一种肠道病毒71型可视化重组病毒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种肠道病毒71型可视化重组病毒及其应用。本发明首先保护一种双链DNA分子，为将CCPGCC标签的编码基因插入肠道病毒71型的基因组DNA的3C蛋白酶编码区中得到的DNA分子；所述CCPGCC标签为序列表的序列1所示的多肽片段。含有所述双链DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。本发明还保护一种肠道病毒71型的重组病毒，其基因组RNA的编码DNA如序列表的序列4所示。本发明所提供的肠道病毒71型可视化重组病毒在基础研究方面具有良好的应用前景。
【专利说明】-种肠道病毒71型可视化重组病毒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肠道病毒71型可视化重组病毒及其应用，特别涉及一种肠道病 毒71型3C蛋白可视化重组病毒及其应用。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（EV71)是小RNA病毒科（Picornaviridae)肠道病毒属 (Enterovirus)的重要成员。EV71感染主要引起手足口病（Hand-Foot-Mouse Disease)，可 导致严重的神经系统综合症，是手足口病重症和死亡病例的主要原因。目前临床上尚无针 对EV71的有效疫苗和特异抗病毒药物。
[0003] EV71的基因组为单股正链RNA分子，包含一个单一读码框，编码4个结构蛋白 (VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白和VP4蛋白）和7个非结构蛋白（2A蛋白、2B蛋白、2C蛋 白、3A蛋白、3B蛋白、3C蛋白和3D蛋白XEV71病毒基因组的5'和3'端为非编码区 (untranslated regior^UTRXS' UTR内含有内部核糖体进入位点（IRES)等复制翻译调控 元件，3' UTR内含有三个茎环结构和PolyA元件。3C蛋白，又称3C蛋白酶（3CPM)，是病毒 基因组编码的两个蛋白酶之一，主要负责除VP1-2A、VP2-VP4位点以外，病毒多聚蛋白其它 位点的切割。此外，3C PM还可对部分宿主蛋白进行切割，是病毒-宿主相互作用过程中的关 键蛋白，但目前对于3CP?在宿主细胞内的表达与转运机制，及其与宿主因子相互作用的机 制尚不清楚。
[0004] 报告病毒是将荧光蛋白标签插入病毒基因组中得到的重组病毒，能够实现病毒基 因组翻译表达水平的监测，以及病毒蛋白的示踪。目前对蛋白进行荧光标记最常用的手段 是传统的免疫荧光技术，但是该技术无法对病毒进行实时成像。EV71病毒基因组总长只有 7. 4kb，3CpM基因长度约500bp，将长度约为Ikb的GFP、RFP或其它荧光素酶的编码基因插 入病毒基因组具有较大难度，因此目前EV71的可视化报告病毒尚未见报道。
[0005] 最近的研究报道了 一种新的成像技术即"双砷-四半胱氨酸（biarsenical tetracysteine，TC)技术。该技术利用蛋白质中CCPGCC结构域作为标签，当一种可以穿透 脂双膜的双砷染料共价结合上述结构域上的两对半胱氨酸时，便可实现对TC标签蛋白质 的荧光成像。相对传统的蛋白荧光标记技术，该技术具有以下优点=(I)CCPGCC标签只含 有6个氨基酸，对目标蛋白结构破坏甚为微小，因此可极大的提高获得突变病毒的成功率； (2)具有TC标签的蛋白一旦翻译产生，双砷染料即刻能够结合到蛋白实现成像，相比其它 需要折叠后才能够实现荧光成像的蛋白，其成像的速度快，在进行蛋白表达及转运的相关 研究时，能够更加真实的反应靶蛋白本身的实际情况；（3)该染料能够自由穿透核膜和质 膜，在胞内成像无死角。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种肠道病毒71型可视化重组病毒及其应用。
[0007] 本发明首先保护一种双链DNA分子，为将CCPGCC标签的编码基因插入肠道病毒71 型的基因组DNA的3C蛋白酶编码区中得到的DNA分子；所述CCPGCC标签为序列表的序列 1所示的多肽片段。
[0008] 所述CCPGCC标签的编码基因可如序列表的序列2所不。
[0009] 所述3C蛋白酶可如序列表的序列5所示。
[0010] 所述3C蛋白酶编码区可如序列表的序列3所示自5'末端第5387至5935位核苷 酸所示。
[0011] 所述肠道病毒71型具体可为AH/08/06株。
[0012] 所述AH/08/06株的基因组DNA如序列表的序列3所示。
[0013] 所述双链DNA分子具体可如序列表的序列4所示。
[0014] 含有以上任一所述双链DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均 属于本发明的保护范围。
[0015] 所述重组载体具体可为重组质粒乙；所述重组质粒乙与重组质粒甲的差异仅在于 在序列表的序列3所示的双链DNA分子第5929位核苷酸和第5930位核苷酸之间插入了编 码CCPGCC标签的核苷酸序列"tgctgcccaggatgctgc" ；所述重组质粒甲具体可为将序列表 的序列3所示的双链DNA分子插入pBR322质粒的多克隆位点（如SnaBI和MluI酶切位点 之间）得到的重组质粒。
[0016] 本发明还保护一种肠道病毒71型的重组病毒，其基因组RNA的编码DNA如序列表 的序列4所示。
[0017] 所述重组病毒的制备方法具体如下：将以上任一所述的双链DNA分子的RNA转录 体导入哺乳动物细胞并培养，得到所述重组病毒。所述重组病毒的制备中，具体可将线性化 的所述重组质粒乙的RNA转录体导入哺乳动物细胞并培养。线性化的所述重组质粒乙具体 可为将所述重组质粒乙用限制性内切酶MluI单酶切后得到的线性DNA分子。所述哺乳动 物细胞具体可为RD细胞或Vero细胞。
[0018] 本发明还保护一种监测肠道病毒71型感染哺乳细胞过程的方法，包括如下步骤：
[0019] ( 1)将以上任一所述的重组病毒接种至哺乳动物细胞；
[0020] (2)加入FlAsH-EDT2染料，通过观察荧光信号检测肠道病毒71型感染哺乳细胞过 程。
[0021] 所述哺乳动物细胞具体可为RD细胞或Vero细胞。
[0022] 本发明还保护一种筛选在肠道病毒71型感染哺乳细胞过程与3CPM相互作用的宿 主因子的方法，依次包括如下步骤：
[0023] ( 1)将以上任一所述的重组病毒接种至哺乳动物细胞；
[0024] (2)加入FlAsH_EDT2染料，并观察荧光信号；
[0025] (3)加入针对候选的宿主因子的单克隆抗体并孵育；
[0026] (4)加入针对所述单克隆抗体的酶标二抗，显色后观察荧光信号；
[0027] (5)将步骤（2)的荧光信号和步骤（4)的荧光信号进行共定位处理，从而确定待测 宿主因子是否为与3C PM结合的宿主因子。
[0028] 所述哺乳动物细胞具体可为RD细胞或Vero细胞。
[0029] 本发明提供的肠道病毒71型可视化重组病毒具有如下优点：（1)生物学特征与野 生型病毒一致，具有良好的代表性；（2)基因稳定，回复为野生型病毒的可能性低；（3)能够 直接观察到病毒3CPM蛋白从表达至入核的全过程；（4)能够进行3CPM蛋白与宿主蛋白的 共定位研究，且无需利用3CP?单抗，操作简单，成本低；（5)能够在病毒感染细胞后实时监 测3C PM的表达与转运，根据肉眼监测结果及具体研究需要，能够将实验体系随时固定在病 毒感染细胞后的任何阶段，这在研究3C P?与宿主蛋白相互作用时具有巨大优势，目前其它 技术手段无法实现这一点。本发明所提供的肠道病毒71型可视化重组病毒在基础研究方 面具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1为重组质粒乙制备过程中的琼脂糖凝胶电泳图。
[0031] 图2为重组质粒甲和重组质粒乙的部分测序结果。
[0032] 图3为间接免疫荧光分析的结果。
[0033] 图4为免疫印迹分析的结果。
[0034] 图5为蚀斑分析的结果。
[0035] 图6为各代病毒液的部分测序结果。
[0036] 图7为病毒的增殖特性。
[0037] 图8为Vero细胞的实时监测结果。
[0038] 图9为RD细胞的实时监测结果。
[0039] 图10为3CPM与CstF-64的共定位分析
【具体实施方式】
[0040] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。RD细胞(人胚胎型横纹肌肉瘤细胞）：购自ATCC，产品目录号为CCL-136。Vero细胞 (非洲绿猴肾细胞）：购自ATCC，产品目录号为CCL-81。如无特殊说明，实施例中所用的PBS 缓冲液均为pH7. 2、0. OlM的PBS缓冲液。针对肠道病毒71型的VPl蛋白的特异性单抗：购 自Abcam公司，产品目录号为ab36367。突光标记的羊抗鼠 IgG抗体：购自北京中杉金桥公 司，产品目录号为ZF-0512。碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗：购自北京康为世纪公司，产品 目录号CW0110。FIAsH-EDT 2染料：购自英潍捷基公司，产品目录号T34561。anti-CstF-64 单抗：购自圣克鲁斯公司，产品目录号sc-166647。Texas Red标记山羊抗鼠 IgG抗体：购 自北京康为世纪公司，产品目录号CW0154。pBR322质粒：参考文献：Arita et al.，2005. J Gen Virol, 86:1391-1401。
[0041] 实施例I、重组EV71病毒的构建
[0042] AH/08/06株为一种肠道病毒71型国内分离株，其基因组RNA对应的全长cDNA如 序列表的序列3所示（自5'末端第5387至5935位核苷酸为3C PM基因，编码序列表的序列 5所示的3CPM蛋白）。
[0043] 一、肠道病毒71型3CPM重组质粒的构建与鉴定
[0044] 1、构建EV71 AH/08/06株全长感染性cDNA克隆A12的质粒
[0045] 合成序列表的序列3所示的双链DNA分子，并插入pBR322质粒的SnaBI和MluI 酶切位点之间，得到重组质粒甲（又称携带EV71 AH/08/06株全长感染性cDNA克隆A12的 质粒，又称肠道病毒71型重组质粒)。
[0046] 2、分别设计并合成如下引物：
[0047] NruI-F ：5! -aagacagctctcgcgacttgctcgtgtcat-3'；
[0048] TC3C-SI-R :5' - - gcagcatcc tgggcagcai actagcaaagtaactccttttgagacccgcgc-?> ! #
[0049] TC3C-S2-F ：5 ' - tgctgcccaggatgctgc\ gaacaaggagagatccagtgggttaagcccaa t_3 ' ；
[0050] MluI-R -ggccctttcgtcttcaaacgcgtttttt-3' 〇
[0051] 方框标注编码CCPGCC标签的序列，下划线标注限制性内切酶识别序列。
[0052] 3、以重组质粒甲为模板，用NruI-F和TC3C-S1-R组成的引物对进行PCR扩增，得 至Ij PCR扩增产物(约2519bp)。
[0053] 4、以重组质粒甲为模板，用TC3C-S2-F和MluI-R组成的引物对进行PCR扩增，得 至Ij PCR扩增产物(约1542bp)。
[0054] 5、同时将步骤3的PCR扩增产物和步骤4的PCR扩增产物作为模板，用NruI-F和 MluI-R组成的引物对进行融合PCR扩增，得到PCR扩增产物(约4043bp )。
[0055] 6、用限制性内切酶NruI和MluI双酶切步骤5的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0056] 7、用限制性内切酶NruI和MluI双酶切重组质粒甲，回收载体骨架(约6kb)。
[0057] 8、将步骤6的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒乙(又称肠道病毒 71型3CP?重组质粒)。测序结果表明，重组质粒乙与重组质粒甲的差异仅在于在序列表的 序列3所示的双链DNA分子第5929位核苷酸和第5930位核苷酸之间插入了编码CCPGCC 标签的核苷酸序列" tgctgcccaggatgctgc"。
[0058] 重组质粒乙制备过程中的琼脂糖凝胶电泳图见图1，其中图IA中的泳道2为步骤 3的PCR扩增产物，图IA中的泳道1为步骤4的PCR扩增产物，图IB的泳道1为步骤5的 PCR扩增产物，图IA和图IB中的泳道M均为分子量标记。
[0059] 重组质粒甲和重组质粒乙的部分测序结果见图2。
[0060] 二、肠道病毒71型3CPM重组病毒的拯救
[0061] 1、体外转录
[0062] (1)用限制性内切酶MluI单酶切重组质粒乙，回收线性化的质粒。
[0063] (2)取步骤（1)得到的线性化的质粒作为体外转录模板，用SP6体外转录试剂盒 (购自普洛麦格公司，产品目录号为P1280)进行体外转录，得到RNA转录体，-80°C保存。
[0064] 2、转染RD细胞
[0065] 利用脂质体（Lipofectamine 2000)将RNA转录体转染RD细胞。步骤如下：（1)首 先将RD细胞接种6孔板，用DMEM完全培养基(含10%胎牛血清、lOOU/ml青霉素和100 μ g/ ml链霉素）培养至90%单层；（2)将6 μ 1脂质体与125 μ I OPTI-MEM培养基混合并室温静 置5min，同时将20 μ I RNA转录体与125 μ I OPTI-MEM培养基混合，将上述两种混合物充分 混匀，室温静置20min ;(3)用500 μ I OPTI-MEM培养基洗涤步骤（1)中的单层细胞两次，然 后每孔加入800 μ I OPTI-MEM培养基；（4)将步骤（2)得到的混合物加入完成步骤（3)的6 孔板并摇匀，其中步骤（2)得到的混合物为加入1个孔的剂量，置于37°C 5% CO2的培养箱 中培养6h (期间摇动一次);吸弃上清，加入2ml DMEM维持培养基(含2%胎牛血清、lOOU/ml 青霉素和100 μ g/ml链霉素）并培养48h。
[0066] 完成步骤2时，细胞病变（CPE)达到++++ (90-100%)。
[0067] 3、恢复病毒的传代鉴定及扩大培养
[0068] (1)将完成步骤2的培养体系冻融一次，然后IOOOOrpm离心3min，收集上清（即为 肠道病毒71型3C P?重组病毒的病毒种子液)。
[0069] (2)病毒的扩大培养
[0070] 取500 μ 1步骤（1)得到的病毒种子液，接种于长满90%的单层RD细胞(细胞培养 于25cm2细胞培养瓶)，37°C吸附lh，然后补加含2%FBS的DMEM维持培养基，置37°C 5% CO2 的培养箱中培养，待细胞病变达到++++时，冻融一次，然后IOOOOrpm离心3min，收取上清液 (即为肠道病毒71型3C P?重组病毒的病毒培养液)。
[0071] 4、恢复病毒基因组的RT-PCR鉴定
[0072] 提取步骤3得到的病毒培养液的总RNA并反转录为cDNA，将cDNA进行测序，测序 结果如序列表的序列4所示。
[0073] 三、肠道病毒71型野生病毒的拯救
[0074] 用重组质粒甲代替重组质粒乙进行步骤二，得到肠道病毒71型野生病毒的病毒 培养液。
[0075] 后续实施例中的肠道病毒71型均是由实施例1制备的肠道病毒71型3CP?重组病 毒的病毒培养液或肠道病毒71型野生病毒的病毒培养液提供的。肠道病毒71型3C PM重 组病毒用TC3C表示，肠道病毒71型野生病毒用A12表示。
[0076] 实施例2、间接免疫荧光分析 [0077] 1、抗原片的制备
[0078] 利用8孔灭菌细胞培养载玻片培养RD细胞，待细胞铺满90%后，接种肠道病毒71 型，37°C吸附lh，吸弃上清，补加含2% FBS的DMEM维持培养基，置于37°C 5% CO2培养箱 进行培养。分别于接种病毒6、12、24h后取样，用PBS缓冲液洗三遍细胞，加入预冷的丙酮 (500 μ 1/孔）并-20°C固定过夜。取出载玻片后室温干燥，_20°C保存。
[0079] 2、间接免疫荧光分析
[0080] 取出步骤1制备的抗原片，平衡至室温，每孔滴加 100μ 1 1 :200倍稀释的针对肠 道病毒71型的VPl蛋白的特异性单抗，置于37°C湿盒中孵育lh，取出抗原片并用PBS缓冲 液震荡漂洗3次；室温晾干后每孔加入20μ I I :800倍稀释的荧光标记的羊抗鼠 IgG抗体， 置于37°C湿盒中孵育30min ;取出抗原片，先用蒸馏水漂洗1次，再置于PBS缓冲液中振荡 漂洗3次；加入DAPI核染剂，室温孵育5min，然后用PBS缓冲液漂洗三遍；室温晾干后置于 突光显微镜下观察。
[0081] 照片见图3。肠道病毒71型3CP?重组病毒和肠道病毒71型野生病毒均可以有效 表达VPl蛋白。
[0082] 实施例3、免疫印迹分析
[0083] 将RD细胞接种48孔板，细胞长满单层后，接种肠道病毒71型，37°C 5% CO2培养 箱培养6h，然后用PBS缓冲液洗细胞三遍，加入0. 25%的胰酶将细胞消化至圆缩，弃净胰酶 后用PBS缓冲液重悬细胞，加入蛋白上样缓冲液，水煮沸10分钟后上样，进行SDS-PAGE(5% 堆积胶、80V，12%分离胶、120V，电泳时间共计lh)和免疫印迹。免疫印迹中，采用I :1000倍 稀释的针对肠道病毒71型的VPl蛋白的特异性单抗或1 :100倍稀释的anti-3CpM单抗，采 用I :1000倍稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗。设置不接种肠道病毒71型的空白对照 (Neg)0
[0084] 照片见图4,其中图A为采用针对肠道病毒71型的3CPM蛋白的特异性单抗的结果 (3C PM蛋白的分子量为20KD)，图B为采用针对肠道病毒71型的VPl蛋白的特异性单抗的 结果（VP1蛋白的分子量为33KD)。两种单抗均可以识别肠道病毒71型3C P?重组病毒和肠 道病毒71型野生病毒。
[0085] 实施例4、感染性、基因组稳定性分析及蚀斑分析
[0086] 1、蚀斑分析
[0087] 将浓度为I X 107PFU/ml的肠道病毒71型进行10倍梯度(稀释度依次为10' 10' 10_4、10_5、10_6、KT7和10_ 8)，各个稀释液分别接种于6孔板单层RD细胞，置于37°C 5% CO2 培养箱中吸附Ih ;吸弃上清，加入琼脂盖(含1%琼脂和2%FBS的DMEM培养基)，置于37°C 5% CO2培养箱中培养3d ;加入4%甲醛溶液室温固定3h，甩掉琼脂盖后加入结晶紫染色液， 37°C染色30min，用水洗去染色液，观察蚀斑形态。设置不接种肠道病毒71型的空白对照 (Neg) 0
[0088] 照片见图5,肠道病毒71型3CPM重组病毒和肠道病毒71型野生病毒均可观察到 蚀斑，且噬斑形态一致。
[0089] 2、感染性、基因组稳定性分析
[0090] 将肠道病毒71型3CP?重组病毒接种至长满50%RD细胞的12孔板中，置于37°C 5% CO2培养箱中吸附lh，吸弃上清，补加含2%FBS的DMEM维持培养基，置于37°C 5% 0)2培 养箱培养，每天观察细胞病变情况，细胞发生CPE后收集培养上清，作为第1代病毒液。将 第1代病毒液接种RD细胞，重复进行上述培养，得到第2代病毒液。重复进行上述培养，依 次得到第3代病毒液、第4代病毒液和第5代病毒液。分别将第1代病毒液至第5代病毒 液提取总RNA并反转录为cDNA,然后进行测序。
[0091] 部分测序结果见图6。各代病毒液的测序结果均如序列表的序列4所示，即插入的 CCPGCC标签序列很稳定。
[0092] 实施例5、增殖特性
[0093] MOI 即感染复数（multiplicity of infection)。
[0094] 将肠道病毒71型按照MOI=O. 01的剂量接种RD细胞，在37°C 5%C02培养箱中吸附 2h，然后加入含2%FBS的DMEM维持培养基，分别在接种后第6、12、24、36、48h收取上清液， 采用实施例4的步骤1的方法进行蚀斑分析并统计PFU，计算上清液的病毒滴度（PFU/mL)， 根据病毒滴度绘制一步生长曲线。
[0095] 结果见图7。肠道病毒71型3CP?重组病毒和肠道病毒71型野生病毒的生长曲线 基本一致，即CCPGCC标签基本没有对病毒的增殖特性产生影响。
[0096] 实施例6、肠道病毒71型3CP?重组病毒的应用
[0097] 1、实时监测肠道病毒71型3CPM重组病毒感染哺乳细胞的过程
[0098] 将哺乳动物细胞（RD细胞或Vero细胞）在37°C 5%C02培养箱中培养24h，然后更 换为无血清的OPTI-MEM培养基并继续培养16h，以MOI=I的剂量接种肠道病毒71型并继续 培养lh，吸弃上清，用OPTI-MEM培养基洗两遍，加入浓度为0. 3 μ M的FlAsH-EDT2染料，从 加入染料开始，每隔30min在荧光显微镜下观察一次，持续观察6h。
[0099] 采用肠道病毒71型3CPM重组病毒接种时，Vero细胞的实时监测结果见图8 ('代 表min)，RD细胞的实时监测结果见图9 ('代表min)。结果表明，可以通过荧光实时监测 肠道病毒71型3CP?重组病毒感染哺乳动物细胞的过程。
[0100] 采用肠道病毒71型野生病毒接种时，Vero细胞和RD细胞均没有荧光显示。
[0101] 2、3CPM与CstF-64的共定位分析
[0102] 依次进行以下步骤：
[0103] (1)将Vero细胞接种于有孔的玻片，在37°C 5%C02培养箱中培养24h (铺满30%);
[0104] (2)将细胞用PBS缓冲液洗三次，加入无血清的OPTI-MEM培养基并继续培养16h ;
[0105] (3)以MOI=I的剂量接种肠道病毒71型，分别于接种病毒感染330min和390min 后取样；
[0106] (4)用0?11-1^1培养基洗两遍细胞，加入浓度为2.5以1的？148^0了2染料，室温 避光孵育30min。
[0107] (5)加入二倍体积的BAL洗液(购自英潍捷基公司，产品目录号T34561 )，洗细胞两 次，弃去洗液；
[0108] (6)加入无血清的OPTI-MEM培养基，在荧光显微镜下观察，并记下每个观察点的 坐标参数。
[0109] (7)观察完毕后，利用预冷的丙酮将玻片在-20°c固定过夜。
[0110] (8)取出玻片，向目标孔内滴加 I :100倍稀释的anti-CstF-64单抗（100μ 1/孔)， 并置于37°C湿盒中孵育lh。
[0111] (9)取出玻片，用PBS缓冲液震荡漂洗3次，每次5min，室温晾干。
[0112] (10)加入1:500倍稀释的Texas Red标记山羊抗鼠 IgG抗体（100 μ 1/孔)，置于 37°C湿盒中孵育30min。
[0113] (11)置于PBS缓冲液中振荡漂洗3次，每次漂洗lOmin。
[0114] (12)加入DAPI核染剂，室温孵育5min，然后用PBS缓冲液漂洗三遍。
[0115] (13)室温晚干后直于灭光显微镜下观察结果，记录结果后，将CCPGCC标签灭光成 像图像与免疫荧光成像图像、DAPI进行共定位处理。
[0116] 如图IOA所示，在采用肠道病毒71型3CPM重组病毒感染330min后，能够在细胞核 中同时检测到3C P?的绿色荧光信号与CstF-64的红色荧光信号，显示在感染后330min两 者均存在于在细胞核内。如图IOB所示，在采用肠道病毒71型3C P?重组病毒感染390min 后，细胞核内能够检测到3CPM的绿色荧光信号，但无法检测到CstF-64的红色荧光信号，显 示在感染后390min CstF-64被消化。
【权利要求】
1. 一种双链DNA分子，为将CCPGCC标签的编码基因插入肠道病毒71型的基因组DNA 的3C蛋白酶编码区中得到的DNA分子；所述CCPGCC标签为序列表的序列1所示的多肽片 段。
2. 如权利要求1所述的双链DNA分子，其特征在于：所述CCPGCC标签的编码基因如序 列表的序列2所示。
3. 如权利要求1或2所述的双链DNA分子，其特征在于：所述肠道病毒71型为 AH/08/06 株。
4. 如权利要求3所述的双链DNA分子，其特征在于：所述AH/08/06株的基因组DNA如 序列表的序列3所示。
5. 如权利要求4所述的双链DNA分子，其特征在于：所述双链DNA分子如序列表的序 列4所示。
6. 含有权利要求1至5中任一所述双链DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系或 重组菌。
7. -种肠道病毒71型的重组病毒，其特征在于：其基因组RNA的编码DNA如序列表的 序列4所示。
8. 如权利要求7所述的重组病毒，其特征在于：所述重组病毒的制备方法如下：将权利 要求1至5中任一所述双链DNA分子的RNA转录体感染哺乳动物细胞并培养，得到所述重 组病毒。
9. 一种监测肠道病毒71型感染哺乳细胞过程的方法，包括如下步骤： (1) 将权利要求7或8所述的重组病毒接种至哺乳动物细胞； (2) 加入FlAsH-EDT2染料，通过观察荧光信号检测肠道病毒71型感染哺乳细胞过程。
10. -种筛选在肠道病毒71型感染哺乳细胞过程与3(^°相互作用的宿主因子的方法， 依次包括如下步骤： (1) 将权利要求7或8所述的重组病毒接种至哺乳动物细胞； (2) 加入FlAsH-EDT2染料，并观察荧光信号； (3) 加入针对候选的宿主因子的单克隆抗体并孵育； (4) 加入针对所述单克隆抗体的酶标二抗，显色后观察荧光信号； (5) 将步骤（2)的荧光信号和步骤（4)的荧光信号进行共定位处理，从而确定待测宿主 因子是否为与3CP?结合的宿主因子。
【文档编号】G01N33/577GK104419712SQ201310363321
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月20日 优先权日:2013年8月20日
【发明者】秦成峰, 曹瑞源, 秦鄂德, 韩剑峰, 李晓峰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所