一种高效液相色谱峰保留时间预测方法
【专利摘要】本发明涉及一种高效液相色谱峰保留时间预测方法。该方法包括：测定各种样品的各种成分的标准保留时间，在每个样品的目标成分中选择两个成分作为该样品的双标对照成分，获得双标对照成分在待测样品的供试品溶液中的实测保留时间，获得其他目标成分的实测保留时间，进行两点验证和多点验证等步骤。采用本发明提供的高效液相色谱峰保留时间预测方法能够准确预测待测样品的各种成分的色谱峰的保留时间，进而对待测样品的色谱峰进行定性，进行待测样品的鉴别。本发明所提供的方法具有较高的预测精度，适用的色谱柱数量多，明显优于现有的相对保留时间法。
【专利说明】一种高效液相色谱峰保留时间预测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高效液相色谱峰保留时间预测方法，属于高效液相色谱检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]中药多指标成分的含量测定、指纹图谱分析，化学药(或抗生素)的有关物质检查等工作中一个核心任务就是对数量众多的目标化合物进行定性，如果均使用纯的化学对照品，将给标准物质的制备和供应带来极大的困难，也会显著提高检测成本。因此使用少量化学对照品通过某种方法来对其他色谱峰进行定性，具有重要的意义和应用价值。
[0003]目前，使用一个化学对照品的相对保留时间法是最常用的色谱峰定性法，在欧美及中国药典中广泛用于有关物质检查，替代模式的多指标含量测定研究中也多使用。但由于色谱仪与色谱柱的差异，保留时间的预测值与实测值之间的偏差常常较大，实际应用中需限定色谱柱的型号，或选择同类型、分离性能相似的色谱柱，多有不便。
【发明内容】
[0004]为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种高效液相色谱峰保留时间预测方法，通过两个化学对照品进行色谱峰定性，较之相对保留时间法，该方法能够显著减小定性的误差，增加使用的色谱柱数量。
[0005]为达到上述目的，本发明提供了一种高效液相色谱(HPLC)峰保留时间预测方法，可以称为双标线性校正法，其包括以下步骤:
[0006](I)利用高效液相色谱仪测定各种样品的各种成分在多根不同的色谱柱上的实测保留时间，对在不同色谱柱上测定的同一样品的各种成分的实测保留时间两组两组地进行线性拟合，分别绘制标准曲线并计算相关系数r，剔除(色谱柱测定的)r < 0.995的实测保留时间、(色谱柱测定的)偏离较大的实测保留时间以及(色谱柱测定的)导致色谱峰顺序改变的实测保留时间，以剩下的色谱柱测定的实测保留时间的平均值作为各种成分的标准保留时间；
[0007]或者，以在所有色谱柱上测定的同一样品的同一成分的实测保留时间的平均值为初拟标准保留时间，以所有成分的初拟标准保留时间与所有色谱柱上测定的同一样品的所有成分的实测保留时间分别进行线性拟合，分别绘制标准曲线并计算相关系数r，剔除(色谱柱测定的)r < 0.995的实测保留时间、(色谱柱测定的)偏离较大的实测保留时间以及(色谱柱测定的)导致色谱峰顺序改变的实测保留时间，以剩下的色谱柱测定的实测保留时间的平均值作为各种成分的标准保留时间；
[0008](2)在每一个样品的目标成分中选择两个成分作为该样品的双标对照成分；
[0009](3)在一根色谱柱上运行待测样品的供试品溶液和双标对照成分的对照品溶液并利用高效液相色谱仪进行检测，获得供试品溶液的色谱图，通过双标对照成分的对照品对所获得的色谱图中的色谱峰进行定性，获得双标对照成分在供试品溶液中的实测保留时间；
[0010](4)以双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标建立线性曲线，并得到两点线性方程；
[0011](5)将除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间带入所述两点线性方程，获得相应目标成分的预测保留时间，根据该预测保留时间对供试品的色谱图中的其他色谱峰进行定性，得到相应目标成分的实测保留时间；
[0012]如果所有的除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间和实测保留时间的偏差的绝对值均> t2，则预测失败，更换步骤(3)中的色谱柱，并重复步骤
(3)- (5)；
[0013]如果除双标对照成分之外的待测样品的目标成分之中至少有一个目标成分的标准保留时间和实测保留时间的偏差的绝对值< t2，则进入步骤(6)；
[0014](6)以所有实测保留时间与预测保留时间的偏差的绝对值< t2的目标成分与双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标建立多点关系曲线并得到多点线性方程；
[0015](7)将除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间带入多点线性方程，计算得到相应目标成分的新的预测保留时间；
[0016](8)在供试品的色谱图中找到与新的预测保留时间最接近的色谱峰，得到相应目标成分的新的实测保留时间，并计算各个目标成分的新的实测保留时间与新的预测保留时间的偏差的绝对值，以判断多点线性方程是否包括了所有目标成分:如果所有的偏差的绝对值< t2，则进入下一步骤，如果有偏差的绝对值> t2，则返回步骤(6)，以步骤(8)中计算的所有偏差的绝对值< t2的目标成分与双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标重新建立多点关系曲线并得到新的多点线性方程，重复步骤(6) - (8)；
[0017](9)检测所有目标成分的标准保留时间与新的预测保留时间的偏差的绝对值是否(tm，其中tm< t2:如果是，则预测成功；如果不是，则预测失败；预测失败时，更换步骤(3)中的色谱柱，重复步骤(3)- (9)。
[0018]本发明所提供的上述方法的目的是为了获得待测样品的各种成分的色谱峰的保留时间，并对色谱峰进行定性，利用两个化学对照品达到对待测样品中多个目标成分的定性，所适用的样品可以为中药、天然植物药、化学药、食品(例如保健食品)或者抗生素等，但不限于此，任何需要通过HPLC进行多成分定性的领域均可以适用。
[0019]在上述方法中，优选地，在利用高效液相色谱仪测定各种样品的各种成分在多根色谱柱上的实测保留时间时，在每一根色谱柱均至少进样3次，并且所得到的实测保留时间的RSD应≤2%。
[0020]在上述方法中，优选地，所选择的双标对照品成分的标准保留时间靠近对应的样品的目标成分的保留时间段的两端。这里的保留时间段是指各种成分的色谱峰的保留时间范围。
[0021]在上述方法中，优选地，将样品的目标成分的保留时间段等分为四段，所选择的双标对照品成分的标准保留时间位于第一个分界点和第三个分界点附近。
[0022]在上述方法中，优选地，选择双标对照品成分的标准保留时间时，不选择在色谱柱拟合过程中偏离较大的成分，并且优选廉价易得的成分。[0023]在上述方法中，优选地，t2 < lmin, tm < Imin ;更优选地，t2为0.7min, tm为0.5min。
[0024]在上述方法中，采用越多的色谱柱进行测定，可以获得更多的数据，而加入的数据越多，误差就越小，但也有一个收益递减效应，优选地，在步骤(I)中，各种成分的标准保留时间时采用的10-20根色谱柱测定的实测保留时间进行计算，由此获得的标准保留时间具有足够的代表性，在一开始选择色谱柱进行实测保留时间测定时应选择较多的色谱柱，以满足这里计算时采用10-20根色谱柱测得的数据的这一要求。
[0025]根据本发明的具体实施方案，上述高效液相色谱峰保留时间预测方法可以按照以下方式进行，其具体流程可以如图1所示:
[0026]1、色谱柱拟合
[0027](I)利用高效液相色谱仪测定各种样品的各种成分在多根不同的色谱柱上的实测保留时间(至少保留3位小数)，该检测可以采用优化的色谱条件(包括柱温、流速和流动相的种类、比例，可以根据药典的记载进行选择)进行，在检测过程中至少要进样三次，并且要满足保留时间的RSD ( 2%，以控制采集数据的误差；
[0028]对在不同色谱柱上测定的同一样品的各种成分的实测保留时间两组两组地进行线性拟合，分别绘制标准曲线并计算相关系数r，剔除偏离较大的色谱柱甚至导致色谱峰顺序改变的色谱柱，一般来说，这些色谱柱与其他色谱柱的拟合效果都不佳，表现为r
<0.995或者某个(或某些)点明显偏离拟合的直线；剔除这些数据可以使获得的标准保留时间等数据更加准确；在剔除的时候，可以对色谱柱进行分类，将相互之间拟合比较好的放在一起，然后进行选择，尽量选择数量较多的一组；
[0029]剔除之后，以未被剔除的色谱柱测定的实测保留时间的平均值作为各种成分的标准保留时间(standard retention time,简称SRT),以该标准保留时间作为预测的基准值，计算时应采用10-20根色谱柱测定的数据进行。
[0030](2)在每一个样品的目标成分中选择两个成分作为该样品的双标对照成分；理论上，目标物中的任意两个成分作为双标的效果应该都是一样的，但实际上由于色谱柱和色谱仪的差异、成分间结构的差异、洗脱条件的复杂程度和色谱分析的偶然误差，双标的选择还是会造成差别的，此外，还要兼顾该对照品获得的难易程度和价格因素。以下是双标选择应该遵循和兼顾的原则:双标应尽量分布在目标化合物保留时间段的两端，最优位置是将保留时间段均分成4段后，第一和第三两个分界点附近；双标成分尽量不要选择在色谱柱拟合过程中偏离较大的成分；双标成分尽量选择价廉易得的成分。
[0031]获得各种样品的各种成分的SRT和各种样品的双标对照成分之后，可以将其汇总在一起作为标准集或者药典，当需要对某一样品的色谱峰的保留时间进行预测时，可以从该标准集或者药典中查询其对应的SRT和双标对照成分，然后按照以下步骤进行预测:
[0032]2、两点预测:
[0033](3)在一根色谱柱(可以是任意的色谱柱，不一定是建立上述标准集或药典时采用的色谱柱)上运行待测样品的供试品溶液和双标对照成分的对照品溶液并利用高效液相色谱仪进行检测，获得供试品溶液的色谱图，通过双标对照成分的对照品对所获得的色谱图中的色谱峰进行定性，获得双标对照成分在供试品溶液中的实测保留时间；
[0034](4)以双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标建立线性曲线，并得到两点线性方程；
[0035](5)将除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间带入所述两点线性方程，获得相应目标成分的预测保留时间，根据该预测保留时间对供试品的色谱图中的其他色谱峰进行定性，得到相应目标成分的实测保留时间；
[0036]如果除双标对照成分之外，待测样品所有的目标成分的标准保留时间和实测保留时间的偏差的绝对值均> t2，则预测失败，更换步骤(3)中的色谱柱，并重复步骤(3)- (5)；
[0037]如果除双标对照成分之外，待测样品的目标成分之中至少有一个目标成分的标准保留时间和实测保留时间的偏差的绝对值< t2，则进入步骤(6)。
[0038]3、多点预测:
[0039](6)以所有实测保留时间与预测保留时间的偏差的绝对值< t2的目标成分与双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标建立多点关系曲线并得到多点线性方程；
[0040](7)将除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间带入多点线性方程，计算得到相应目标成分的新的预测保留时间；
[0041](8)在供试品的色谱图中找到与新的预测保留时间最接近的色谱峰，得到相应目标成分的新的实测保留时间，并计算各个目标成分的新的实测保留时间与新的预测保留时间的偏差的绝对值，以判断多点线性方程是否包括了所有目标成分:如果所有的偏差的绝对值< t2，则进入下一步骤，如果有偏差的绝对值> t2，则返回步骤(6)，即使只有一个绝对值> t2也要返回步骤(6)，以步骤(8)中计算的所有偏差的绝对值< t2的目标成分与双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标重新建立多点关系曲线并得到新的多点线性方程，重复步骤(6) - (8)，直到建立的多点线性方程能够包括所有的点；
[0042]在步骤(6)—开始建立多点线性方程时，可能会有部分的目标成分的数据因为偏差的绝对值>t2而没有用到，当在步骤(7)中将其带入多点线性方程时，所计算得到的新的预测保留时间与标准保留时间的差值的绝对值有可能会变为< t2，因此，当有偏差的绝对值>t2而返回步骤(6)之后，建立新的多点线性方程时所采用的数据会与之前的不同，后续的过程也会有不同，当所有的数据都能够满足偏差的绝对值< t2之后，就可以进入后续的步骤(9)。
[0043](9)检测所有目标成分的标准保留时间与新的预测保留时间的偏差的绝对值是否(tm，且tm< t2:如果是，则预测成功；如果不是，则预测失败；预测失败时，更换步骤(3)中的色谱柱，重复步骤(3)- (9)。
[0044]通过后面的多点预测可以提高预测的精度。另外，t2 >乜可以达到宽进严出的效果，一方面提高适用柱的数量，另一方面也保证了预测的准确度，至于上述t2、tm的具体数值，可以根据情况进行调整，一般不大于lmin。
[0045]采用本发明提供的高效液相色谱峰保留时间预测方法能够准确预测待测样品的各种成分的色谱峰的保留时间，进而对待测样品的色谱峰进行定性，进行待测样品的鉴别。本发明所提供的方法具有较高的预测精度，适用的色谱柱数量多，明显优于现有的相对保留时间法。
【专利附图】
【附图说明】[0046]图1为本发明提供的高效液相色谱峰保留时间预测方法的流程图。
[0047]图2为两根色谱柱的拟合直线图。
[0048]图3a-图3c为大黄中的5种蒽醌在10根色谱柱上的拟合结果。
[0049]图4a_图4c为不同色谱柱上测定的大黄五种成分的保留时间的线性关系图。
[0050]图5为供试品溶液的色谱图。
【具体实施方式】
[0051]为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
[0052]实施例
[0053]本实施例提供了一种高效液相色谱峰保留时间预测方法，其对大黄进行色谱峰保留时间的预测，包括以下步骤:
[0054]1、色谱柱拟合:
[0055]按照优化的色谱条件(根据《中国药典》2010年版一部大黄的含量测定项(第22页)确定，具体参数为流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液(85:15)，检测波长254nm，柱温30°C，流速1.0mL.mirT1)，在11根的不同品牌、型号的C18柱上进样混合对照品或供试品溶液，获得五种成分(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)在不同色谱柱上的实测保留时间，至少进样三次并且要保留三位小数，去除RSD大于2%的色谱柱；所采用的色谱柱有 12 根，分别为=Kromasil C18*，Sunfire C18林，Agilent TC-C18*，Inertsil C18**，Hyperisil C18*, Vensil MP C18**, Shimadzu VP C18**, Phenomen Iuna C18**, AgilentHC-C18*，Agilent Zorbax SB-C18*，Shiseido AQ C18*，Shiseido MG C18*，以上 C18 柱简称为 Cl 至 C12 (*.4.6mmX250mmX5ym，**.4.6mmX 150mmX 5 μ m)，其中 Cl 至 Cll 用于色谱柱拟合，C12作为未知柱用于方法验证(未参与SRT的计算)；
[0056]将Cl至Cll色谱柱测定的上述五种成分的实测保留时间进行线性拟合(两两组合)，绘制标准曲线，计算相关系数r，然后剔除偏离较大甚至导致色谱峰顺序改变的色谱柱(例如r < 0.995的色谱柱，以及个别点明显偏离拟合直线的色谱柱)；例如图2所示，其为C2、C11两根色谱柱的拟合直线，可以看出，Cll色谱柱的第二个点(大黄酸)处与C2色谱柱偏离较大，这两根色谱柱不能够放在一起，应剔除一个；通过拟合，保留了 Cl至CIO，Cll剔除。
[0057]2、SRT 的确定:
[0058]在2个色谱系统上采用《中国药典》2010年版大黄项下的含量测定方法，同时测定其中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚5种游离蒽醌成分(以上5种成分按保留时间从小到大排序)，系统1:岛津2010A (对应柱1、2);系统2:waters e2695 (对应柱3、4)和4根不同品牌和型号的色谱柱，柱1:kromasilC18 (250mmX 4.6mmX 5 μ m)；柱 2:waters sunf ire C18 (150mmX 4.6mmX 5 μ m)；柱 3:agilent TC-C18 (250mmX4.6mmX 5 μ m);柱 4:1nertsil C18 (150mmX4.6mmX 5 μ m),以验证该结论的准确性和适用性，结果见图4a-图4c，其中，横、纵坐标分别为5种成分在任意两根色谱柱上的保留时间。
[0059]图3a-图3c为大黄5种蒽醌在10根色谱柱上的拟合结果，横坐标为5种蒽醌的SRT，纵坐标为各色谱柱上的实测保留时间，各色谱柱的线性方程和相关系数见表I。
[0060]表I不同色谱柱上保留时间的线性方程及相关系数
[0061]
【权利要求】
1.一种高效液相色谱峰保留时间预测方法，其包括以下步骤: (1)利用高效液相色谱仪测定各种样品的各种成分在多根不同的色谱柱上的实测保留时间，对在不同色谱柱上测定的同一样品的各种成分的实测保留时间两组两组地进行线性拟合，分别绘制标准曲线并计算相关系数r，剔除r< 0.995的色谱柱测定的实测保留时间、偏离较大的色谱柱测定的实测保留时间以及导致色谱峰顺序改变的色谱柱测定的实测保留时间，以剩下的色谱柱测定的实测保留时间的平均值作为各种成分的标准保留时间； 或者，以在所有色谱柱上测定的同一样品的同一成分的实测保留时间的平均值为初拟标准保留时间，以所有成分的初拟标准保留时间与所有色谱柱上测定的同一样品的所有成分的实测保留时间分别进行线性拟合，分别绘制标准曲线并计算相关系数r，剔除r<0.995的色谱柱测定的实测保留时间、偏离较大的色谱柱测定的实测保留时间以及导致色谱峰顺序改变的色谱柱测定的实测保留时间，以剩下的色谱柱测定的实测保留时间的平均值作为各种成分的标准保留时间； (2)在每一个样品的目标成分中选择两个成分作为该样品的双标对照成分； (3)在一根色谱柱上运行待测样品的供试品溶液和双标对照成分的对照品溶液并利用高效液相色谱仪 进行检测，获得供试品溶液的色谱图，通过双标对照成分的对照品对所获得的色谱图中的色谱峰进行定性，获得双标对照成分在供试品溶液中的实测保留时间； (4)以双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标建立线性曲线，并得到两点线性方程； (5)将除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间带入所述两点线性方程，获得相应目标成分的预测保留时间，根据该预测保留时间对供试品的色谱图中的其他色谱峰进行定性，得到相应目标成分的实测保留时间； 如果所有的除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间和实测保留时间的偏差的绝对值均> t2，则预测失败，更换步骤(3)中的色谱柱，并重复步骤(3)- (5)； 如果除双标对照成分之外的待测样品的目标成分之中至少有一个目标成分的标准保留时间和实测保留时间的偏差的绝对值≤t2，则进入步骤(6)； (6)以所有实测保留时间与预测保留时间的偏差的绝对值<t2的目标成分与双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标建立多点关系曲线并得到多点线性方程； (7)将除双标对照成分之外的待测样品的目标成分的标准保留时间带入多点线性方程，计算得到相应目标成分的新的预测保留时间； (8)在供试品的色谱图中找到与新的预测保留时间最接近的色谱峰，得到相应目标成分的新的实测保留时间，并计算各个目标成分的新的实测保留时间与新的预测保留时间的偏差的绝对值，以判断多点线性方程是否包括了所有目标成分:如果所有的偏差的绝对值(t2，则进入下一步骤，如果有偏差的绝对值> t2，则返回步骤(6)，以步骤(8)中计算的所有偏差的绝对值< t2的目标成分与双标对照成分的标准保留时间为纵坐标、实测保留时间为横坐标重新建立多点关系曲线并得到新的多点线性方程，重复步骤(6) - (8)； (9)检测所有目标成分的标准保留时间与新的预测保留时间的偏差的绝对值是否(tm，且tm< t2:如果是，则预测成功；如果不是，则预测失败；预测失败时，更换步骤(3)中的色谱柱，重复步骤(3)- (9)。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱峰保留时间预测方法，其中，所述样品为中药、天然植物药、化学药、食品或者抗生素。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱峰保留时间预测方法，其中，在利用高效液相色谱仪测定各种样品的各种成分在多根色谱柱上的实测保留时间时，在每一根色谱柱均至少进样3次，并且所得到的实测保留时间的RSD ( 2%。
4.根据权利要求1所述的高效液相色谱峰保留时间预测方法，其中，所选择的双标对照品成分的标准保留时间靠近样品的目标成分的保留时间段的两端。
5.根据权利要求1或4所述的高效液相色谱峰保留时间预测方法，其中，将样品的目标成分的保留时间段等分为四段，所选择的双标对照品成分的标准保留时间位于第一个分界点和第三个分界点附近。
6.根据权利要求4或5所述的高效液相色谱峰保留时间预测方法，其中，选择双标对照品成分的标准保留时间时，不选择在色谱柱拟合过程中偏离较大的成分，优选廉价易得的成分。
7.根据权利要求1所述的高效液相色谱峰保留时间预测方法，其中，所述t2<lmin，tm< lmin。
8.根据权利要求7所述的高效液相色谱峰保留时间预测方法，其中，所述12为0.7min,所述tm为0.5min。
9.根据权利要求1所述的高效液相色谱峰保留时间预测方法，其中，在步骤(I)中，各种成分的标准保留时间时采用的10-20根色谱柱测定的实测保留时间进行计算。
【文档编号】G01N30/91GK103439440SQ201310291229
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月11日 优先权日:2013年7月11日
【发明者】孙磊, 金红宇, 马双成 申请人:中国食品药品检定研究院