一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法
【专利摘要】本发明涉及一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法。本发明所述的方法是将叶下珠提取物与乙肝病毒阳性血清温育后的溶液进行毛细管电泳分离，通过比较不同温育时间所得的电泳峰面积，从而筛选叶下珠提取物中抗乙肝病毒的活性成分。本发明所述的方法具有简单、快速、直观、高分离效率的特点，不仅可应用于体外筛选单个化合物抗乙肝病毒活性，而且可以应用于体外评价多个化合物之间有无协同抗乙肝病毒活性，因而在中草药抗乙型肝炎病毒和抗癌活性成分的快速筛选中有潜在的应用前景。
【专利说明】一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物筛选领域，具体涉及一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法。
【背景技术】
[0002]中草药体外抗乙肝病毒筛选的方法主要有(I)利用中草药直接作用病人血清抑制HBV标志物；(2)以噬肝DNA病毒感染动物模型评价中草药抗HBV的活性；(3)利用H印G2.2.15细胞株筛选抗HBV的药物。利用中草药直接作用病人血清抑制HBV标志物的方法存在血清中的抗原无体外增殖特性，应用较少。以噬肝DNA病毒感染动物模型存在实验周期长、费用高、适宜给药周期短和存在自然转阴等问题。而IfepG2.2.15细胞株因能长期、稳定地向培养上清液中分泌HBsAg，HBeAg和HBV颗粒及对人有感染性，因此广泛用于筛选和评价抗HBV药物。
[0003]邵立军等人(邵立军，王建农，中药苎麻根抗乙肝病毒活性及其化学成分研究，中国中医研究院，硕士学位论文，2010)首先采用国际上通用的H印G2.2.15细胞系乙肝病毒细胞模型，对苎麻根5个分离部位(苎麻根水洗脱部位、苎麻根40%乙醇洗脱部位、苎麻根70%乙醇洗脱部位、苎麻根水不溶部位和苎麻根总提取物)进行了活性筛选实验，结合酶联免疫法检测细胞上清中乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)的分泌量，实时PCR的方法检测细胞中乙肝病毒DNA (HBV-DNA),分别计算对病毒半数抑制浓度IC50及选择指数SI。实验结果表明，苎麻根水洗脱部位、苎麻根水不溶部位、苎麻根40%乙醇洗脱部位三个供试品抑制HBV-DNA复制的SI均大于2，分别为2.5、7.2、10.6，为有效低毒。其次，对苎麻根药材乙醇提取物的化学成分进行了研究，应用现代色谱技术，采用多种分离方法，从中分离得到了 29个化合物，并利用理化性质和现代波谱学方法鉴定了其中23个化合物，分别是7个三萜类化合物，I个芪类化合物，4个蒽醌类化合物，2个黄酮类化合物，3个留醇类化合物，2个酚类化合物，2个倍半萜类化合物，I个有机酸类化合物和I个无机化合物。但是，该方法存在实验周期长、费用高，且没有对分离出的化合物进行抗乙肝病毒活性成份选筛，无法确定哪一种化学成分是抗乙肝病毒(HBV)活性成份。
[0004]陈夏静(陈夏静，张秀桥，大叶蛇葡萄抗乙肝病毒活性物质及含量分析研究，湖北中医药大学，硕士学位论文，2010)采用H印G2.2.15细胞模型进行的体外抗乙肝病毒筛选，结果表明，石油醚萃取物质部位和乙酸乙酯萃取物质部位为大叶蛇葡萄抗乙肝病毒的主要有效物质部位。采用现代色谱分离技术从大叶蛇葡萄的主要有效部位一石油醚萃取物质部位中分离和鉴定了 4种化合物，分别为大黄酹(ChrysophanoI)、大黄素甲醚(Physcion)、杨梅素(Myrice -tin)、β -谷甾醇(β-sitosterol)。对分离得到的化合物大黄酹和杨梅素及从乙酸乙酯萃取物质部位分离到的蛇葡萄素、杨梅苷、槲皮素和槲皮苷等化合物进行体外抗乙肝病毒筛选。研究结果表明，蛇葡萄素和杨梅素对HBsAg和HBeAg均有显著的抑制作用。刘群红等(刘群红，蔡霞，李朝品，蛞蝓多糖体外抗乙型肝炎病毒作用研究，中国实验方剂学杂志，2009，25 (5):58-60)采用H印G2.2.15细胞模型对水提醇沉法提取得到的蛞蝓多糖进行体外抗乙肝病毒筛选，结果表明其对HBsAg和HBeAg有抑制作用。但是，以上方法均存在实验周期长、费用高、效率低的缺陷。
[0005]仲英等(仲英，左春旭，李风琴，等.叶下珠化学成分及其抗乙肝病毒活性的研究.中国中药杂志，1998，23 (6):336-335)对大戟科叶下珠属植物叶下珠的干燥全草进行了化学成分及其抗乙肝病毒活性的研究，共分离得11个化合物，其中I号有效部位提取分离易得，收率高，且化学性质稳定，6号为去氢诃子次酸甲酯。用叶下珠I号，6号对HBsAg阳性血清直接进行作用，发现叶下珠组I号，6号能直接抑制HBsAg。Wanxing Wei等(Wanxing Wei, Xiangrong Li, Kuiwu Wang, Zuowen Zheng and 分钟 Zhou.Lignanswith Ant1-Hepatitis B Virus Activities from Phyllanthus niruri L..PhytotherapyResearch, 2012, 26 (7): 964 - 968)对一个新木脂素,珠子草次素乙,连同其已知的从叶下珠分离得到的立体异构体珠子草次素和珠子草次素甲进行了抗乙型肝炎病毒活性的研究。结果表明珠子草次素和珠子草次素甲、乙有抑制乙型肝炎病毒抗原的效果，且呈剂量相关性。陈压西等(陈压西，郭树华，齐珍元，等，叶下珠有效部位抗鸭乙型肝炎病毒及体外抗HBV活性的研究，中药药理与临床，1999，15 (6):16- 18)将叶下珠有效部位用双蒸水配成10 μ g/ml水溶液，用RPMI 1640培养基稀释成30、50、70、100 μ g/ml浓度，采用H印G2.2.15细胞模型进行体外抗乙肝病毒筛选。结果表明，叶下 珠在浓度为70和100 μ g/ml作用5天和10天时，对H印G2.2.15细胞培养上清液中的HBeAg和HBV-DNA。彭立生等(彭立生，贺劲松，童光东，等，叶下珠提取物抗乙肝病毒及乙肝病毒X基因的研究，中西医结合肝病杂志，2006，16 (6):340-344)采用 H印G2.2.15 细胞并建立 H印G2X、!fepG2X-HIV-l-LTR-1uciferase细胞系，用不同浓度的叶下珠药液进行细胞培养试验。结果显示，叶下珠水提物对H印G 2.2.15细胞的HBV DNA有一定的抑制作用(P〈 01 01)。但是，以上方法操作繁琐、周期长、费用高，且难以确定抗乙肝病毒(HBV)活性成份。
【发明内容】
[0006]针对现有叶下珠提取物体外抗乙肝病毒活性成分筛选方法的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，该方法能简单、快速、高效、直观地通过将叶下珠提取物与HBsAg/HBeAg阳性血清进行相互作用，采用毛细管电泳进行分离和评价。
[0007]本发明所述的一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，包括以下步骤:
A)称取从叶下珠提取物中分离得到的酚酸类化合物，加入HBsAg或HBeAg阳性血清，混合，酚酸化合物的质量与HBsAg或HBeAg阳性血清的体积比为5: f 10:1，用水定容后，将混合溶液于37 °C培养箱内温育不同的时间，然后用滤膜过滤；
B)依次用0.1?1.0 moL/L氢氧化钠、重蒸水、运行缓冲液冲洗毛细管2?5分钟,然后在一 15?一 25 kV的分离电压条件下，进行毛细管平衡处理10?20分钟；
C)采用反向检测方式，以pH5?10的10?50 mmol/L硼砂缓冲液为运行缓冲液，检测波长为200?250 nm，分离电压为一 15?一 25 kV，运行温度为15?30°C，进样压力为0.5 psi (I psi=6894.76 Pa),进样时间5?10秒,分别对步骤A的混合液进行电泳分离； D)通过比较步骤A的混合液在不同温育时间所得的电泳峰面积，筛选叶下珠提取物中抗乙肝病毒的活性成分。
[0008]根据本发明所述的毛细管电泳方法的进一步特征，所述步骤A中，所述酚酸类化合物为I?5 mg,所述HBsAg或HBeAg阳性血清为0.1?0.5 mL。
[0009]本发明所述的另一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:
A)称取叶下珠全草粉末，加入水，在90?110°C下提取0.5?2小时，得到叶下珠生药的质量浓度为40?70 g/L的溶液；取此溶液与HBsAg/HBeAg阳性血清混合，其中叶下珠提取物的质量与HBsAg或HBeAg阳性血清的体积比为100:1?300:1，将混合溶液放入37°C培养箱内温育不同的时间，然后用滤膜过滤；
B)依次用0.1?1.0 moL/L氢氧化钠、重蒸水、运行缓冲液冲洗毛细管2?5分钟,然后在一 15?一 25 kV的分离电压条件下，进行毛细管平衡处理10?20分钟；
C)采用反向检测方式，以pH5?10的10?50 mmol/L硼砂缓冲液为运行缓冲液，检测波长为200?250 nm，分离电压为一 15?一 25 kV，运行温度为15?30°C，进样压力为0.5 psi (I psi=6894.76 Pa),进样时间5?10秒,分别对步骤A的混合液进行电泳分离；
D)通过比较步骤A的混合液在不同温育时间所得的电泳峰面积，筛选叶下珠提取物中抗乙肝病毒的活性成分。
[0010]根据本发明所述的毛细管电泳方法的进一步特征，所述步骤A中，称取5?10 g叶下珠全草粉末，加入100?200 mL水，提取得到叶下珠生药溶液；然后取此溶液0.5?2mL与0.1?0.5 mL HBsAg/HBeAg阳性血清混合。
[0011]根据本发明所述的毛细管电泳方法的进一步特征，所述步骤A中，所述滤膜的孔径为0.2?0.4 μ m。
[0012]根据本发明所述的毛细管电泳方法的进一步特征，所述步骤C中，所述运行缓冲液还包括:浓度为0.1?200 mmol/L的阳离子表面活性剂，0.2?1.0 g聚乙二醇，5?20mM K2SO4 (pH 7.0 ?9.0)。
[0013]根据本发明所述的毛细管电泳方法的进一步特征，所述阳离子表面活性剂是选自:四丁基氢氧化铵、十二烷基苄基二甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或十八烷基三甲基氯化铵。
[0014]根据本发明所述的毛细管电泳方法的进一步特征，所述步骤D中，如果叶下珠提取物与HBsAg/HBeAg作用后，随着作用时间的增加，其电泳峰面积未发生变化，说明其对HBsAg/HBeA没有抑制作用，不是抗HBsAg/HbeA的活性成分。
[0015]根据本发明所述的毛细管电泳方法的进一步特征，所述步骤D中，如果叶下珠提取物与HBsAg/HBeAg作用后，随着作用时间的增加，其电泳峰面积不断减小，说明其对HBsAg/HBeAg有抑制作用，是抗HBsAg/HbeA的活性成分。
[0016]根据本发明所述的毛细管电泳方法的进一步特征，如果电泳峰面积减小50%以上，判断为对HBsAg/HBeAg有强的抑制作用。
[0017]本发明建立了一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，将叶下珠提取物与HBsAg/HBeAg阳性血清温育后的溶液进行毛细管电泳分离，通过比较不同温育时间所得的电泳峰面积，从而筛选叶下珠提取物中抗乙肝病毒的活性成分。因此，本发明所述的方法具有简单、快速、直观、高分离效率的特点，不仅可应用于体外筛选单个化合物抗乙肝病毒HBsAg/HBeAg活性，而且可以应用于体外评价多个化合物之间有无协同抗乙肝病毒HBsAg/HBeAg活性，因而在中草药抗乙型肝炎病毒和抗癌活性成分的快速筛选中有潜在的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是没食子酸(GA)与HBsAg温育不同时间后溶液的电泳图。
[0019]图2是没食子酸(GA)与HBeAg温育不同时间后溶液的电泳图。
[0020]图3是丁二酸(SA)、原二茶酸(PA)、没食子酸(GA)、咖啡酸(CA)、阿魏酸(FA)混合物与HBsAg温育不同时间后溶液的电泳图。
[0021]图4是丁二酸(SA)、原二茶酸(PA)、没食子酸(GA)、咖啡酸(CA)、阿魏酸(FA)混合物与HBeAg温育不同时间后溶液的电泳图。
[0022]图5是广东肇庆地区产的叶下珠水提液与HBsAg温育不同时间后溶液的电泳图。
[0023]图6是广东肇庆地区产的叶下珠水提液与HBeAg温育不同时间后溶液的电泳图。
[0024]图7是广西地区产叶下珠水提液与HBsAg温育不同时间后溶液的电泳图。
[0025]图8是广西地区产叶下珠水提液与HBeAg温育不同时间后溶液的电泳图。
【具体实施方式】
[0026]下面将结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不限制于这些实施例。其它任何未违背本发明的原理所作的改变、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围内。
[0027]实施例1
一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，是通过以下步骤实现:
A)称取从叶下珠提取物中分离得到的没食子酸(GA) I mg，加入0.1 mL HBsAg阳性血清，混合，用水定容至10 mL。混合溶液于37 °C培养箱内分别温育0，1，2，4，8小时，温育后的混合液过0.2 μ m滤膜。
[0028]B)毛细管依次用0.1 moL/L氢氧化钠、重蒸水、缓冲液冲洗2分钟，然后在一 15 kV分离电压下，进行毛细管平衡处理10分钟。
[0029]C)采用反向检测法,在25 mmol/L硼砂缓冲液中，加入0.1 mmol/L十六烧基三甲基溴化铵(CTAB)、0.2 g聚乙二醇、5 mmol/L K2SO4 (pH 7.0)作为运行缓冲液，检测波长为200 nm，分离电压为一15 kV，运行温度为15°C，进样压力为0.5 psi (I psi=6894.76 Pa)，进样时间5秒，分别对A)步骤的混合液进行电泳分离，电泳图见图1。GA的电泳峰经加标和紫外光谱确认。
[0030]D)结果如图1所示，GA与HBsAg作用后，随着作用时间的增加，GA的峰面积逐渐减小，说明GA对HBsAg有抑制作用，抑制效果与作用时间正相关。当作用时间达4小时时，GA峰面积急剧减小，说明此时GA对HBsAg有很强的抑制作用，是抑制HBsAg的活性成分。
[0031]实施例2
一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，是通过以下步骤实现:
A)称取从叶下珠提取物中分离得到的没食子酸(GA) I mg，加入0.1 mL HBeAg阳性血清，混合，用水定容至10 mL。混合溶液于37 °C培养箱内分别温育0，1，2，4，8小时，温育后的混合液过0.2 μ m滤膜。
[0032]B)毛细管依次用0.1 moL/L氢氧化钠、重蒸水、缓冲液冲洗2分钟，然后在一 15 kV分离电压下，进行毛细管平衡处理10分钟。
[0033]C)采用反向检测法，在25 mmol/L硼砂缓冲液中，加入0.1 mmol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0.2 g聚乙二醇、5 mmol/L K2SO4 (pH 7.0)作为运行缓冲液，检测波长为200 nm，分离电压为一15 kV，运行温度为15°C，进样压力为0.5 psi (I psi=6894.76 Pa)，进样时间5秒，分别对A)步骤的混合液进行电泳分离，电泳图见图1。GA的电泳峰经加标和紫外光谱确认。
[0034]D)结果如图2所示，GA与HBeAg作用后，随着作用时间的增加，GA的峰面积逐渐减小，说明GA对HBeAg有抑制作用，抑制效果与作用时间正相关。当作用时间达4小时时，GA峰面积急剧减小，说明此时GA对HBeAg有很强的抑制作用，是抑制HBeAg的活性成分。
[0035]实施例3
一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，是通过以下步骤实现:
A)分别称取从叶下珠提取物中分离得到的丁二酸(SA)、原二茶酸(PA)、没食子酸(GA)、咖啡酸(CA)、阿魏酸(FA)各I mg，混合，然后加入0.5 mL HBsAg阳性血清，用水定容至10 mL。混合溶液于37 °C培养箱内分别温育0、1、2、4、8小时，温育后的混合液过0.3 μπι滤膜。
[0036]B)毛细管依次用0.5 moL/L氢氧化钠、重蒸水、缓冲液冲洗3分钟，然后在一 20 kV分离电压下，进行毛细管平衡处理15分钟。
[0037]C)采用反向检测,在25 mmol/L硼砂缓冲液中，加入0.3 mmol/L十六烧基三甲基溴化铵(CTAB)、0.4 g聚乙二醇、10 mmol/L K2SO4 (pH 8.0)作为运行缓冲液，检测波长为210 nm，分离电压为一20 kV，运行温度为25°C，进样压力为0.5 psi (I psi=6894.76 Pa)，进样时间8秒，分别对A)步骤的混合液进行电泳分离，电泳图见图3。SA、PA、GA、CA、FA的电泳峰经加标和紫外光谱确认。
[0038]D)结果如图3所示，SA、PA、CA、FA与乙肝病毒HBsAg作用后，随作用时间增加，其对应的峰面积或峰高均没有发生变化，说明这四种酸不是抑制HBsAg的活性成分。而GA与乙肝病毒HBsAg作用后，随着作用时间的增加，GA的峰面积逐渐减小，说明GA对HBsAg有抑制作用，抑制效果与作用时间正相关；作用4?8小时内，对应的GA峰面积或峰高急剧减小，说明此时GA对乙肝病毒HBsAg有很强的抑制作用，是抗HBsAg的活性成分，但SA、PA、CA、FA对乙肝病毒HBsAg无协同抑制作用。
[0039]实施例4
一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，是通过以下步骤实现:
A)分别称取从叶下珠提取物中分离得到的丁二酸(SA)、原二茶酸(PA)、没食子酸(GA)、咖啡酸(CA)、阿魏酸(FA)各I mg，混合，然后加入0.5 mL HBeAg阳性血清，用水定容至10 mL。混合溶液于37 °C培养箱内分别温育0、1、2、4、8小时，温育后的混合液过0.3 μπι滤膜。
[0040]B)毛细管依次用0.5 moL/L氢氧化钠、重蒸水、缓冲液冲洗3分钟,然后在一 20 kV分离电压下，进行毛细管平衡处理15分钟。
[0041]C)采用反向检测,在25 mmol/L硼砂缓冲液中，加入0.3 mmol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0.4 g聚乙二醇、10 mmol/L K2SO4 (pH 8.0)作为运行缓冲液，检测波长为210 nm，分离电压为一20 kV，运行温度为25°C，进样压力为0.5 psi (I psi=6894.76 Pa)，进样时间8秒，分别对A)步骤的混合液进行电泳分离，电泳图见图3。SA、PA、GA、CA、FA的电泳峰经加标和紫外光谱确认。
[0042]D)结果如图4所示，SA、PA、CA、FA与乙肝病毒HBeAg作用后，随作用时间增加，其对应的峰面积或峰高均没有发生变化，说明这四种酸不是抑制HBeAg的活性成分。而GA与乙肝病毒HBeAg作用后，随着作用时间的增加，GA的峰面积逐渐减小，说明GA对HBeAg有抑制作用，抑制效果与作用时间正相关；作用4-8小时内，对应的GA峰面积或峰高急剧减小，说明此时GA对乙肝病毒HBeAg有强的抑制作用，是抗HBeAg的活性成分，但SA、PA、CA、FA对乙肝病毒HBeAg无协同抑制作用。
[0043]实施例5
一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，是通过以下步骤实现:
A)称取5 g广东肇庆地区产的叶下珠粉末，加入100 17欠，在1001:下提取1小时。取此溶液0.5 mL与0.1 mL HBsAg阳性血清，混合，放入37 °C培养箱内分别温育0、4小时，温育后的混合液过0.2 μ m滤膜。
[0044]B)毛细管依次用0.8 moL/L氢氧化钠、重蒸水、缓冲液冲洗5分钟,然后在一 25 kV分离电压下，进行毛细管平衡处理10分钟。
[0045]C)采用反向检测,在25 mmol/L硼砂缓冲液中，加入100 mmol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0.8 g聚乙二醇、15 mmol/L K2SO4 (pH 7.0)作为运行缓冲液，检测波长为230 nm，分离电压为一22 kV，运行温度为25°C，进样压力为0.5 psi (I psi=6894.76 Pa)，进样时间10秒，分别对A)步骤的混合液进行电泳分离，电泳图见图3，GA的色谱峰经加标和紫外光谱图确认。
[0046]D)结果如图5所示，广东肇庆地区产叶下珠的水提取物与乙肝病毒HBsAg作用4小时后，GA的峰面积显著减小，说明叶下珠水提取物中GA对乙肝病毒HBsAg有强的抑制作用，是抑制乙肝病毒HBsAg的活性成分。
[0047]实施例6
一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，是通过以下步骤实现:
A)称取5 g广东肇庆地区产的叶下珠粉末，加入100 17欠，在1001:下提取1小时。取此溶液0.5 mL与0.1 mL HBeAg阳性血清，混合，放入37 °C培养箱内分别温育0、4小时，温育后的混合液过0.2 μ m滤膜。
[0048]B)毛细管依次用0.8 moL/L氢氧化钠、重蒸水、缓冲液冲洗5分钟,然后在一 25 kV分离电压下，进行毛细管平衡处理10分钟。[0049]C)采用反向检测，在25 mmol/L硼砂缓冲液中，加入100 mmol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0.8 g聚乙二醇、15 mmol/L K2SO4 (pH 7.0)作为运行缓冲液，检测波长为230 nm，分离电压为一22 kV，运行温度为25°C，进样压力为0.5 psi (I psi=6894.76 Pa)，进样时间10秒，分别对A)步骤的混合液进行电泳分离，电泳图见图3，GA的色谱峰经加标和紫外光谱图确认。
[0050]D)结果如图6所示，广东肇庆地区产叶下珠的水提取物与乙肝病毒HBeAg作用4小时后，GA的峰面积显著减小，说明叶下珠水提取物中GA对乙肝病毒HBeAg有强的抑制作用，是抑制乙肝病毒HBeAg的活性成分。
[0051]实施例7
一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，是通过以下步骤实现:
A)称取10 g广西南宁地区产的叶下珠粉末，加入200 mL水，在100°C下提取I小时。取此溶液2 mL与0.5 mL HBsAg阳性血清，混合，放入37 °C培养箱内分别温育0、4小时，温育后的混合液过0.4 μ m滤膜。
[0052]B)毛细管依次用1.0 moL/L氢氧化钠、重蒸水、缓冲液冲洗5分钟,然后在一 25 kV分离电压下，进行毛细管平衡处理20分钟。
[0053]C)采用反向检测，在25 mmol/L硼砂缓冲液中，加入200 mmol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、1.0 g聚乙二醇、20 mmol/L K2SO4 (pH 9.0)作为运行缓冲液，检测波长为250 nm，分离电压为一25 kV，运行温度为30°C，进样压力为0.5 psi (I psi=6894.76 Pa)，进样时间10秒，分别对A)步骤的混合液进行电泳分离，电泳图见图4，GA的色谱峰经加标和紫外光谱图确认。
[0054]D)结果如图7所示，广西南宁地区产的叶下珠水提取物与乙肝病毒HBsAg作用4小时后，GA的峰面积显著减小，说明叶下珠水提取物中GA对乙肝病毒HBsAg有强的抑制作用，是抑制乙肝病毒HBsAg的活性成分。
[0055]实施例8
一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，是通过以下步骤实现:
A)称取10 g广西南宁地区产的叶下珠粉末，加入200 mL水，在100°C下提取I小时。取此溶液2 mL与0.5 mL HBeAg阳性血清，混合，放入37 °C培养箱内分别温育0、4小时，温育后的混合液过0.4 μ m滤膜。
[0056]B)毛细管依次用1.0 moL/L氢氧化钠、重蒸水、缓冲液冲洗5分钟,然后在一 25 kV分离电压下，进行毛细管平衡处理20分钟。
[0057]C)采用反向检测,在25 mmol/L硼砂缓冲液中，加入200 mmol/L十六烧基三甲基溴化铵(CTAB)、1.0 g聚乙二醇、20 mmol/L K2SO4 (pH 9.0)作为运行缓冲液，检测波长为250 nm，分离电压为一25 kV，运行温度为30°C，进样压力为0.5 psi (I psi=6894.76 Pa)，进样时间10秒，分别对A)步骤的混合液进行电泳分离，电泳图见图4，GA的色谱峰经加标和紫外光谱图确认。
[0058]D)结果如图8所示，广西南宁地区产的叶下珠水提取物与乙肝病毒HBeAg作用4小时后，GA的峰面积显著减小，说明叶下珠水提取物中GA对乙肝病毒HBeAg有强的抑制作用，是抑制乙肝病毒HBeAg的活性成分。
[0059]在上述实施例1至8中，步骤C所采用的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)是阳离子表面活性剂，也可采用四丁基氢氧化铵、十二烷基苄基二甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵等常见的阳离子表面活性剂来替代。
【权利要求】
1.一种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: A)称取从叶下珠提取物中分离得到的酚酸类化合物，加入HBsAg或HBeAg阳性血清，混合，酚酸化合物的质量与HBsAg或HBeAg阳性血清的体积比为5: f 10:1，用水定容后，将混合溶液于37 °C培养箱内温育不同的时间，然后用滤膜过滤； B)依次用0.1?1.0 moL/L氢氧化钠、重蒸水、运行缓冲液冲洗毛细管2?5分钟,然后在一 15?一 25 kV的分离电压条件下，进行毛细管平衡处理10?20分钟； C)采用反向检测方式，以pH5?10的10?50 mmol/L硼砂缓冲液为运行缓冲液，检测波长为200?250 nm，分离电压为一 15?一 25 kV，运行温度为15?30°C，进样压力为0.5 psi (I psi=6894.76 Pa),进样时间5?10秒,分别对步骤A的混合液进行电泳分离； D)通过比较步骤A的混合液在不同温育时间所得的电泳峰面积，筛选叶下珠提取物中抗乙肝病毒的活性成分。
2.根据权利要求1所述的毛细管电泳方法，其特征在于:所述步骤A中，所述酚酸类化合物为I?5 mg,所述HBsAg或HBeAg阳性血清为0.1?0.5 mL。
3.—种体外筛选叶下珠提取物抗乙肝病毒活性成分的毛细管电泳方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: A)称取叶下珠全草粉末，加入水，在90?110°C下提取0.5?2小时，得到叶下珠生药的质量浓度为40?70 g/L的溶液；取此溶液与HBsAg/HBeAg阳性血清混合，其中叶下珠提取物的质量与HBsAg或HBeAg阳性血清的体积比为100:1?300:1，将混合溶液放入37°C培养箱内温育不同的时间，然后用滤膜过滤； B)依次用0.1?1.0 moL/L氢氧化`钠、重蒸水、运行缓冲液冲洗毛细管2?5分钟,然后在一 15?一 25 kV的分离电压条件下，进行毛细管平衡处理10?20分钟； C)采用反向检测方式，以pH5?10的10?50 mmol/L硼砂缓冲液为运行缓冲液，检测波长为200?250 nm，分离电压为一 15?一 25 kV，运行温度为15?30°C，进样压力为0.5 psi (I psi=6894.76 Pa),进样时间5?10秒,分别对步骤A的混合液进行电泳分离； D)通过比较步骤A的混合液在不同温育时间所得的电泳峰面积，筛选叶下珠提取物中抗乙肝病毒的活性成分。
4.根据权利要求3所述的毛细管电泳方法，其特征在于:所述步骤A中，称取5?10g叶下珠全草粉末，加入100?200 mL水，提取得到叶下珠生药溶液；然后取此溶液0.5?2mL与0.1?0.5 mL HBsAg/HBeAg阳性血清混合。
5.根据权利要求1或3所述的毛细管电泳方法，其特征在于:所述步骤A中，所述滤膜的孔径为0.2?0.4 μπι。
6.根据权利要求1或3所述的毛细管电泳方法，其特征在于:所述步骤C中，所述运行缓冲液还包括:浓度为0.1?200 mmol/L的阳离子表面活性剂，0.2?1.0 g聚乙二醇，5?20 mM K2SO4 (pH 7.0 ?9.0)。
7.根据权利要求6所述的毛细管电泳方法，其特征在于:所述阳离子表面活性剂是选自:四丁基氢氧化铵、十二烷基苄基二甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵或十八烷基三甲基氯化铵。
8.根据权利要求1或3所述的毛细管电泳方法，其特征在于:所述步骤D中，如果叶下珠提取物与HBsAg/HBeAg作用后，随着作用时间的增加，其电泳峰面积未发生变化，说明其对HBsAg/HBeA没有抑制作用，不是抗HBsAg/HbeA的活性成分。
9.根据权利要求1或3所述的毛细管电泳方法，其特征在于:所述步骤D中，如果叶下珠提取物与HBsAg/HBeAg作用后，随着作用时间的增加，其电泳峰面积不断减小，说明其对HBsAg/HBeAg有抑制作用，是抗HBsAg/HbeA的活性成分。
10.根据权利要求9所述的毛细管电泳方法，其特征在于:如果电泳峰面积减小50%以上，判断为对HBsAg/HBeAg有强的 抑制作用。
【文档编号】G01N27/447GK103439392SQ201310413743
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】利健文 申请人:广东食品药品职业学院