专利名称：基于均相时间分辨荧光的检测重金属含量的方法
技术领域：
本发明涉及水体检测环境领域，具体涉及一种基于均相时间分辨荧光的检测重金属含量的方法。
背景技术：
目前由于矿产开采、冶炼加工、机械制造以及仪器仪表、有机物合成等工业中的重金属废水排放，造成不少由重金属(如铅、汞、镉、钴等)引起的水环境污染。重金属废水是对环境污染最严重和对人类危害最大的工业废水之一，因此铅、汞、镉、钴等离子的浓度也成为了水环境监测的重要指标。通过检测水体中铅、汞、镉、钴等离子的浓度，从而大致反应出水体的重金属污染程度。传统的重金属监测的标准分析方法主要以分光光度法和原子吸收分光光度法为主，利用被测物质在特定波长处或一定波长范围内的特定吸收对该物质进行定性和定量分析。随时科技技术的不断进步，国内应用较多的其他方法还有原子吸收法、原子荧光法以及较先进的电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)、电感耦合等离子体-质谱法(ICP-MS)等分析方法。针对此类大型设备昂贵，操作复杂、维护量大、成本较高，不易实现现场检测等弊端。
发明内容
本发明提供一种基于均相时间分辨荧光的检测重金属含量的方法，此方法具有操作简单、速度快、灵敏度高、线性范围宽、使用成本低、能够实现现场检测等优点。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:一种基于均相时间分辨荧光的检测重金属含量的方法，包括以下步骤:
步骤1.将含有Eu3+离子的铕穴状化合物与300nM的1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和300nM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液搅拌混合活化30min形成第一活化混合液；
步骤2.将50nM木瓜蛋白酶与所述第一活化混合液搅拌混合在20°C 3(rC的条件下偶联反应形成Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶，所述含有Eu3+离子的铕穴状化合物和木瓜蛋白酶的摩尔比例为1:5，所述含有Eu3+离子的铕穴状化合物与1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比例为1:2飞；
步骤3.将荧光染料XL665与300nM的1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和300nM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液搅拌混合活化30min形成第二活化混合液；
步骤4.将50nM木瓜蛋白酶与所述第二活化混合液搅拌混合在20°C 30°C的条件下偶联反应形成荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶，所述荧光染料XL665与步骤4中木瓜蛋白酶的摩尔比例为1:5，所述荧光染料XL665与1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比例为1:2飞；
步骤5.将所述Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶与荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶充分混合形成突光检测液； 步骤6.将所述荧光检测液加入待检测水溶液后经的激发光源激发从而检测在620nm和665nm波长的荧光发射强度，并计算665nm荧光发射强度与620nm荧光发射强度比值获得待测液荧光比值；
步骤7.将待测液荧光比值与标准荧光曲线对比从而获得待检测水溶液中重金属离子的浓度，所述标准荧光曲线为基于若干种已知重金属浓度的标准溶液和所述荧光检测液获得的液荧光比值标定出的荧光曲线。上述技术方案中的进一步改进方案如下:
1.上述方案中，所述Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶与荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶按照1:1摩尔比充分混合。2.上述方案中，步骤2中所述Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶经透析袋过滤获得纯化后的Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶。3.上述方案中，步骤4中所述XL665修饰的木瓜蛋白酶经透析袋过滤获得纯化后的XL665修饰的木瓜蛋白酶。4.上述方案中，所述重金属包括Hg2+、Cu2+、Pb2+。5.上述方案中，所述步骤I 4的搅拌速率为300rpm。6.上述方案中，所述步骤6中激发光源产生的光源波长为360nm。7.上述方案中，所述步骤2、步骤4中偶联反应的时间为2 h。8.上述方案中，所述步骤2、步骤4中偶联反应的温度为25°C。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果:
1.本发明检测水体中重金属含量的方法，其待检测水体中重金属离子使得荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶、Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶聚集，从而拉近两者之间的距离，导致两个荧光基团接近时产生Eu3+盐和XL665之间的荧光能量共振转移的特性，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量释放，发射波长为620nm ;另一部分能量转移到XL665或荧光染料d2，发射波长为665nm，从而达到对水体环境中的重金属物质进行检测的目的，提高了废水中重金属离子检测效率、及时性和检测灵敏度。2.本发明检测水体中重金属含量的方法，Eu3+盐和木瓜酶的摩尔比例为1:5，Eu3+盐与1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液-3-乙基碳二亚胺溶液的比例为1:2飞这种比例可以充分活化Eu3+盐表面氨基基团，木瓜酶过量可以增加Eu3+盐和木瓜酶的连接效率，既不会过于浪费试剂；又不会因为过量的活化剂的加入影响Eu3+盐和荧光染料XL665的产品性能；其次，本发明中1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液与N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液与Eu3+盐的摩尔比均为2 5:1，荧光染料XL665与1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和300nM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比均为1: 2 5，可以活化Eu3+盐表面氨基基团，从而和木瓜酶表面的羧基基团进行偶联；其次；所述方案中，搅拌速率为300rpm，可以使各物质充分反应，提高偶联效率，激发光源产生的光源波长为360nm，360nm为Eu3+离子的激发波再次，选优偶联反应的时间为2h，使可以使各物质充分反应，又不会由于超长的反应时间降低各物质活性。
附图1为本发明反应原理示意图； 附图2为本发明标准曲线计算示意 附图3为无重金属离子存在的情况下得到的荧光光谱 附图4为本发明重金属离子存在的情况下得到的荧光光谱图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述:
实施例:一种基于均相时间分辨荧光的检测重金属含量的方法，其特征在于:包括以下步骤:
步骤1.将含有Eu3+离子的铕穴状化合物与300nM的1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和300nM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液搅拌混合活化30min形成第一活化混合液；
步骤2.将50nM木瓜蛋白酶与所述第一活化混合液搅拌混合在20°C 3(rC的条件下偶联反应形成Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶，所述含有Eu3+离子的铕穴状化合物和木瓜蛋白酶的摩尔比例为1:5，所述含有Eu3+离子的铕穴状化合物与1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比例为1:2飞；步骤2中所述Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶经透析袋过滤获得纯化后的Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶；
步骤3.将荧光染料XL665与300nM的1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和300nM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液搅拌混合活化30min形成第二活化混合液；
步骤4.将50nM木瓜蛋白酶与所述第二活化混合液搅拌混合在20°C 3(rC的条件下偶联反应形成荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶，所述荧光染料XL665与步骤4中木瓜蛋白酶的摩尔比例为1:5，所述荧光染料XL665与1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比例为1:2飞；步骤4中所述XL665修饰的木瓜蛋白酶经透析袋过滤获得纯化后的XL665修饰的木瓜蛋白酶；
步骤5.将所述Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶与荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶充分混合形成荧光检测液，所述Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶与荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶按照1:1摩尔比充分混合；
步骤6.将所述荧光检测液加入待检测水溶液后经的激发光源激发从而检测在620nm和665nm波长的荧光发射强度，并计算665nm荧光发射强度与620nm荧光发射强度比值获得待测液荧光比值；
步骤7.将待测液荧光比值与标准荧光曲线对比从而获得待检测水溶液中重金属离子的浓度，所述标准荧光曲线为基于若干种已知重金属浓度的标准溶液和所述荧光检测液获得的液荧光比值标定出的荧光曲线。上述重金属包括Hg2+、Cu2+、Pb2+ ;上述步骤广4的搅拌速率为300rpm。上述步骤6中激发光源产生的光源波长为360nm。上述步骤2、步骤4中偶联反应的时间为2h。上述步骤2、步骤4中偶联反应的温度为25°C。以上内容进一步阐述如下。反应原理如图1所示，Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶组分用量、浓度如表I所示。表 I
权利要求
1.一种基于均相时间分辨荧光的检测重金属含量的方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤1.将含有Eu3+离子的铕穴状化合物与300nM的1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和300nM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液搅拌混合活化30min形成第一活化混合液； 步骤2.将50nM木瓜蛋白酶与所述第一活化混合液搅拌混合在20°C 3(rC的条件下偶联反应形成Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶，所述含有Eu3+离子的铕穴状化合物和木瓜蛋白酶的摩尔比例为1:5，所述含有Eu3+离子的铕穴状化合物与1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比例为1:2飞； 步骤3.将荧光染料XL665与300nM的1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和300nM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液搅拌混合活化30min形成第二活化混合液； 步骤4.将50nM木瓜蛋白酶与所述第二活化混合液搅拌混合在20°C 3(rC的条件下偶联反应形成荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶，所述荧光染料XL665与步骤4中木瓜蛋白酶的摩尔比例为1:5，所述荧光染料XL665与1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比例为1:2飞； 步骤5.将所述Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶与荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶充分混合形成突光检测液； 步骤6.将所述荧光检测液加入待检测水溶液后经的激发光源激发从而检测在620nm和665nm波长的荧光发射强度，并计算665nm荧光发射强度与620nm荧光发射强度比值获得待测液荧光比值； 步骤7.将待测液荧光比值与标准荧光曲线对比从而获得待检测水溶液中重金属离子的浓度，所述标准荧光曲线为基于若干种已知重金属浓度的标准溶液和所述荧光检测液获得的液荧光比值标定出的荧光曲线。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶与荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶按照1:1摩尔比充分混合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤2中所述Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶经透析袋过滤获得纯化后的Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤4中所述XL665修饰的木瓜蛋白酶经透析袋过滤获得纯化后的XL665修饰的木瓜蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述重金属包括Hg2+、Cu2+、Pb2+。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤Γ4的搅拌速率为300rpm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤6中激发光源产生的光源波长为 360nm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤2、步骤4中偶联反应的时间为2h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤2、步骤4中偶联反应的温度为25。。。
全文摘要
本发明公开一种基于均相时间分辨荧光的检测重金属含量的方法，包括将含有Eu3+离子的铕穴状化合物与300nM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和300nM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液搅拌混合形成第一活化混合液；将50nM木瓜蛋白酶与第一活化混合液偶联反应形成Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶；将荧光染料XL665与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和的N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液搅拌混合形成第二活化混合液；将50nM木瓜蛋白酶与第二活化混合液偶联反应形成荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶；将Eu3+盐修饰的木瓜蛋白酶与荧光染料XL665修饰的木瓜蛋白酶混合形成荧光检测液。本发明方法具有操作简单、速度快、灵敏度高、线性范围宽、使用成本低、能够实现现场检测等优点。
文档编号G01N21/64GK103196877SQ201310075459
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者刘小龙, 杨晓冬, 张云, 王毅婧, 魏达秀 申请人:刘小龙, 杨晓冬, 张云