专利名称：一种微量四环素类抗生素的荧光检测方法
技术领域：
本发明属于环境监测技术领域，涉及一种微量四环素类抗生素的荧光检测方法。
背景技术：
四环素类抗生素是目前临床使用最广泛的广谱类抗生素之一，常见的如四环素、土霉素、强力霉素等。此外，由于四环素类抗生素具有促进动物生长和提高饲料利用率的作用，因此大约70%的抗生素被用作饲料添加剂用于畜牧和水产养殖业。通过各种代谢途径和迁移转化途径，四环类抗生素已经在土壤、地表水、地下水等环境介质检出，而且该类物质具有慢性毒性和积蓄毒性等危害，已经对人体和生态系统带来巨大威胁，如导致耐药性细菌或病毒的产生。因此，发展简便、灵敏和高选择性的检测技术或方法对于监控环境中四环素类抗生素污染等具有重要意义。传统的四环素类检测方法如色谱法、光谱法、微生物法、以及免疫法等由于其固有的缺陷，难以应对当前环境检测需求。基于分子印迹技术的传感器对四环素类抗生素的检测具有高灵敏性和高选择性的特点，但分子印迹膜制备过程复杂，检测步骤繁琐，影响到该方法的稳定性。近年来，核酸适配子作为核酸探针的一种，能与对应的配体靶物质进行高亲和特异性结合，被广泛应用于分析检测中。人们也已经成功筛选和解析出对某些四环素类抗生素，如对四环素和土霉素具有特异性识别能力的核酸适配子(Bioorganic &Medicinal Chemistry, 2008, 16(15)， 7245-7253 ;Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008，16(3)，1254-1261)。已有文献针对核酸适配子与土霉素的特异性识别作用报道了几种检测方法，如电化学检测法(Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2010, 33(1)，31-37),纳米金比色法(Biosensors and Bioelectronics, 2010, 26(4)，1644-1649)，但这些方法操作复杂，背景噪声高，稳定性和灵敏性差。滚环扩增技术是一种新兴的常温核酸扩增技术，以环状DNA为模板，在某些特殊DNA聚合酶催化下，将一个短的DNA引物扩增成含有成百上千的重复片段的长链DNA，与传感器中的信号联系后实现明显的信号放大作用，滚环扩增技术用于小分子检测还未见报道。此外，石墨烯具有优异的荧光淬灭能力，有效降低荧光传感器的噪声值。据此建立一种利用滚环扩增原理的信号放大作用以及基于石墨烯构建的分子信标的高选择性用于分析测定痕量四环素类抗生素的荧光分析方法，同时为其他小分子物质或污染物的检测提供新的方法，应用前景非常广泛。
发明内容
本发明解决了现有检测四环素类抗生素方法操作复杂，灵敏性差的不足，提供了一种高灵敏、高选择性检测微量四环素类抗生素的方法。在目标物分子存在下，目标物首先与适配子特异性结合，并引起适配子构型发生变化，形成较稳定的折叠结构，此时，该构型的适配子很难与DNA引物结合，因此游离的DNA引物只能与加入的环状DNA模板结合，在Phi29 DNA聚合酶和dNTPs等存在下，引发滚环扩增反应，DNA引物扩增成成百上千含重复序列的长链DNA，该滚环扩增产物可以进一步与石墨烯基分子信标中的DNA探针结合，阻碍DNA探针中的染料与石墨烯之间的荧光共振能量转移或电子转移过程，体系的荧光逐渐恢复，而且恢复程度与体系中目标物的浓度在一定范围内正相关，从而为土霉素的定量分析提供依据。本发明是一种四环素类抗生素的检测方法，通过下列技术方案实现:一种四环素类抗生素的荧光检测方法，具体步骤如下:(I) 25 150 nM适配子探针与不同浓度的四环素类抗生素充分混合，1(T40°C反应20 40 min后，加入25 150 nM DNA引物，并在37°C反应l(T60min。加入100 300 nM环状DNA模板，25 40°C反应0.5 2 h，分别加入0.025 0.1 U/μ L Phi29 DNA聚合酶，50 200 nMdNTPs在25 40°C反应5 h，水浴加热到60 70 °C保温10 20 min终止反应。(2)20^200 nM染料标记的DNA探针与2 20 Pg/mL石墨烯混合反应10 60 min,在
4°C保存备用。(3)取步骤(I)滚环扩增产物与步骤(2)制备的2(Γ200 nM石墨烯基分子信标混合，体积比控制在1:4 14，室温下测定体系中标记染料的荧光强度随时间变化曲线，测定体系中染料的荧光强度时间变化曲线，根据测量土霉素标准测试液绘制标准工作曲线。(4)对不同样品重复步骤(I)、步骤(2)和步骤(3)进行检测，得到的检测结果与步骤(3)标准工作曲线进行对比，得到样品中四环素类抗生素含量。上述的荧光检测方法，所述的四环素类抗生素为:土霉素、四环素。上述的荧光检测方 法，所述的环状DNA模板的制备步骤如下:磷酸化的2飞μ M padlock探针与4 8 μ M DNA引物充分混合，水浴加热到80 95°C，保持5 15 min，然后退火冷却到37°C保温0.5 2 h，加入2 6 U/μ L Τ4 DNA连接酶，1(T25°C过夜反应。分别加入0.05、.2 U/μ L核酸外切酶I，和0.05、.2 U/μ L核酸外切酶III在37°C保温0.5^2 h降解未反应的单链DNA引物，水浴加热到8(T95°C并保温5^15 min终止反应。最后用粒径10 K的纳滤膜对制备的环状DNA模板分离纯化，除去大分子酶，得到的环状DNA模板分散在缓冲液中，并于_20°C保存备用。上述的荧光检测方法，所述的石墨烯采用传统水热还原石墨氧化物的方法制备。本发明具有如下特点:(I)灵敏度高，检测下限可达0.87nM (S/N=3)。(2)选择性高，噪声值低。(3)操作简单，与传统的适配子电化学传感器相比，该方法避免了对适配子的化学修饰或标记过程，有利于保持适配子对目标物的结合能力。(4)整个反应过程在水相中进行，避免了电化学检测过程中存在的固定、孵化、冲洗等步骤。
图1是本发明所述的检测微量四环素类抗生素的方法过程示意图。图中:a适配子，bDNA引物，c四环素类抗生素分子，d环状DNA模板(padlock探针)，ePhi29 DNA聚合酶，f石墨烯分散液，gFAM标记的DNA探针。图2是本发明的方法获得的检测土霉素的标准工作曲线。
具体实施例方式实施例1，牛奶样品中土霉素含量的测定(I)环状DNA模板的制备取5 μ L磷酸化的padlock探针(最终浓度4 μ M)与10 μ L DNA引物(最终浓度5.6 μΜ)在50 uL 1ΧΤ4 DNA连接酶缓冲液中充分混合，水浴加热到95 ° C，并保持5 min，然后退火冷却到37 ° C保温I h，然后加入T4 DNA连接酶(最终浓度3.5 U/uL),5 yL 0.05% BSA，和50 yL高纯水，16 ° C过夜反应。反应结束后，分别加入I yL10 XExonuclease I 缓冲液，I μ L 10 XExonuclease I 缓冲液，Exonuclease I (最终浓度 0.1 U/μ L)，和 Exonuclease III (最终浓度 0.1 U/yL)在 37 ° C 保温 I h 降解未反应的单链DNA引物，水浴加热到90 ° C并保温10 min终止反应。最后用纳滤膜(10 K，美国Pall公司)对制备的环状DNA模板分离纯化，除去大分子酶，得到的环状DNA模板分散在PBS缓冲液(20 mM，pH= 7.4)中，并于-20 ° C保存备用。(2)石墨烯的制备石墨烯采用传统水热还原方法制备，将40 mL 0.1 mg/mL石墨氧化物水溶液转入衬底为聚四氟的水热反应釜中，180 ° C反应8 h，自然冷却至室温后备用。(3)石墨烯基分子信标的制备取100 nM FAM染料标记的DNA探针与8 Pg/mL步骤(2)制备的石墨烯在PBS缓冲液(20 mM，含100 mM NaCl，pH 7.4)中混合，反应30 min后在4 ° C保存备用。(4)检测方法取10 μ L适配子探针(最终浓度75 nM)与10 μ L不同浓度的土霉素在40 μ L缓冲液(20 mM Tris-HCl，含 100 mM NaCl，2 mM MgCl2, 5 mM KCL, I mM CaCl2,0.02% Tween20,pH 7.4)中充分混合，25 ° C反应20 min后，加入10 μ L DNA引物(最终浓度60 nM),并在37 ° C反应30 min，然后加入20 μ L步骤(I)制备的环状DNA模板(最终浓度170nM)，40 ° C反应I h，最后分别加入100 μ L lXPhi29 DNA聚合酶缓冲液，dNTPs (最终浓度0.5 mM),Phi29 DNA聚合酶(最终浓度4 U/μ L)和0.2 mg/mL BSA，在30 ° C反应5h后，水浴加热到65 ° C保温10 min终止反应。取滚环扩增产物加入步骤(3)制备的石墨烯基分子信标，体积比控制在1:9，室温下测定体系中FAM染料的荧光强度随时间变化曲线，激发波长设定为494 nm,发射波长设定为518 nm。( 5)标准工作曲线的绘制步骤(4)中随着样品中土霉素浓度的增加，传感器的荧光恢复程度和速率逐渐增力口，在10-100 nM范围内，荧光恢复速率与土霉素浓度有较好的线性关系，线性关系系数R =0.998 ο(6)牛奶样品中土霉素含量的测定用于样品检测的牛奶未检出土霉素，故采用加标回收实验。首先牛奶样品首先用10 %的三氯乙酸和氯仿处理,超声15 min后,离心去除沉淀物,用Na2CO3溶液调节pH到
8.0左右，再过膜(截留量3 K)去除样品中的大分子。然后将样品用于步骤(4)方法进行检测，检测结果与步骤(5)得到的标准工作曲线对比，计算出土霉素的浓度，结果如表I所示。表I加标回收实验数据
权利要求
1.一种微量四环素类抗生素的荧光检测方法，其特征包括如下步骤: (1)25 150 nM适配子探针与四环素类抗生素充分混合，10^40°C反应2(T40min后，力口入25 150 nM DNA引物，并在37°C反应l(T60min ;加入100 300 nM环状DNA模板，25 40°C反应0.5 2h，分别加入2 10 U/μ L Phi29 DNA聚合酶，0.25 I mM dNTPs在25 40°C反应5h，水浴加热到6(T70°C保温1(T20 min，终止反应； (2)20^200 nM染料标记的DNA探针与2 20 Pg/mL石墨烯混合反应l(T60min，4°C保存备用； (3)取步骤(I)滚环扩增产物与步骤(2)制备的2(Γ200nM石墨烯基分子信标混合，体积比1:4 14，室温下测定体系中标记染料的荧光强度随时间变化曲线，测定体系中染料的荧光强度时间变化曲线，根据测量土霉素标准测试液绘制标准工作曲线； (4)对不同样品重复步骤(I)、步骤(2)和步骤(3)进行检测，得到的检测结果与步骤(3)标准工作曲线进行对比，得到样品中四环素类抗生素含量。
2.如权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述的四环素类抗生素为土霉素、四环素。
3.如权利要求1或2所述的荧光检测方法，其特征在于，所述的环状DNA模板的制备步骤如下: 磷酸化的2 6 μ M padlock探针与4 8 μ M DNA引物充分混合，水浴加热到80 95°C，保持5 15min，然后退火冷却到37°C保温0.5 2h，加入2 6 U/μ L Τ4 DNA连接酶，10 25°C过夜反应；先后加入0.05、.2 U/μ L核酸外切酶I和0.05、.2 U/μ L核酸外切酶III，在37°C保温0.5 2h降解未反应的单链DNA引物，水浴加热到8(T95°C并保温5 15 min终止反应；最后用粒径10 K的 纳滤膜对制备的环状DNA模板分离纯化，除去大分子酶，得到的环状DNA模板分散在缓冲液中，_20°C保存备用。
4.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述的石墨烯采用水热还原石墨氧化物的方法制备。
全文摘要
本发明涉及一种微量四环素类抗生素的荧光检测方法。本发明利用四环素类抗生素分子与其适配子特异性结合作用，滚环扩增信号放大作用以及石墨烯分子信标高选择作用，结合荧光分光光度计，获得石墨烯分子信标的荧光信号，可实现痕量四环素类抗生素的定量检测。本发明克服了已有技术在检测时存在过于复杂等诸多缺点，提高了灵敏度和选择性，同时为其他小分子物质或污染物的检测提供新的方法。
文档编号G01N21/64GK103115903SQ20131001659
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月16日 优先权日2013年1月16日
发明者赵慧敏, 刘猛, 高升, 全燮 申请人:大连理工大学