一种基于氨基酸的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判别方法
【专利摘要】本发明提供了一种对烟草代谢组学烟草鲜叶样本质量进行判别的方法。以烟草鲜叶中谷氨酸与谷氨酰胺含量的比值为指标，对代谢组学烟草鲜叶样本质量进行判别，为代谢组学合格样本的选择提供依据。本发明准确可靠，简单可行，可为烟草代谢特征分析及相关烟草代谢组学研究提供借鉴。
【专利说明】-种基于氨基酸的烟草代谢组学中新鲜烟叶样品质量的判 别方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析化学领域，是一种判别烟草代谢组学研究所用的烟草鲜叶样本质 量是否满足代谢组学研究需要的判别方法。
【背景技术】
[0002] 植物代谢组学是通过考察植物受刺激或扰动后其代谢产物的变化或其随时间的 变化，来研究植物体系的一种技术。在代谢组学轮廓分析的流程中，典型样本的采集是首要 并且及其重要的步骤，获得合格样本，W真实客观地反映样本的代谢状态，是代谢组学分析 进行的基础和前提。植物鲜叶样本的采集，需要在低温下浑灭W停止其生理活动W保证其 停止在采样时的代谢状态，标准做法为采摘植物样本后，锡纸包裹，置于-196C液氮冷冻， 用于烟草鲜叶分析或者冻干后用干粉样本分析。在样本采摘到分析前的该一段过程，需保 证烟草鲜叶在液氮中保存且在液氮条件下研磨，否则会造成鲜叶的酶促褐变。
[0003] 氨基酸是植物中重要的一类化合物，是构成蛋白质的结构单位，一些蛋白酶可调 节植物的物质代谢。多数氨基酸在植物代谢网络中是初生和次生代谢的枢纽，氨基酸代谢 是植物代谢的关键环节。氨基酸进一步代谢产物包括核酸，醋，多酷，叶绿素，生物碱等重要 物质。氨基酸的代谢作为氮代谢的起始部分，在协调碳氮代谢方面起重要作用，在烟草植株 生长代谢过程中，碳氮代谢的协调决定了烟叶的质量和品质。另外，在植物蛋白质营养质量 排序中，烟叶蛋白质居于首位。同一些主要作物如水稻、小麦、玉米、大豆蛋白质中必需氨基 酸相比，烟草蛋白中的必需氨基酸含量较高，均高于国际粮农组织（FA0)制定的蛋白制品 中必需氨基酸含量标准，其中酪氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和亮氨酸超过该标准的1倍左右。
[0004] 严重褐变的烟草鲜叶样本，其颜色会由鲜绿变为褐色，但酶促褐变反应轻微的样 本仅通过观察样本外观颜色深浅难W准确判别样本是否正常。本专利首次提出采用谷氨酸 与谷氨醜胺含量的比值鉴别烟草鲜叶的质量，为代谢组学研究的样本质量判别提供依据。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种对烟草代谢组学研究中的烟草鲜叶样本质量判别的方法。为了 实现本发明目的，本发明所述的一种对代谢组学研究中的烟草鲜叶样本质量进行判别的方 法，其利用烟草鲜叶中谷氨酸与谷氨醜胺含量的比值对代谢组学研究中的烟草鲜叶质量进 行判别。
[0006] 通过检测烟草鲜叶中谷氨酸与谷氨醜胺含量，计算其比值，对代谢组学研究中的 烟草鲜叶样本质量进行判别。
[0007] 将烟草鲜叶中加入含内标的提取溶剂，提取后离也过滤，采用6-氨基唾晰-N-玻 巧醜亚胺甲醋（AQC)衍生后，利用超高效液相色谱-单四级杆质谱（UPLC-SQDMS)进行分析， 通过标准曲线计算得出谷氨醜胺和谷氨酸的含量。
[0008] 所述内标为降额氨酸，其含量为5mg/L，所述提取溶剂为含己醇70%的水溶液；所 述烟草鲜叶与含内标的提取溶剂按质量/体积比加入量为=35:1-3。
[0009] 超高效液相色谱-单四级杆质谱（UPLC-SQDMS)的条件为；色谱柱Waters UPLC ClScolumn ;流动相A ;20mM甲酸馈，0. 5%甲酸，1%己膳，98. 5%水，流动相B ;1. 6%甲酸， 98. 4%己膳（v/v );流速；0. 35血/min ;柱温；55 °C ;进样体积；1 y L ;进样器温度；15 °C ; 洗脱梯度为；〇-l.〇8min，0. l〇/〇-〇.l〇/〇B;l. 08-11. 48min，0.1〇/〇-9. l〇/〇B;ll. 48-16. 3min, 9. 1%-21. 2%B ；16. 3-16. 9min, 21. 2%-59.6%B ；16. 9-18. Imin,59.6%-59. 6%B ； 18. 1-18. 28min，59. 6%-0. 1%B，18. 28-20min，0. l%-0. 1%B ;质谱方法；ESI 正离子模式下，分 段SIR扫描，毛细管电压；3KV，锥孔电压；30V，脱溶剂气温度；30(TC，锥孔温度；12(TC，脱 溶剂气流量；650L/h，锥孔气流量；5化A。
[0010] 所述烟草鲜叶是经-196C液氮罐保存运输，液氮冷冻研磨，冻干，-8(TC冰箱保存 待用。
[0011] W谷氨酸与谷氨醜胺含量的比值为指标，建立区分代谢组学正常样本、部分褐化 及褐化样本的标准，即待测样本中谷氨酸与谷氨醜胺比值在0. 67 W上的为合格样本，用于 烟草代谢组学分析；谷氨酸与谷氨醜胺比值在0. 12 W下的为变质的不合格样本，谷氨酸与 谷氨醜胺比值介于0. 12与0. 67之间为部分质变的不合格样本。
[0012] 本发明研究人员经过大量烟草鲜叶样本的分析研究，发现烟草鲜叶如果发生酶促 褐变等反应，其游离氨基酸的含量会发生较大变化，谷氨酸与谷氨醜胺含量的比值明显降 低，此类样本将不能用于代谢组学分析。因此W谷氨酸与谷氨醜胺含量的比值作为一个标 准对代谢组学研究中的烟草鲜叶样本质量进行判别。
[001引本发明的优点
[0014] 利用谷氨酸与谷氨醜胺含量的比值对代谢组学研究中的烟草鲜叶样本质量进行 判别，鉴别其是否满足代谢组学研究的需要，该方法简单可行，快捷高效。具体地说，本发明 W谷氨酸与谷氨醜胺含量的比值作为区分代谢组学合格样本、严重质变的不合格样本和部 分质变的不合格样本的标准。即待测样本中谷氨酸与谷氨醜胺比值在0.67 W上的为正常 样本，可用于代谢组学分析，谷氨酸与谷氨醜胺比值在0. 12 W下的为褐化变质的不合格样 本，谷氨酸与谷氨醜胺比值介于0. 12与0. 67之间为部分质变不合格样本，需要对样本来源 进行进一步核实。
【具体实施方式】
[0015] 下面通过实例进一步阐释本发明，实例仅限于说明本发明W便于理解，而非对本 发明的限定。
[0016] 1)由大田采摘的烟草鲜叶，于-196 C液氮罐保存运输，液氮冷冻研磨，低 温冻干，-8(TC冰箱保存待后续进行代谢组学分析。准确称取35mg烟草鲜叶，加入 2血70%〔2&地（含内标降额氨酸5mg/L)，摇床160巧m, 25 °C，比提取，3000巧m离也， 0. 22 y m过滤，采用柱前6-氨基唾晰-N-玻巧醜亚胺甲醋（AQC)(来自waters公司的 Waters AccQ-化g derivation kit衍生试剂盒）衍生，超高效液相色谱-单四级杆质谱 (UPLC-SQDMS)分析，通过标准曲线可W对烟草鲜叶中游离氨基酸进行准确，快速定量。
[0017] 采用6-氨基唾晰-N-玻巧醜亚胺甲醋（AQC)衍生的具体衍生步骤为；70yL P服.8的测酸盐缓冲液（来自waters公司的Waters AccQ-hg derivation kit衍生试剂 盒)，加入巧pendo计管(德国化pendcxrf公司）中，加入10 y L样品或者氨基酸混标溶液， 润旋5-10砂，再加入20 y L衍生试剂，润旋5-10砂，室温下放置Imin左右，于55C加热 lOmin。
[0018] 通过标准曲线定量步骤：配置 0. 025,0. 05,0. 1,0. 25,0. 5,1,2. 5,5,12. 5,25， 50mg/L共11个系列浓度的29种氨基酸的混标溶液，每个系列浓度均加入内标，得到含内标 降额氨酸5mg/L的29种氨基酸及胺的系列标准溶液。
[0019] 将不同浓度的标准溶液进行衍生后进样分析。各个氨基酸的标准曲线通过W其系 列浓度对应的峰面积/内标峰面为应变量，W系列浓度为自变量作图得到，即公式（1);
[0020] A1 / a X S二K1C1+B1****************************************************** Cl)
[0021] 其中；Ai -系列浓度氨基酸的峰面积，AIS -内标的峰面积；Ci -氨基酸系列浓 度，Ki -标准工作曲线的斜率；Bi -标准工作曲线的截距。得到标准曲线后，将样品中的峰 面积/内标峰面积代入公式，得到各个氨基酸的浓度。
[0022] 2)对所有样本进行游离氨基酸分析，色谱柱Waters UPLC ClScolumn (粒 径1. 7 y m，内径2. 1mm，柱长100mm);流动相A ;20mM甲酸馈，0. 5%甲酸，1%己膳， 98. 5%水，流动相B ;1. 6%甲酸，98. 4%己膳（v/v);流速；0. 35血/min ;柱温；55 °C ;进样 体积；ly L ;进样器温度；15°C ;洗脱梯度为；0-1.08min，0. 1%-0. 1%B ;1.08-11.48min， 0. P/o-9. P/oB ;11. 48-16. 3min，9. P/o-21. 2〇/〇B ;16. 3-16. 9min，21. 2〇/〇-59. 6〇/〇B ;16. 9-18. Imin， 59. 6%-59. 6%B ;18. 1-18. 28min，59. 6%-0. 1%B，18. 28-20min，0. l%-0. 1%B。质谱方法；ESI 正 离子模式下，分段SIR扫描，毛细管电压；3KV，锥孔电压；30V，脱溶剂气温度；30(TC，锥孔温 度；12(TC，脱溶剂气流量；650L/h，锥孔气流量；5化A。
[0023] 采用保留时间结合标样的质量数定性，内标法定量。在上述条件下可测得烟草鲜 叶中的29种游离氨基酸及胺等物质。
[0024] 本发明的技术路线是：
[0025] 采用样本为中国云南，贵州，河南H省的红花大金元，K326,中烟100 H个品种在 胚长期，现蕾期，盛花期，下部叶成熟期，中部叶成熟期5个生育期的烟草鲜叶及其他一些 省份主栽品种的中部叶成熟期烟草鲜叶材料，其中包括符合代谢组学样本要求的质量合格 样本，叶片严重质变的不合格样本W及部分质变的不合格的疑似样本。根据大批量样本建 立的合格样本与不合格样本的谷氨酸与谷氨醜胺比值的规律，判断样本的质量是否合格。
[0026] 本发明研究人员利用烟草鲜叶样本中谷氨酸与谷氨醜胺含量的比值和样本质量 的相关性，对代谢组学烟草鲜叶样本进行质量判别。本发明具有W下特点：操作简单快速， 结果准确可靠；样本用量少；方法适用于不同生育期、不同地点及品种的烟草鲜叶的判别。 本方法可为烟草代谢特征分析及相关烟草代谢组学研究提供借鉴。
[0027] 实施例1
[0028] 采用超高效液相色谱-单四级杆质谱（UPLC-SQDMS)方法测定成熟期烟草鲜叶样 本中的游离氨基酸含量，发现不合格的褐化样本中的大部分游离氨基酸含量显著变化，谷 氨酸与谷氨醜胺含量的比值明显降低。
[0029] 待测样本包括福建、贵州、湖南等7个省份、7个品种、15个产地，5个不同生育期的 212份烟草鲜叶样本。其中中部叶成熟时期的福建龙岩云烟87,贵州矜南的毕纳1号、湖南 张家界的K326等烟草鲜叶样本及云南大理现蕾期中烟100及下部叶成熟期红大，贵州遵义 盛花期红大样本因液氮不足等原因已完全褐化，河南许昌的鲜叶样本部分质变，其他样本 保存完好。
[0030] 样本分析步骤如下所述：
[0031] 1，烟草鲜叶样本采集：
[003引烟草鲜叶样本在不同产地大田种植，到达一定生育期后采样，-196C液氮保存，运 输，液氮条件下研磨，低温冻干，-8(TC冰箱储存。
[0033] 2,游离氨基酸测定方法：
[0034] 烟草鲜叶样本从-8(TC冰箱中取出，4 C冰箱过夜放置后，室温下放置1小时。准确 称取35mg烟草鲜叶样本，加入2mL70%C2H日0H(含内标降额氨酸5mg/L)，摇床16化pm, 25°C， Ih提取，300化pm离也，0. 22 y m过滤后，采用柱前6-氨基唾晰-N-玻巧醜亚胺甲醋（AQC)衍 生，具体衍生步骤为；7〇y L P服.8的测酸盐缓冲液(来自waters公司的Waters AccQ-化g derivation kit衍生试剂盒)，加入eppendorf管(德国E：ppendorf公司）中，加入10 y L样品 或者氨基酸混标溶液，润旋5-10砂，再加入20 y L衍生试剂，润旋5-10砂，室温下放置Imin 左右，于55 °C加热lOmin。衍生完成后，利用超高效液相色谱-单四级杆质谱（UPLC-SQDMS ) 进行分析，通过标准曲线对烟草新鲜烟叶中氨基酸进行定量。
[0035] 3)对所有样本进行游离氨基酸分析，色谱柱Waters UPLC ClScolumn(粒 径1. 7 y m，内径2. 1mm，柱长100mm);流动相A ;20mM甲酸馈，0. 5%甲酸，1%己膳， 98. 5%水，流动相B ;1. 6%甲酸，98. 4%己膳（v/v);流速；0. 35血/min ;柱温；55 °C ;进样 体积；ly L ;进样器温度；15°C ;洗脱梯度为；0-1.08min，0. 1%-0. 1%B ;1.08-11.48min， 0. P/o-9. P/oB ;11. 48-16. 3min，9. P/o-21. 2〇/〇B ;16. 3-16. 9min，21. 2〇/〇-59. 6〇/〇B ;16. 9-18. Imin， 59. 6%-59. 6%B ;18. 1-18. 28min，59. 6%-0. 1%B，18. 28-20min，0. l%-0. 1%B。质谱方法；ESI 正 离子模式下，分段SIR扫描，毛细管电压；3KV，锥孔电压；30V，脱溶剂气温度；30(TC，锥孔温 度；12(TC，脱溶剂气流量；650L/h，锥孔气流量；5化A。
[0036] 该分析条件下获得了上述212份烟草鲜叶中29种游离氨基酸及胺的绝对含量，发 现谷氨酸与谷氨醜胺含量的比值变化显著，见表1。
[0037] 表1实施例1所用的实验材料信息及谷氨酸与谷氨醜胺含量的比值
[0038]
【权利要求】
1. 一种对代谢组学研究中的烟草鲜叶样本质量进行判别的方法，其特征在于：通过检 测烟草鲜叶中谷氨酸与谷氨酰胺含量，计算其比值，对代谢组学研究中的烟草鲜叶样本质 量进行判别。
2. 根据权利要求1所述判别方法，其特征在于：其具体方法为：将烟草鲜叶中加入含内 标的提取溶剂，提取后离心过滤，采用6-氨基喹啉-N-琥珀酰亚胺甲酯（AQC)衍生后，利用 超高效液相色谱-单四级杆质谱（UPLC-SQDMS)进行分析，通过标准曲线计算得出谷氨酰胺 和谷氨酸的含量。
3. 根据权利要求2所述判别方法，其特征在于：所述内标为降缬氨酸，其含量为5mg/L， 所述提取溶剂为含乙醇70%的水溶液；所述烟草鲜叶与含内标的提取溶剂按质量/体积比 加入量为=35:1-3。
4. 根据权利要求1所述判别方法，其特征在于：超高效液相色谱-单四级杆质谱 (UPLC-SQDMS)的条件为：色谱柱 Waters UPLC C18column;流动相 A :20mM 甲酸铵，0.5% 甲酸，1%乙腈，98. 5%水，流动相B :1. 6%甲酸，98. 4%乙腈（v/v);流速：0. 35mL/min ;柱 温：55°C ;进样体积：luL ;进样器温度：15°C ;洗脱梯度为：0-1.08min，0. l%-0. 1%B ; 1. 08-11. 48min，0. l%-9. 1%B ;11. 48-16. 3min，9. 1%-21. 2%B ;16. 3-16. 9min，21. 2%-59. 6%B ; 16. 9-18. lmin，59. 6%-59. 6%B ; 18.1-18.28min，59.6%-0. 1%B，18. 28-20min，0. l%-0. 1%B ; 质谱方法：ESI正离子模式下，分段SIR扫描，毛细管电压：3KV，锥孔电压：30V，脱溶剂气温 度：300°C，锥孔温度：120°C，脱溶剂气流量：650L/h，锥孔气流量：50L/h。
5. 根据权利要求1所述判别方法，其特征在于：所述烟草鲜叶是经_196°C液氮罐保存 运输，液氮冷冻研磨，冻干，-80°C冰箱保存待用。
6. 根据权利要求1所述判别方法，其特征在于：以谷氨酸与谷氨酰胺含量的比值为指 标，建立区分代谢组学正常样本、部分褐化及褐化样本的标准，即待测样本中谷氨酸与谷氨 酰胺比值在0.67以上的为合格样本，用于烟草代谢组学分析；谷氨酸与谷氨酰胺比值在 〇. 12以下的为变质的不合格样本，谷氨酸与谷氨酰胺比值介于0. 12与0.67之间为部分质 变的不合格样本。
【文档编号】G01N30/02GK104422741SQ201310401114
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】许国旺, 张俊杰, 路鑫, 赵春霞, 常玉玮, 赵燕妮, 沈丹红 申请人:中国科学院大连化学物理研究所