专利名称：一种具有抗病毒作用的复合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种复合物及其制备方法，特别是涉及一种具有抗病毒作用的复合物及其制备方法。
苦味叶下珠或珠子草中的多酚类化合物是其抗乙肝病毒的有效组份，但因多酚类化合物极易氧化而失去活性，使其在实际应用中受到很大的限制。
一种新的具有抗病毒作用的复合物，优选由10-50％苦味叶下珠总多酚与50-90％壳聚糖组成。
所述复合物，优选25-40％苦味叶下珠总多酚与60-75％壳聚糖；所述复合物的一种制备方法为壳聚糖的制备将分子量60-200万壳聚糖溶于1-4％乙酸溶液中，配成1-5％壳聚糖溶液；苦味叶下珠总多酚的制备方法为鲜苦味叶下珠全草切碎，用水蒸气加热2-8分钟，加13-17倍量水浸泡1-2小时，加热提取20-40分钟，取提取液，药渣再提取1-3次，每次加水量均为提取药量的13-17倍并提取20-40分钟，合并提取液，滤过，然后将滤液通过D101聚苯乙烯型大孔吸附树脂柱，弃去滤出液，用药材量2-4倍量的水洗涤柱体，弃去洗涤液，再用为药材量的2-4倍60-80％乙醇洗脱至洗脱液三氯化铁显色反应阴性，收集乙醇洗脱液，回收乙醇后减压浓缩至相对密度为1∶1，即得苦味叶下珠总多酚浓缩液，浓缩液中的总多酚含量采用普鲁士蓝法测定，浓缩液中的总多酚含量为75-85％；向已制备的壳聚糖溶液中加入适量甘油和表面活性剂，壳聚糖、表面活性剂和甘油的比例为1∶1∶0.05.然后加入苦味叶下珠苦味叶下珠总多酚浓缩液，在热水浴中搅拌10-30分钟，滤去不溶物，滤液加1-3％的NaOH调节滤液的PH至中性，最后滤液经冷冻干燥磨粉即得；冷冻干燥时，先将滤液置低温冰箱中冷冻至负30-40度，然后放入冷冻干燥机中，干燥12-24小时。
上述表面活性剂可选用聚乙二醇类等非离子表面活性剂和明胶等天然表面活性剂。
本发明还公开一种药物制剂，含有1％-99％的苦味叶下珠总多酚-壳聚糖复合物和99％-1％的赋形剂，优选含有30％-80％的苦味叶下珠总多酚-壳聚糖复合物和70％-20％的药用赋形剂，最好含有60％-70％的苦味叶下珠总多酚-壳聚糖复合物和40％-30％的赋形剂。
按药剂学方法，可以将本发明的复合物加入辅料制备成多种临床药物剂型，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂中的任何一种；所说的非肠道给剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。
所述辅料是指常规的赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂等。
以下实验例进一步说明本发明。
本发明复合物，即可有效防止总多酚活性组份的氧化，提高其稳定性，又提高了该活性组份的生物利用度和抗病毒剂抗菌活性。实验例1体外抗乙肝病毒活性试验1.材料和方法1.1.试验细胞试验使用2.2.15细胞。该细胞是HBV DNA转染人类肝癌细胞株HcPG2所建立的。由美国Mountain Sinal Medical Center提供。采用完全MEM培养液置于CO2孵箱中培养。CO2浓度5％，氧气浓度95％。
1.2.试验药物苦味叶下珠总多酚提取物和苦味叶下珠-壳多糖复合物各5克，用去离子水充分溶解，分别配成2、1、0.5、0.25、0.125(mg/ml)五个浓度的水溶液，药液粗滤后再经0.2μm的微孔滤膜过滤除菌后备用。
1.3.试验方法细胞用0.25％的胰酶消化，按1×105细胞/孔接种于24孔板，1×106细胞/瓶接种于25毫升培养瓶，48小时后换用含有不同药物浓度的培养液，每4天换一次，共三次，12天后收集24孔板上清，采用HBsAg和HBeAg固相放射免疫测定试剂盒检测HBsAg和HBeAg.HBsAg和HBeAg的抑制率按下式计算抑制率＝(试验孔P/N-对照孔P/N÷对照孔P/N-2.1)×100％2.结果2.1.对HBsAg的抑制作用试验结果见下表。
药物浓度(mg/ml)药物0.5 0.25 0.125总多酚 83.06 52.47 25.31总多酚-壳聚糖复合物 100 97.31 73.062.2.对HBeAg的抑制作用试验结果见下表。
药物浓度(mg/ml)药物0.5 0.25 0.125总多酚82.64 54.2927.51总多酚-壳聚糖复合物 100 98.8475.01实验例2对流感病毒的抑制作用1、实验材料流感病毒鼠肺适应株FM1，由南京医科大学微生物教研室提供。昆明种小鼠，体重18-22克，由山西省中医药研究院实验动物室提供。病毒唑(Virazole)注射液，南京第三制药厂生产。苦味叶下株总多酚和苦味叶下株总多酚-壳聚糖复合物按以上方法由本公司科研中心制备。
2、方法和结果健康昆明种小鼠50只，分为正常，流感病毒肺炎模型，Virazole，苦味叶下株总多酚和苦味叶下株总多酚-壳聚糖复合物五组，每组10只，雌雄各半。取10倍LD50量的流感病毒滴鼻感染小鼠肺部，正常组吸入生理盐水30μl/只，感染后2小时，分别给予小鼠Virazole(25mg/kg，im)苦味叶下株总多酚和苦味叶下株总多酚-壳聚糖复合物(500mg/只，ig)，模型和正常对照组均给与生理盐水0.5ml，连续给药5天，每天三次，连续观察15天。试验结果见下表。
组别 剂量 死亡率(％) 死亡保护率 生存时间(天)(％)正常组 ………15模型组 …100 …6.3±4.1Virazole 25mg/kg 12^(p＜0.01)9113.4±4.2^(p＜0.01)总多酚 500mg/只23*(p＜0.05)7311.1±2.89*(p＜0.05)总多酚-壳聚糖 500mg/只8**(p＜0.001) 9315**(p＜0.01)实验例3药物稳定性试验分别将苦味叶下株总多酚和它的壳聚糖复合物装入塑料瓶内，于60度恒温干燥箱中放置10天，分别于第0，1，2，4，5，7，10天时取样，按以上方法测定其总多酚含量。测定结果见下表。
药物样品 总多酚含量(％，d)0 1 2 4 57 10总多酚 100 98.693.784.279.9 68.258.1总多酚-壳聚糖100 98.898.298.798.8 98.598.6结论以上实验例的研究结果表明，利用本发明的制备工艺将苦味叶下珠总多酚制成苦味叶下珠总多酚-壳聚糖复合物不仅可大大提高苦味叶下珠总多酚的稳定性，而且也可大大提高苦味叶下珠总多酚的抗病毒活性.
以下实施例均能实现上述实验例的效果。实施例1苦味叶下珠总多酚-壳聚糖复合物制备壳聚糖溶液制备，将壳聚糖(分子量大于60万，购于南通双林生物制品有限公司)溶于1.5％的乙酸溶液中，配成2％的壳聚糖溶液；苦味叶下株总多酚制备，鲜苦味叶下珠全草切碎，用水蒸气迅速加热2-5分钟，加15倍量水浸泡1小时，加热提取30分钟，取提取液，药渣再提取两次，每次加水量均为提取药量的15倍并提取30分钟，合并三次提取液，滤过，然后将滤液通过D101大孔吸附树脂柱，弃去滤出液，用药材量三倍量的水洗涤柱体，弃去洗涤液，再用为药材量的三倍70％乙醇洗脱至洗脱液三氯化铁显色反应阴性，收集乙醇洗脱液，回收乙醇后减压浓缩至相对密度为1∶1，即得苦味叶下株总多酚浓缩液。在2％的壳聚糖溶液100ml中加入适量0-2％甘油和表面活性剂(吐温80，1-2％)，然后加入制得的苦味叶下珠浓缩液100克，在热水浴中搅拌约15分钟，滤去不溶物，滤液加1％的NaOH调节滤液的PH至中性，最后滤液经冷冻干燥磨粉即得。冷冻干燥时，先将滤液置低温冰箱中冷冻至负35度，然后放入冷冻干燥机中，干燥20小时。实施例2苦味叶下珠总多酚-壳聚糖复合物500g、药用淀粉1000g，混合均匀，装入0#胶囊，每粒0.35g，每次口服1-2粒，每日两次。实施例3苦味叶下珠总多酚-壳聚糖复合物1000g、药用淀粉500g，混合均匀，用适量乙醇制粒，经整粒机整粒，压片，每片0.25g，口服，每次1-2片，每日两次。实施例4苦味叶下株总多酚-壳聚糖复合物10g、丙二醇20ml，聚乙二醇-40050ml，注射用水300ml，混合，水浴加热30分钟，加苯甲醇50ml，再用注射用水加至1000ml，在超声波中处理10分钟，再水浴上加热30分钟，调PH值5.5-6.5，过滤澄明，灌封，灭菌即得。每支2ml，肌肉注射，一次2ml，一日1-2次。
权利要求
1.一种具有抗病毒作用的复合物，其特征在于该复合物是由10-50％苦味叶下珠总多酚与50-90％壳聚糖组成。
2.如权利要求2所述的复合物，其特征在于该复合物是由25-40％苦味叶下珠总多酚与60-75％壳聚糖组成。
3.一种具有抗病毒作用的复合物，其特征在于该复合物是由10-50％苦味叶下珠总多酚与50-90％天然高分子或合成高分子组成，天然高分子包括蛋白质、壳聚糖、纤维素、琼脂糖；合成高分子包括聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚乙烯乙酸酯、聚乙烯吡咯咯烷酮。
4.如权利要求1或2所述的复合物的制备方法，其特征在于该方法为壳聚糖的制备将分子量60-200万壳聚糖溶于1-4％乙酸溶液中，配成1-5％壳聚糖溶液；苦味叶下珠总多酚的制备方法为鲜苦味叶下珠全草切碎，用水蒸气加热2-8分钟，加13-17倍量水浸泡1-2小时，加热提取20-40分钟，取提取液，药渣再提取1-3次，每次加水量均为提取药量的13-17倍并提取20-40分钟，合并提取液，滤过，然后将滤液通过D101聚苯乙烯型大孔吸附树脂柱，弃去滤出液，用药材量2-4倍量的水洗涤柱体，弃去洗涤液，再用为药材量的2-4倍60-80％乙醇洗脱至洗脱液三氯化铁显色反应阴性，收集乙醇洗脱液，回收乙醇后减压浓缩至相对密度为1∶1，即得苦味叶下珠总多酚浓缩液，浓缩液中的总多酚含量采用普鲁士蓝法测定，浓缩液中的总多酚含量为75-85％；向已制备的壳聚糖溶液中加入适量甘油和表面活性剂，壳聚糖、表面活性剂和甘油的比例为1∶1∶0.05.然后加入苦味叶下珠苦味叶下珠总多酚浓缩液，在热水浴中搅拌10-30分钟，滤去不溶物，滤液加1-3％的NaOH调节滤液的PH至中性，最后滤液经冷冻干燥磨粉即得。
5.如权利要求4所述的复合物的制备方法，其特征在于该方法为壳聚糖溶液制备，将分子量大于60万壳聚糖溶于1.5％的乙酸溶液中，配成2％的壳聚糖溶液；苦味叶下株总多酚制备，鲜苦味叶下珠全草切碎，用水蒸气迅速加热2-5分钟，加15倍量水浸泡1小时，加热提取30分钟，取提取液，药渣再提取两次，每次加水量均为提取药量的15倍并提取30分钟，合并三次提取液，滤过，然后将滤液通过D101大孔吸附树脂柱，弃去滤出液，用药材量三倍量的水洗涤柱体，弃去洗涤液，再用为药材量的三倍70％乙醇洗脱至洗脱液三氯化铁显色反应阴性，收集乙醇洗脱液，回收乙醇后减压浓缩至相对密度为1∶1，即得苦味叶下株总多酚浓缩液；在2％的壳聚糖溶液100ml中加入0-2％甘油和表面活性剂，吐温80，1-2％，然后加入制得的苦味叶下珠浓缩液100克，在热水浴中搅拌约15分钟，滤去不溶物，滤液加1％的NaOH调节滤液的PH至中性，最后滤液经冷冻干燥磨粉即得。
6.如权利要求4或5所述的复合物的制备方法，其特征在于该方法中所述的表面活性剂可选用聚乙二醇或聚乙二醇类非离子表面活性剂或明胶天然表面活性剂。
7.如权利要求6所述的复合物的制备方法，其特征在于该方法中所述的冷冻干燥为先将滤液置低温冰箱中冷冻至负30-40度，然后放入冷冻干燥机中，干燥12-24小时。
8.如权利要求1-3所述的复合物，其特征在于该复合物可加入辅料制备成片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂、注射剂、气雾剂、栓剂中的任一种临床药物制剂。
9.如权利要求8所述的复合物，其特征在于所述药物制剂是由30％-80％的苦味叶下珠总多酚-壳聚糖复合物和70％-20％的药用赋形剂组成。
10.如权利要求9所述的药物制剂，其特征在于该药物制剂是由60％-70％的苦味叶下珠总多酚-壳聚糖复合物和40％-30％的赋形剂组成。
11.如权利要求所述的1-3所述的复合物在制备抗病毒药物中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于在制备抗乙肝病毒药物中的应用。
13.如权利要求11所述的应用，其特征在于在制备抗流感病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明者公开了一种具有抗病毒作用的复合物及其制备方法，复合物由10－50％苦味叶下珠总多酚与50－90％壳聚糖组成，制备时由1－5％壳聚糖溶液中加入适量甘油和表面活性剂，壳聚糖、表面活性剂和甘油的比例为1∶1∶0.05，然后加入苦味叶下珠总多酚浓缩液，在热水浴中搅拌10－30分钟，滤去不溶物，滤液加1－3％的NaOH调节滤液的pH至中性，最后滤液经冷冻干燥磨粉即得复合物。本发明复合物，即可有效防止总多酚活性组份的氧化，提高其稳定性，又提高了该活性组份的生物利用度和抗病毒剂抗菌活性。
文档编号A61K31/722GK1457797SQ0313714
公开日2003年11月26日 申请日期2003年6月5日 优先权日2003年6月5日
发明者梁卫, 史跃年, 冯前进 申请人:广西半宙制药股份有限公司