专利名称：抗寄生物和/或抗病毒和/或抗微生物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用Peschiera属或马铃果属(Voacanga)植物的碱性提取物治疗微生物、寄生物或病毒感染的方法。
背景技术：
原生动物寄生物与人类和驯养动物的一些非常重要和流行的疾病有关，它们威胁着将近四分之一的人类的生命。这些疾病为人们所熟知，包括瘴气(或疟疾)、利什曼病、trynomiasis、弓形体感染、原生动物肠内感染、trychonomiasis贾弟虫病、等孢球虫病、隐孢子虫病、环孢子虫病(cyclosporiosis)、微孢子虫病等等。世界卫生组织(WHO)的统计显示在全世界范围内所有原生动物引起的寄生物感染中，疟疾和利什曼原虫是引起死亡的主要原因，疟疾占第一位，利什曼原虫占第二位。WHO的统计显示，利什曼病的发病在过去的15年中增长了42倍，已成为世界范围内继疟疾之后原生动物寄生物疾病的第二大死亡原因。实际上，利什曼病成为88个国家的地方病，三亿五千万人有患病危险，一千二百万人患病，并且每年会出现一百五十万至两百万例新病例。该疾病因为大规模的乡村-城市迁移、抗药性及其与艾滋病的关联而在一些地区传播。利什曼病/HIV的共同感染被WHO认为是人类真正的威胁，尤其是在地中海国家和欧洲西南部。此外，利什曼病正逐渐成为美国的地方病。
疟疾是一种危害热带和亚热带地区人们的严重的地方病，它由蚊子携带。WHO最近的一份报告显示，全世界每年有3至5亿人患这种病，其中70％的病例出现于撒哈拉沙漠以南的非洲，在南美洲和东南亚的发病率为每千人4至6例。每年有一百五十万至三百万人死于此病，其中有一百万人为小于五岁的儿童。该寄生物为疟原虫(Plasmodium)属的血原虫，例如间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)、三日疟原虫(Plasmodium malarae)和恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)，其中恶性疟原虫是最危险和最具破坏力的物种。有多种药物对该病有效，常用的是喹啉(quinolitic)生物碱，例如氯喹或aminocrinodines。不幸的是疟原虫逐渐具有了对多种常用抗疟药物特别是对氯喹的抗药性，使得这类药物在世界上很多地区都变得没有效果或效果不好。必须用例如aminocrinodines的其它药物代替它们，而不幸的是aminocrinodines是有毒的。
利什曼病是一种由昆虫携带的严重地方病，它在热带和亚热带地区的88个国家流行，使得三亿五千万人有患病危险，其中一千二百万人患病，并且每年会出现一百五十万至两百万例新病例。利什曼病由利什曼原虫属(Leishmania)的不同种引起，利什曼原虫属为来自锥虫科(Trypanosomatidae)的动基体目原生动物寄生物。这些寄生物存在复殖(digenetic)生活周期，包括存在于昆虫载体中的感染性的有鞭毛的前鞭毛体形式，以及生活在宿主脊椎动物的单核吞噬细胞系中的非运动性的细胞内无鞭毛体形式。
利什曼病因为大规模的乡村-城市迁移、抗药性的出现及其与艾滋病的关联而在一些地区传播。利什曼病/HIV的共同感染被WHO认为是人类真正的威胁，尤其是在地中海国家和欧洲西南部的国家。甚至美国也逐渐变成利什曼病的流行地区。
该寄生物属于动基体目(Kinetoplastidae)的利什曼原虫属，例如婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)、热带利什曼原虫(Leishmania tropica)、硕大利什曼原虫(Leishmania major)、墨西哥利什曼原虫(Leishmania mexicana)以及尤为危险的杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)。
多种药物对利什曼病有效，通常使用的是锑剂，例如N-甲基葡萄糖胺锑盐和葡萄糖酸锑钠。不幸的是利什曼原虫株逐渐出现了对上述药物的抗药性，使得这类药物在世界上几个地区都变得没有效果，特别是在印度，有大约50％的内脏利什曼病的病例对上述药物具有抗性。而不幸的是上述药物的替代产品例如喷他脒和两性霉素B都有毒并且价格昂贵。甚至新的烷基磷脂类似物的抗利什曼病的药剂，例如被寄予厚望的米替福星也已经在体外实验中发现有药物抗性。
出于以上事实，目前需要新的抗寄生物和抗病毒剂以对抗传染病，该药剂应价格足够低廉以使得疾病流行的贫穷国家能够负担。
发明内容
为满足上述需要，本发明的目的是提供一种治疗微生物、寄生物和病毒疾病的有效并且花费相对低的方法。
因此，本发明涉及一种治疗人类或动物的微生物、寄生物或病毒感染的方法，所述方法包括以下步骤使被感染细胞暴露于Peschiera属或马铃果属植物的碱性三级生物碱(tertiary alkaloid)提取物。
更具体而言，本发明涉及一种如上所述的方法，其中的碱性生物碱具有下列化学式
其中R1为甲基或氢，R2、R3、R4和R5可以相同或不同，分别可为CH2OH、CH3、OCH3、COOCH3、OH或氢。
本发明还涉及从Peschiera属或马铃果属植物中分离碱性三级生物碱的方法，所述方法包括以下步骤粉碎Peschiera属或马铃果属植物原料；用柠檬酸和Na2HPO4水溶液缓冲液处理粉碎的植物原料以获得水相和有机层；用柠檬酸水溶液萃取有机层；用碱调节水相部分的pH；以及用二氯甲烷从水相部分生物碱中萃取碱性三级生物碱。
以下文的实施例和附图为参考可以更详细的描述本发明。
图1显示来自Peschiera fuchsiaefolia的生物碱提取物的剂量依赖活性。
图2显示来自Peschiera fuchsiaefolia的碱性生物碱提取物对恶性疟原虫生长的影响。
图3显示老刺木胺的体内抗疟活性。
图4显示来自Peschiera fuchsiaefolia的碱性生物碱提取物和纯化的老刺木胺杀灭婴儿利什曼原虫前鞭毛体的体外活性。
具体实施例方式
实施例1提取原材料为收获于巴西阿雷格里港的Peschiera fuchsiaefolia的根皮，它在当地由制药厂(Cibecol)从植物学方面进行了鉴定。
将100g完全粉碎的植物原料用萃取法(连续3次)处理，所述萃取法使用pH为5的柠檬酸-Na2HPO4水溶液缓冲液(14.0g Na2HPO4和10.0g柠檬酸/1L水)。弃去水相部分，将有机相用150ml、pH为3.5的柠檬酸水溶液(3.1g/L)萃取三次。合并水相部分，用Na2CO3调节pH至9.0，然后用150ml二氯甲烷萃取三次。合并有机相部分，用无水Na2SO4干燥，过滤并在旋转式蒸发器上蒸发，获得3.4g残留物。该残留物含有三级生物碱，为所需要的碱性提取物。
在体外测量了该碱性提取物杀灭恶性疟原虫(下述实施例4)和克隆的婴儿利什曼原虫株的前鞭毛体形式(下述实施例6)的活性，它们在28℃用添加20％热灭活胎牛血清的Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)1640-改良培养基(培养基与血清均购自Gibco公司)进行培养。
实施例2纯化使用反流分布法分离包含于实施例1的碱性提取物中的各种三级生物碱，以二氯甲烷为固定相，以pH不断降低的缓冲水溶液为流动相。用二氯甲烷萃取从水相中回收生物碱。
所使用的仪器是Craig型柱装置，它由200个玻璃管组成(下层相体积为10ml，上层相体积为10ml)。
在pH7时获得了第一系列的较小的生物碱，然后在pH5.2时依次洗脱出了周长春花因(KrKb＝4×10-9)、16-表金菊醇(16-epi-affinine)(KrKb＝2.5×10-9)和affinisine(KrKb＝7×10-10)，其中Kr为分配系数(水相/有机相再分配)，Kb为解离常数。
在pH4时，N-去甲基老刺木胺(KrKb＝3.5×10-11)和老刺木碱(KrKb＝4×10-11)被洗脱下来。
在pH3.2时，沃洛亭(KrKb＝2×10-11)和老刺木胺(KrKb＝1.3×10-11)被洗脱下来。
在pH3.0时，heynearnine(KrKb＝5×10-12)和老刺木分亭(KrKb＝3.5×10-12)被洗脱下来。
在pH2.6时，榴花碱(KrKb＝2×10-12)被洗脱下来，最后在pH2.2时，老刺木精(voacangine)(KrKb＝6.5×10-13)被洗脱下来。
通过反流分布法在二氯甲烷∶甲醇∶水为7∶5∶2的二相系统中可获得氯化形式的四级生物碱，例如12-甲氧基-N6-甲基沃洛亭(12-methoxy-N6-methylvoacalotine)和N6-methylaffinisine。每一种生物碱都通过反流分布法的一次或多次新的再循环步骤及随后的结晶方法纯化。
纯生物碱混合物经过其它两个色谱过程以提高其纯度，所述两个色谱过程一个在硅柱上进行，另一个在薄层硅板上进行。然后将在最小体积的二氯甲烷和甲醇(95∶5)中的生物碱混合物过4.7×40cm的快速硅胶柱。然后用下述甲醇/二氯甲烷梯度的溶液洗脱生物碱95∶5的溶液250ml、90∶10的溶液300ml、80∶20的溶液300ml，最后是60∶40的溶液300ml。
然后将上述化合物加样于制备的厚的薄层色谱板上。通常每板加样100mg，然后用溶于二氯甲烷混合物的10％甲醇进行迁移。生物碱通过紫外线可视化，将条带从板上刮下并用溶于二氯甲烷的40％甲醇洗脱。使用13C和1H NMR和质谱分析确定所分离的各种生物碱的结构。
实施例3提取物分析使用下述有效的分析方法定量分析碱性提取物中的生物碱。通过在已知量的二氯甲烷中溶解纯化的生物碱来建立校准曲线。取精确体积的溶液，蒸发后再稀释于含0.1％三氟乙酸(TFA)、18％乙腈和72％水的混合物中。每一样品设三组平行样，并用高效液相色谱/质谱(HPLC/MS)进行分析，并用每一化合物的离子特征测定响应因子。上述离子分别为老刺木胺的353(M+2H)+2和705(M+H)+、老刺木碱的353(M+H)+和沃洛亭的367(M+H)+。根据上述每一离子的每一浓度绘制校准曲线。
将从300mg提取物结晶得到的残留物溶于含0.1％三氟乙酸、18％乙腈和72％水的混合物中。将混合物超声处理5分钟，用0.2μm聚四氟乙烯(PTFE)滤器过滤，并注入50pi溶液，该分析设三组平行样。总离子色谱图示出生物碱标准物的假分子离子(M+H)+所对应的离子的强度，所述标准物即为705的老刺木胺(滞留时间29.7秒)及其异构体(滞留时间28.8秒)、老刺木碱(滞留时间16.1秒)和沃洛亭(滞留时间20.6秒)。用这些离子和从校准曲线获得的响应因子来计算提取物中每种化合物的浓度。
表1所选的与单体生物碱相对应的离子相对于植物提取物的离子色谱图的总强度的相对强度。
a由于缺少可靠的标准物，这些化合物在混合物中不能确定地被鉴定出来。它们为与所选出的离子相对应的可能的结构。ND未检出选出的离子与已知存在于该植物中的各种生物碱的假分子离子相对应。
表2所选的与二聚体生物碱相对应的离子相对于植物提取物的离子色谱图的总强度的相对强度。
a根皮的二聚体生物碱例如老刺木胺被认为与混合物的生物活性有关b由于缺少可靠的标准物，这些化合物在混合物中不能确定地被鉴定出来。它们为与所选出的离子相对应的可能的结构。
实施例4体外抗疟活性以实施例1的方法从根皮和茎皮中获得的产率为1.9％的碱性提取物被用于对已知的恶性疟原虫株进行体外抗疟活性研究。所得结果示于下表3和4。
在本研究中始终使用恶性疟原虫株D6和W2。恶性疟原虫的实验室分离株在受控条件下在培养基上生长，所述培养基含有血细胞比容为5％的红细胞(RBC)，无白细胞(Tager和Jensen，1976)。简而言之，使寄生物感染RPMI 1640培养基中的RBC，所述RPMI 1640培养基添加了25mM Hepes、0.25mM葡萄糖、0.2％碳酸氢钠、0.5％Albumax II和50mg/L次黄嘌呤，在37℃、5％CO2条件下生长。在需要时将培养物用山梨醇处理使其同步化(D.Ramanitrahasimbola er al，1999，BiologicalActivities of the Plant-derived Bisindole Voacamine withreference to Malaria.Phytother.Res.1530-33)。
寄生物的发育和形态学评估。使用显微镜检测吉姆萨染色的薄血涂片来评估发育和形态学，以生物碱的10％(v/v)二甲亚砜(DMSO)储液溶于RPMI 1640，在生物碱剂量递增的条件下，间隔24、48和72小时制作染色薄血涂片。在使用前用RPMI 1640培养基制备储液稀释液。不含药物的培养物涂片始终用作对照。通过计数1000个红细胞来测量寄生物血症，并用全部被寄生红细胞的百分比来表示(表3)。
表3来自Peschiera fuchsiaefolia的碱性提取物和纯化的老刺木胺在体外杀灭恶性疟原虫的活性
上述值以ng/ml表示。该值越低，则产物的活性越强。从总植物提取物中纯化的老刺木胺对两类疟原虫株都有显著的抗疟活性(实验2)。其活性与氯喹抗敏感株D6的活性相当。从茎皮中提取的碱性提取物(实验3)的活性稍低，但其对氯喹抗性的疟原虫W2株仍有活性。活性最强的化合物是从根皮提取的碱性提取物中所含的生物碱(实验1)。
如图1所示，在存在提取物化合物的条件下，对寄生物的生长抑制为剂量依赖型。
表4来自Peschiera fuchsiaefolia的碱性生物碱提取物在体外对恶性疟原虫生长的抑制
a数据表示为用3H-次黄嘌呤掺入未感染红细胞的本底值校正后的三个平行实验组相对于未处理组的寄生物生长抑制百分比的平均值和标准差(S.D.)。
对血涂片的定性显微镜检测表明，在24小时后生物碱提取物对寄生物发育有强烈的抑制效果。寄生物的正常形态发生了显著变化，最明显的变化为固缩和空泡形成(预示着细胞破坏的变化)。在48小时(一个单性周期)后，寄生物及其宿主细胞完全退化和破坏。
生长抑制测定。通过如下方法估计寄生物的生长抑制用一系列不同稀释度、提取自Pfuchsiaefolia的碱性提取物生物碱连续处理培养物，然后用完全改良培养基将其进行一系列二倍稀释，使稀释液含有2.5mg/L次黄嘌呤(低浓度次黄嘌呤培养基)。将稀释液加入到96孔微量培养板中，每孔100μl。用低浓度次黄嘌呤培养基将寄生物稀释为含有1-2％寄生物血症及5％血细胞比容的2倍浓缩储液，然后将此悬液加入到微量培养板中，每孔100μl。间隔24小时后测量提取物的活性。
使用3H-次黄嘌呤分析来测定寄生物的复制。寄生物使用生长培养基中所含的次黄嘌呤作为核酸合成的前体。通过用放射性次黄嘌呤替代培养基中的次黄嘌呤，可以测定在抗疟药物存在时DNA复制的速率和寄生物的生长速度。
在存在不同浓度的生物碱提取物的条件下对寄生物进行次黄嘌呤分析。在培养24小时后，用100μl含终浓度为0.5μCi(35)的3H-次黄嘌呤的低浓度次黄嘌呤培养基替代100μl的培养上清液。再经过18小时后移去上清液并将细胞收获至玻璃纤维滤器上。将用空气干燥的滤器浸没于闪烁液中，并在液体闪烁计数仪中对放射性发射进行计数。
在无生物碱提取物条件下用寄生物感染的对照RBC带有的放射性水平为50000次计数每分钟(cpm)。在生物碱提取物存在的条件下，3H-次黄嘌呤的摄取水平显著降低，表明寄生物的复制和生长有相当程度的减少。事实上生物碱提取物的稀释度即使低至1/1200也能引起97％以上的3H-次黄嘌呤摄取的抑制，计数为3000cpm(图2)。药物的效果也是剂量依赖型的，证实在稀释度大于1/500时仍有50％以上的抑制(20900cpm)。
平行进行了三次测定，并将平均生长抑制百分比绘制为提取物浓度的函数。生长抑制(％)根据来源于3H-次黄嘌呤摄取分析的每分钟计数(cpm)计算。
实施例5体内抗疟活性动物模型。按照经典的4天抑制测试(D.Ramanitrahasimbola etal，supra)，使用约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)N67作为啮齿动物疟疾寄生物，氯喹作为参考抗疟药，评估杀血液裂殖体(bloodschizoncidal)活性。使用体重20±2g的供体Swiss白化小鼠，从其尾静脉注入107个从供体获得的被啮齿动物疟疾寄生物寄生的红细胞。然后从测试当天(第0天)开始，每天分别用溶于0.9％NaCl溶液的2.5、5和10mg/kg的老刺木胺柠檬酸盐以口服途径处理三组小鼠。第四组小鼠用溶于0.9％NaCl水溶液的1.5mg/kg的硫酸氯喹通过皮下给药方式处理，对照组(第五组)用赋形剂处理。在第1、2和3天重复处理过程。在第4天时从尾部采血制成血涂片并用Diff Quick试剂染色，对2000个红细胞进行镜检确定其中被寄生红细胞的百分比。记录每一组的所有小鼠的寄生物血症百分比，并用普通统计学方法计算每一组的寄生物血症平均百分比，并与未处理对照组的结果比较。在三个独立实验中进行测试，结果以直方图形式示出(图3)。在所使用的剂量水平上，老刺木胺——一种来自Peschiera fuchsiaefolia的碱性生物碱提取物中的活性成分——在4天测试中表现出明显的体内抗疟活性。
临床分析。在氯喹抗性疟原虫株流行地区莫桑比克对一组74个疟疾病人进行了临床试验。
将实施例1的稀释于100ml的生理盐水的碱性提取物4ml注射到每个病人的第7、8或13节脊椎。
在3小时后大部分病例的疟疾临床症状(发烧、呕吐、腹泻、关节疼痛)消失，并且在4小时后这些病人的所有红细胞培养物均呈阴性。
在4天内有72％的病人被治愈，并且在随后连续3天的治疗中有90％的病人被治愈。
为检测可能的不良副反应，一些病人以口服(糖浆)给药，还有一些病人以直肠给药。相比于在多药物抗性疟疾流行地区显示出毒副作用的目前常用抗疟药物，没有观察到副作用。
实施例6体外杀利什曼原虫(Leishmanicidal)活性抗利什曼原虫组合物的制备将总植物提取物以50mg/ml浓度溶于DMSO制成储液。将纯化的生物碱老刺木胺以3mg/ml溶于50％DMSO制成储液。
体外药物测试。用基于3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑(MTT)的显色分析评估了纯化老刺木胺对婴儿利什曼原虫前鞭毛体的体外杀灭效果。对悬浮于新鲜培养基的对数生长期培养物中的前鞭毛体形式进行了筛选。以2×106寄生物/毫升接种于96孔微量培养板中，并添加递增浓度的化合物使其终体积为150μl。DMSO的最终含量不超过0.3％，这样就不会影响寄生物的生长。在28℃培养72小时后，在显微镜下检测寄生物的形态，用MTT显色分析测定前鞭毛体的生长和活力。每孔加入10μl的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑(MTT，Sigma，5mg/ml，溶于PBS)，然后将平板再培养5小时。只有活细胞可以还原MTT化合物，产生不溶于水的紫色甲臜(formazan)结晶。加入100μl的20％SDS溶解晶体并在37℃培养过夜。然后使用微量培养板读数仪(Beckman Biomek 2000)读取540纳米处的吸光度。用给定浓度的化合物存在时的吸光度除以不含药物培养的对照细胞的吸光度来测定细胞存活。在将生长百分比对药物浓度的函数绘图之后，从图形中得出50％抑制浓度(IC50)值。所有实验设两组平行。
结果显示于图4和下表5。IC50(杀死50％寄生物的化合物浓度)值以ng/ml表示。IC50越低，化合物效力越强。当存在Peschierafuchsiaefolia的碱性提取物时，生长抑制呈剂量依赖型，提取物对婴儿利什曼原虫前鞭毛体的IC50仅为68.2ng/ml。在浓度高于100μg/ml时观察到完全的生长抑制。
从碱性植物提取物中纯化的生物碱老刺木胺在体外具有更好的杀利什曼原虫前鞭毛体效果。浓度低至10μg/ml时就能使细胞在72小时内完全破坏，杀灭曲线表明IC50仅为3.3ng/ml，这意味着它比碱性提取物的效力高20倍。
表5来自Peschiera fuchsiaefolia的碱性提取物和纯化的老刺木胺在体外杀灭婴儿利什曼原虫前鞭毛体的活性
a试验次数，每次设两组平行。
权利要求
1.一种治疗人类或动物的微生物、寄生物或病毒感染的方法，所述方法包括以下步骤使被感染细胞暴露于Peschiera属或马铃果属植物的碱性三级生物碱提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物为Peschierafuchsiaefolia。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述碱性提取物含有具有选自下列化学式的生物碱 其中R1为甲基或氢，R2、R3、R4和R5可以相同或不同，分别可为CH2OH、CH3、OCH3、COOCH3、OH或氢。
4.一种从Peschiera属或马铃果属植物中分离碱性三级生物碱的方法，所述方法包括以下步骤粉碎Peschiera属或马铃果属植物原料；用柠檬酸和Na2HPO4水溶液缓冲液处理粉碎的植物原料以获得水相和有机层；用柠檬酸水溶液萃取有机层；用碱调节水相部分的pH；以及用二氯甲烷从水相部分生物碱中萃取碱性三级生物碱。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述植物为Peschierafuchsiaefolia。
6.根据权利要求5所述的方法，其中仅使用所述的Peschierafuchsiaefolia的根部获得碱性三级生物碱提取物。
全文摘要
老刺木胺及其天然或合成衍生物，例如16’－去羰基甲氧基老刺木胺、N
文档编号C07D487/18GK101014346SQ200580022021
公开日2007年8月8日 申请日期2005年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者L·斯特拉, S·锡西 申请人:千年希望有限公司