一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法，包括三七，黄芪和降香的鉴别方法及丹参素的含量测定方法，包括：三七和黄芪供试品溶液的制备、三七和黄芪对照品溶液的制备、三七和黄芪的薄层鉴别，降香供试品溶液的制备、降香对照药材溶液的制备、降香薄层鉴别以及采用超高效液相色谱法测定丹参素的含量。试验证明，本方法具有很好的线性、重复性、重现性和稳定性，回收率高，有助于更加全面控制芪参益气滴丸的质量。
【专利说明】一种苗参益气滴丸有效成分的检测方法
【技术领域】:
[0001]本发明属于中药检测领域，具体涉及一种芪参益气滴丸的鉴别方法与含量测定方法。
【背景技术】:
[0002]芪参益气滴丸(QSYQ)是由黄芪、丹参、三七和降香油组成的中药复方制剂。于2003年经中国国家食品药品监督管理局批准用于治疗冠心病、心绞痛，具有剂量小、服用方便、溶出速度快、可直接经粘膜吸收入血、生物利用度高、疗效高及无胃肠刺激、无明显毒副作用的特点。
[0003]临床前药效学试验表明，芪参益气滴丸可以使心肌梗塞犬的梗塞范围缩小，缺血性心电图改善，血清酶CK和LDH活性降低，血浆ET和TXB2水平降低，6-Keto-PGFl α活性和6-Keto-PGFl α /ΤΧΒ2比值升高；可使心肌缺血再灌注损伤大鼠的梗塞范围缩小，SOD活性增加。芪参益气滴丸可使大鼠体外血栓长度缩短，重量减轻，并可使血浆及全血粘度降低；可使高脂血症家兔的TC、TG、LDL-C、VLDL-C水平降低，HDL-C水平升高，使主动脉TC含量和肝脏TG及MDA含量降低；并可使花生四烯酸和胶原诱导的血小板聚集率降低；犬血流动力学试验表明，芪参益气滴丸可通过扩张冠脉血管使冠脉流量增加，使心肌耗氧指数降低；在不增加左室做功情况下，使心搏出量和心输出量增加等。
[0004]在生产过程中，需要对芪参益气滴丸的制备过程的中间体和成品进行检测，以随时控制产品的质量，现有检测方法，有些准确性差，灵敏度不高，有些使用价格昂贵的试剂和仪器，有些操作步骤繁琐，为了更好地控制芪参益气滴丸的质量，本发明研究出一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法。
【发明内容】
:
[0005]本发明公开了一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法，包括三七，黄芪和降香的鉴别方法及丹参素的含量测定方法。
[0006]根据本发明，三七和黄芪的鉴别方法，包括如下步骤:
[0007]①三七和黄芪供试品溶液的制备:取芪参益气滴丸，加氨试液超声使溶解，过大孔树脂柱，依次使用水、乙醚、三氯甲烷、甲醇洗脱，收集洗脱液即为三七和黄芪供试品溶液；
[0008]②三七和黄芪对照品溶液的制备:取三七皂苷Rl对照品、人参皂苷Rgl对照品、黄芪甲苷对照品，加甲醇制成混合溶液，即为三七和黄芪对照品溶液；
[0009]③三七和黄芪的薄层鉴别:取所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，展开，取出，晾干，显色，比较所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液的斑点。
[0010]根据本发明，降香的鉴别方法，包括如下步骤:
[0011]①降香供试品溶液的制备:取芪参益气滴丸，加氨试液使溶解，大孔树脂处理，收集洗脱液即为降香供试品溶液；[0012]②降香对照药材溶液的制备:取降香对照药材，加乙醚，水浴回流，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇使溶解，即为降香对照药材溶液；
[0013]③降香薄层鉴别:取所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，展开，取出，晾干，显色，比较所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液的斑点。
[0014]根据本发明，丹参素的含量测定方法，包括如下步骤:
[0015]①供试品溶液的制备:取芪参益气滴丸，置量瓶中，加水，超声处理，加水定容，摇匀，离心或过滤，即得供试品溶液；
[0016]②对照品溶液的制备:取丹参素钠对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成溶液，即得对照品溶液。
[0017]③丹参素的含量测定:采用超高效液相色谱法测定丹参素的含量。
[0018]根据本发明实施方式之一，所述三七和黄芪供试品溶液的制备为:取芪参益气滴丸0.5-5g，加氨试液3-25ml超声使溶解，通过大孔树脂柱；用水18_30ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚8-20ml洗脱，洗脱液备用；继续用三氯甲烷3-15ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇3-7ml缓慢洗脱，弃去最初洗脱液l_2ml，收集后2_6ml甲醇洗脱液即为三七和黄芪供试品溶液。
[0019]根据本发明另一实施方式，所述三七和黄芪的鉴别方法的步骤③为:取所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(60:30: 10) IO0C以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5-16%硫酸乙醇溶液，在100-140°C加热至斑点显色清晰。
[0020]考察了三七阴性样品溶液和黄芪阴性样品溶液对实验的影响，结果表明，在该实验条件下，阴性样品溶液均无干扰。
[0021]考察了不同薄层板及低温高湿环境对分离情况的影响，结果表明上述不同条件对鉴别试验无影响。
[0022]根据本发明再一实施方式，所述降香供试品溶液的制备为:取芪参益气滴丸
0.5-5g，加氨试液3-25ml使溶解，通过大孔树脂柱；用水18_30ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚8-20ml洗脱，洗脱液挥干，加乙醚l_3ml使溶解，即为降香供试品溶液。
[0023]根据本发明再一实施方式，所述降香对照药材溶液的制备为:取降香对照药材l_5g，加乙醚10-50ml，水浴回流15-60分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇0.5_8ml使溶解，即为降香对照药材溶液。
[0024]根据本发明再一实施方式，所述降香的鉴别方法的步骤③为:取所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以正己烷-丙酮-乙酸乙酯(8:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%_5%香草醛硫酸溶液或1%香草醛硫酸-乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。
[0025]考察了三降香阴性样品溶液对实验的影响，结果表明，在该实验条件下，阴性样品溶液均无干扰。
[0026]考察了不同薄层板及低温高湿环境对分离情况的影响，结果表明上述不同条件对鉴别试验无影响。
[0027]根据本发明再一实施方式，所述丹参素的含量测定方法的步骤①供试品溶液的制备为:取芪参益气滴丸0.3-1.5g，置10-25ml量瓶中，加水，超声处理，加水定容，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液。
[0028]根据本发明再一实施方式，所述丹参素的含量测定方法的步骤③丹参素的含量测定所用超高效液相色谱法的色谱条件为:反相色谱柱；流动相A相为磷酸-乙腈溶液，流动相B相为磷酸溶液，梯度洗脱；柱温:20-40°C ;检测波长:270-320nm。
[0029]优选的，所述流动相A相为含0.02%磷酸的80%乙腈，所述流动相B相为0.02%的磷酸水溶液，所述梯度洗脱的梯度为:
[0030]0-1.6 分钟，9% — 22%A 相；
[0031 ] 1.6-1.8 分钟，22% — 26%A 相；
[0032]1.8-8.0 分钟，26% — 39%A 相；
[0033]8.0-8.4 分钟，39% — 9%A 相；
[0034]8.4-10.0 分钟，9%A 相。
[0035]优选的，所述柱温为30°C。
[0036]优选的，所述检测波长为280nm。
[0037]根据本发明，丹参素的含量测定方法中，所述色谱条件的丹参素理论板数不低于8000。
[0038]试验证明，本方法具有很好的线性、重复性、重现性和稳定性，回收率高，有助于更加全面控制苗参益气滴丸的质量。
[0039]本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下:
[0040]I芪参益气滴丸鉴别
[0041]1.1三七和黄芪的薄层鉴别
[0042]1.1.1三七和黄芪供试品溶液的制备
[0043]取本品1.0g，加氨试液5ml超声使溶解，通过DlOl型大孔吸附树脂柱(内径1cm，柱长5cm，流速0.5^0.7ml/分);用水20ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚IOml洗脱，洗脱液备用；继续用三氯甲烷5ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇4ml缓慢洗脱，弃去最初洗脱液Iml，收集后3ml甲醇洗脱液作为供试品溶液。
[0044]1.1.2三七和黄芪对照品溶液的制备
[0045]三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含三七皂苷R1 lmg、黄芪甲苷Img及人参皂苷Rg1 0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。
[0046]1.1.3三七阴性样品溶液的制备
[0047]按芪参益气滴丸的处方配比，取除三七的其他各味，按工艺制得的样品，再按三七和黄芪供试品溶液制备方法制得三七阴性样品溶液。
[0048]1.1.4黄芪阴性样品溶液的制备
[0049]按芪参益气滴丸的处方配比，取除黄芪的其他各味，按工艺制得的样品，再按三七和黄芪供试品溶液制备方法制得黄芪阴性样品溶液。
[0050]1.1.5薄层条件及结果
[0051]照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述四种溶液各10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(60:30:10) 10°C以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液,在105°C加热至斑点显色清晰。
[0052]三七和黄芪供试品色谱中，在与三七和黄芪对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0053]阴性样品溶液无干扰。结果见图1。
[0054]在上述试验基础上，对本方法进行了耐用性试验。试验包括不同薄层板及低温高湿环境对分离情况的影响，结果见图2~4，考察结果表明上述不同条件对试验均无影响。
[0055]1.2降香的薄层鉴别
[0056]1.2.1降香供试品溶液的制备
[0057]取本品1.0g，加氨试液5ml使溶解，通过DlOl型大孔吸附树脂柱(内径1cm，柱长5cm，流速0.5^0.7ml/分)；用水20ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚IOml洗脱，洗脱液挥干，加乙醚Iml使溶解,作为降香供试品溶液。
[0058]1.2.2降香对照药材溶液的制备
[0059]取降香对照药材2g，加乙醚20ml，水浴回流30分钟，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇Iml使溶解，作为降香对照药材溶液。
[0060]1.2.3阴性样品溶 液的制备
[0061]按芪参益气滴丸的处方配比，取除降香的其他各味，按工艺制得的样品，再按降香供试品溶液制备方法制得降香阴性样品溶液。
[0062]1.2.4.薄层条件及结果
[0063]照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-丙酮-乙酸乙酯(8:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。
[0064]降香供试品色谱中，在与降香对照药材色谱相应的位置上，至少显两个相同颜色的斑点。
[0065]阴性样品溶液无干扰。结果见图5。
[0066]在上述试验基础上，对本方法进行了耐用性试验。试验包括不同薄层板及低温高湿环境对分离情况的影响，结果见图6~8，考察结果表明上述不同条件对本试验无影响。
[0067]2.丹参素含量测定
[0068]2.1仪器与试药
[0069]仪器:Waters Acquity UPLC高效液相色谱仪；
[0070]色谱柱:WatersAcquity UPLCtmHSS T3 (lOOmmX 2.lmm, 1.8 μ m) ；ThermoHypersil GOLD aQ (IOOmmX 2.lmm, 1.9 μ m) ；Agilent SB- C18 RRHD (IOOmmX 2.1 mm,1.8 μ m)
[0071]试剂:甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)，磷酸(分析纯，天津市赢达稀贵化学试剂厂)，乙腈(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)，水为去离子水。
[0072]对照品:丹参素钠(中国药品生物制品检定所购置，批号:110855-200809，供含量测定用)；样品:(天津天士力制药股份有限公司，批号:120206、120207、120208)
[0073]2.2色谱条件
[0074]色谱柱:WatersAcquity UPLCtmHSS T3 (柱长为 100mm,内径为 2.lmm, 1.8 μ m)；
[0075]流动相:以含0.02%磷酸的80%乙腈溶液为流动相A，以0.02%磷酸溶液为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱；流速:0.4ml/min ;柱温:40°C ;检测波长:280nm。理论板数按丹参素峰计算为19364。
【权利要求】
1.一种芪参益气滴丸有效成分的检测方法，包括三七，黄芪和降香的鉴别方法及丹参素的含量测定方法，其特征在于: (1)三七和黄芪的鉴别方法，包括如下步骤: ①三七和黄芪供试品溶液的制备:取芪参益气滴丸，加氨试液超声使溶解，过大孔树脂柱，依次使用水、乙醚、三氯甲烷、甲醇洗脱，收集洗脱液即为三七和黄芪供试品溶液； ②三七和黄芪对照品溶液的制备:取三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、黄芪甲苷对照品，加甲醇制成混合溶液，即为三七和黄芪对照品溶液； ③三七和黄芪的薄层鉴别:取所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，展开，取出，晾干，显色，比较所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液的斑点； (2)降香的鉴别方法，包括如下步骤: ①降香供试品溶液的制备:取芪参益气滴丸，加氨试液使溶解，大孔树脂处理，收集洗脱液即为降香供试品溶液； ②降香对照药材溶液的制备:取降香对照药材，加乙醚，水浴回流，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇使溶解，即为降香对照药材溶液； ③降香薄层鉴别:取所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，展开，取出，晾干，显色，比较所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液的斑点； (3)丹参素的含量测定方法，包括如下步骤: ①供试品溶液的制备:取芪参益气滴丸，置量瓶中，加水，超声处理，加水定容，摇匀，离心或过滤，即得供试品溶液； ②对照品溶液的制备:取丹参素钠对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成溶液，即得对照品溶液。 ③丹参素的含量测定:采用超高效液相色谱法测定丹参素的含量。
2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述三七和黄芪供试品溶液的制备为:取芪参益气滴丸0.5-5g，加氨试液3-25ml超声使溶解，通过大孔树脂柱；用水18_30ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚8-20ml洗脱，洗脱液备用；继续用三氯甲烷3-15ml洗脱，弃去洗脱液，再用甲醇3-7ml缓慢洗脱，弃去最初洗脱液l_2ml，收集后2_6ml甲醇洗脱液即为三七和黄芪供试品溶液。
3.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述三七和黄芪的鉴别方法的步骤③为:取所述三七和黄芪供试品溶液以及所述三七和黄芪对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(60:30:10) 10°C以下放置分层的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5-16%硫酸乙醇溶液，在100-140°C加热至斑点显色清晰。
4.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述降香供试品溶液的制备为:取芪参益气滴丸0.5-5g，加氨试液3-25ml使溶解，通过大孔树脂柱；用水18_30ml洗脱，弃去洗脱液，再用乙醚8-20ml洗脱，洗脱液挥干，加乙醚l_3ml使溶解，即为降香供试品溶液。
5.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述降香对照药材溶液的制备为:取降香对照药材l-5g,加乙醚10-50ml,水浴回流15-60分钟,滤过,滤液挥干,残洛加无水乙醇.0.5-8ml使溶解，即为降香对照药材溶液。
6.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述降香的鉴别方法的步骤③为:取所述降香供试品溶液以及所述降香对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以正己烷-丙酮-乙酸乙酯(8:1:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%_5%香草醛硫酸溶液或1%香草醛-硫酸-乙醇，加热至斑点显色清晰。
7.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述丹参素的含量测定方法的步骤①供试品溶液的制备为:取芪参益气滴丸0.3-1.5g，置10-25ml量瓶中，加水，超声处理，加水定容，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液。
8.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述丹参素的含量测定方法的步骤③丹参素的含量测定所用超高效液相色谱法的色谱条件为:反相色谱柱；流动相A相为磷酸-乙腈溶液，流动相B相为磷酸溶液，梯度洗脱；柱温:20-40°C ;检测波长:270-320nm。
9.根据权利要求8的检测方法，其特征在于，所述流动相A相为含0.02%磷酸的80%乙腈，所述流动相B相为0.02%的磷酸水溶液，所述梯度洗脱的梯度为: 0-1.6 分钟，9% — 22%A 相；
1.6-1.8 分钟，22% — 26%A 相；
1.8-8.0 分钟，26% — 39%A 相；
8.0-8.4 分钟，39% — 9%A 相；
8.4-10.0 分钟，9%A 相。
10.根据权利要求8或9的检测方法，其特征在于，所述色谱条件的丹参素理论板数不低于8000。
【文档编号】G01N30/90GK103926366SQ201310014920
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月15日 优先权日:2013年1月15日
【发明者】葛丹丹, 边宁, 侯春莲, 孙玉侠, 曹凤兰 申请人:天士力制药集团股份有限公司