857-201010，中国药品生物制品检定所提供)。
2.仪器
高效液相色谱仪Agilentl260Infinity, G1315D。色谱柱资生堂C18 (4.6父250_，5 4!11，柱号AKAD08072)，十万分之一级电子天平(型号9ZSM_202A)，超声仪 (广州市科普超声电子技术有限公司，型号KP-Q600)。
3.检测方法
3.1色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表I中的规定进行梯度洗脱(其中，梯度I为等度洗脱，梯度 2为在洗脱过程中流动相A、B体积百分比由45% 55%等速连续变化到96% 4%的梯度洗脱， 梯度3为等度洗脱)，采用变波长检测；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，各检测目标峰与其各自相邻峰的分离度应符合要求。
检测需符合的要求《中国药典》2010年版一部附录VI D0
表I
权利要求
1.一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，所述四种有效成分分别是五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮，其特征在于，所述方法包括如下步骤(1)确定色谱条件采用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，采用由乙腈为流动相A、水为流动相B组成的洗脱液进行梯度洗脱，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下梯度 I0 20min，流动相 A :B=40 65% :60 35%，A+B=100%，流速为1. Oml/min，检测波长为245 255nm ；梯度 2——20 35min，流动相 A :B=〔(40 65%) — (90 100%)〕〔 (60 35%) — (10 0%)〕，A+B=100%，流速为1. Oml/min，检测波长为 220 235nm ；梯度 3流动相 A :Β=9(Γ100% :1(Γ0%，Α+Β=100%，流速为1. (Tl. 3ml/min，检测波长为195 205nm ；(2)制备对照品溶液；(3)制备供试品溶液；(4)测定分别精密量取适量对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，并按外标法以峰面积计算，即得检测结果。
2.一种同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，所述四种有效成分分别是五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮，其特征在于，所述方法包括如下步骤(1)确定色谱条件采用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂，采用由乙腈为流动相A、水为流动相B组成的洗脱液进行梯度洗脱，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000，梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下梯度1-----0 35min，流动相 A :B=〔(40 50%) — (90 100%)〕〔 (60 50%) — (10 0%)〕，A+B=100%，流速为1. (Tl. 2ml/min，检测波长为 220 265nm ；梯度 2-----流动相 A :Β=9(Γ100% :1(Γ0%，Α+Β=100%，流速为1. (Tl. 3ml/min，检测波长为 195 205nm ；(2)制备对照品溶液；(3)制备供试品溶液；(4)测定分别精密量取适量对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，并按外标法以峰面积计算，即得检测结果。
3.根据权利要求1或2所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，其特征在于，制备供试品溶液时，将供试品细粉置于具塞锥形瓶中，加入甲醇，称定总重量，于40°C温浸I小时后，超声lOmin，然后放至室温，并再称定总重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀并过滤,取续滤液作为供试品溶液。
4.根据权利要求1或2所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，其特征在于，制备对照品溶液时，精密称取五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮对照品，用甲醇溶解并配制成对照品溶液，使每Iml对照品溶液中含有3-7 μ g五味子醇甲、60-75 μ g白花前胡甲素、14-20 μ g白花前胡乙素、5-9 μ g紫菀酮。
5.根据权利要求4所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，其特征在于，制备对照品溶液时，每Iml对照品溶液中含有5μ g五味子醇甲、70μ g白花前胡甲素、.18 μ g白花前胡乙素、7 μ g紫菀酮。
6.根据权利要求1或2所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，其特征在于，当连续进样检测时，追加洗脱时长为5分钟的洗脱梯度，该追加的洗脱梯度将流动相A、B的体积百分比变换为梯度I洗脱时的流动相A、B体积百分比的起始比例，并将检测波长变换到梯度I的起始检测波长。
7.根据权利要求2所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，其特征在于，步骤(I)中梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下梯度 I——0 35min，流动相 A B=40% — 96% :60% — 4%, A+B=100%，流速为1. Oml/min,检测波长为250nm，当洗脱15分钟时波长变换为228nm，梯度2——流动相A B=96% 4%, A+B=100%，流速为1. 2ml/min，检测波长为200nm。
8.根据权利要求2所述的同时检测止咳宝片中四种有效成分含量的方法，其特征在于，所述步骤(I)中梯度洗脱的程序及流动相A、B的体积百分比如下梯度 I——0 30min，流动相 A B=50% — 100% :50% — 0%，A+B=100%，流速为1. Oml/min,检测波长为228nm，梯度2——流动相A =B=100% :0%，A+B=100%，流速为1. 2ml/min，检测波长为200nm。
全文摘要
本发明提供一种同时测定中成药止咳宝片中4种有效成分(五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮)含量的方法。该方法应用现代高效液相色谱技术，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于5000。在洗脱过程中，将流动相A、B浓度配比逐渐变化的梯度洗脱和流动相A、B配比恒定不变的等度洗脱相结合，形成一个特定的梯度洗脱程序，进行两个梯度或三个梯度洗脱，同时在梯度洗脱时变化检测波长。本发明提供的方法可定性定量的同时检测止咳宝片中五味子醇甲、白花前胡甲素、白花前胡乙素和紫菀酮的含量，方法简便而快捷，而且专属性强，可有效提高止咳宝片的质量控制水平。
文档编号G01N30/34GK103048409SQ20131000690
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月8日 优先权日2013年1月8日
发明者许丹青 申请人:广东台城制药股份有限公司