肝脏炎症的生物标志物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及对来自人的生物样品进行诊断研究的方法，用于诊断研究肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，其中所述样品被研究作为肝脏炎症——尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变的标志物的一种或多种蛋白质，其中相对于健康状况，所述蛋白质浓度升高或者降低表明存在肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬化。所述蛋白质选自：ER6Q、波形蛋白、肌动蛋白α1骨骼肌蛋白、hMFAP4、原肌球蛋白、PTGES2、淀粉样P-组分、transgelin、钙调理蛋白1、人p20蛋白、17kDa肌球蛋白轻链、H链H?Igg?B12、脯氨酰4-羟化酶、β亚基亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PRO2619、醛脱氢酶1、纤维蛋白原α链前蛋白原、果糖-二磷酸-醛缩酶B、精氨酸琥珀酸合成酶、Eefla2、ATP5A1、α-2-肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶、或者在每一情况下，是其部分序列。
【专利说明】肝脏炎症的生物标志物
[0001]本申请是申请日为2007年8月10日、申请号为200780029721.3、发明名称为“肝脏炎症的生物标志物”的发明专利申请的分案申请。
[0002]本发明涉及一种用于人类肝脏炎症的生物样品的诊断研究的方法，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，样品被研究因为一种或多种蛋白质作为肝脏炎症的标记物，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，蛋白质的浓度相对于健康状况提高或降低，这表明肝脏存在炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变中。
[0003]全世界大约有1.7亿人慢性感染了丙型肝炎病毒(h印atitis C virus(HCV))。病人之间疾病的病程显著不同；虽然大约20%的病人在20年内发展为肝硬化，而在其它病人中，在更长的时间期间后，仍然没有观察到这一类型的发展。除了其它因素之外，可确定会增加肝脏纤维化和/或肝硬变概率的一批因素有，雄性、酒精滥用、HIV或曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)的共感染、遗传易感性和感染时年龄较大。
[0004]最重要的是，肝星状细胞(h印atic stellate cells (HSC))，其在休息状态下在正常肝脏中负责维生素A的储存，尤其是，负责肝脏纤维化和/或肝硬变的发展。相反，在纤维化肝脏中，它们被激活，增生，且发展为肌纤维母细胞。这些肌成纤维细胞产生大量胶原蛋白，下调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases (MMP))的产生，且显示出MMP的生理抑制剂(physiological inhibitors of the MMP (TIMP))的增加性表达。随着增加胶原蛋白积聚，肝脏的纤维化进一步发展，这最后可能导致器官功能衰竭。
[0005]尤其是，聚乙二醇化干扰素a (peg-1nterferon alpha)和利巴韦林(ribavirin(三氮唑核苷))被用于慢性肝炎C的抗病毒治疗。尽管这种方式可以成功地治疗许多病人，但该治疗在至少50%病人中是不成功的，这些病人感染了 HCV基因型1，这种HCV基因型I在西方国家是最普遍的。这对感染了 HCV基因型4的病人是类似真实的，这种HCV基因型4在埃及频繁发生。此外，持久的抗病毒治疗的成本很高，并且这种治疗与显著的副作用有关。在显著晚期的病人中，抗病毒治疗不再产生期望的成功。因此，存在对能更好地诊断肝炎病人的纤维化以及因此而言肝硬化发生的需求，以及能够为治疗医师提供就抗病毒治疗是否可取以及是否有希望做出决断的能力的需求。
[0006]过去许多非侵入性标记物已经被用于肝脏纤维化的检测，在这些非侵入性标记物中，有所谓的act1-test或fibro_test、III型前胶原肽(PIIIP)、透明质酸、基质金属蛋白酶(MMP)以及它们的抑制剂(TIMP) (T.Poynard等人，Expert Rev MolDiagn.2005, 5(1):15-21; V.Leroy 等人，J H印2001，35(1):26)。然而，所有这些标记物仅仅表现出有限的敏感性和特异性，由于这个原因，存在对更合适的标记物的进一步需求。
[0007]从所描述的现有技术出发，因此它自身提出此种目标，即提供研究肝脏炎症和/或肝脏纤维化和/或肝硬变的生物样品的改进方法，其中使用新颖的标记物。
[0008]根据本发明，实现了这样的目标，即通过研究人类生物样品的肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变的方法，样品被研究，目标是一种或多种蛋白质作为肝脏炎症的标记物，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，以及升高水平的所述蛋白质表明存在肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，所述蛋白质选自:ER60、波形蛋白、肌动蛋白al骨骼肌蛋白、hMFAP4、原肌球蛋白、PTGES2、淀粉样-P-组分、transgel in、I丐调节蛋白1、人(Homosapiens)p20蛋白、17kDa肌球蛋白轻链、H链H IgG B12、脯氨酰4-羟化酶、β亚基。
[0009]进一步，本发明也涉及一种相应的方法，其中，降低水平的所述蛋白质表明存在肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，在这种情况下，所述蛋白质选自:亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PR02619、醛脱氢酶1、纤维蛋白原O -链前蛋白原、果糖-二磷酸-醛缩酶B、精氨酸琥珀酸合成酶、Eefla2、ATP5Al、α _2_肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶。
[0010]对于上调以及下调蛋白，也根据本发明，通过确定生物标记物(也就是:标志物蛋白)的部分序列，进行了研究。尤其是，这样的部分序列优选包括根据本发明的生物标志物的60%的氨基酸序列，尤其是70%和更多，80%和更多，尤其是90至95%。
[0011]在本发明的上下文中，术语肝脏炎症包括任何形式的肝炎，但尤其是肝脏纤维化，直到肝硬变(关于这些术语，例如，请参考相关的Pschyrembel, Klinisches Wor terbuch[Clinical Dictionary], 260th edition, 2004，Berlin)。根据本发明，肝脏纤维化和肝硬变是优选的。
[0012]进一步，本发明也涉及肝脏炎症的诊断，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，针对待研究的病人实施测定选自如下的至少一种蛋白的确定:ER60、波形蛋白、肌动蛋白α I骨骼肌蛋白、hMFAP4、原肌球蛋白、PTGES2、淀粉样-P-组分、transgelin、钙调节蛋白1、人p20蛋白、17kDa肌球蛋白轻链、H链H IgG B12、脯氨酰4-羟化酶、β亚基、亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PR02619、醛脱氢酶1、纤维蛋白原α -链前蛋白原、果糖二磷酸醛缩酶B、精氨酸琥珀酸合成酶、Eefla2、ATP5Al、α _2_肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶或其各自的部分序列。
[0013]进一步，根据本发明的这些生物标志物和/或标志物蛋白对于根据本发明的诊断是可能的。
[0014]与非纤维化组织相比，在纤维化组织的蛋白质组学分析过程中，所引述的蛋白可被鉴定为潜在的生物标志物。为了该目的，从感染了丙型肝炎的病人拿出肝脏活组织检查样品。在手工均质器中用裂解缓冲液均质化样品，DNA和其它细胞材料被除去，得到蛋白质浓缩物。使用染料标记这些蛋白质；使用等电聚焦，使蛋白质在第一个维度经受2-D聚丙烯酰胺凝胶电泳，在第二个维度经受SDS凝胶电泳。借助适合该目的的软件，比较纤维化和非纤维化细胞的结果，检测且量化在纤维化样品中扩大或降低的斑，这是与非纤维化样品相比而言。例如，来自GE Healthcare的ImageQuant?软件以及该公司的DeCyder软件可作为执行软件。测量且分析用来标记蛋白质的染料的散发。
[0015]借助LC-ES1-MS(液相色谱-电喷雾-质谱)完成进一步的分析。首先，借助凝胶中的胰蛋白酶，将蛋白质分解为单一肽片段；其中，在凝胶中，样品在之前已经被分离。借助反相HPLC，将这些片段彼此分离，并且使用质谱法研究这些片段，以鉴定单一蛋白。当然，其它合适的质谱法也可用于该目的，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)。
[0016]下述蛋白质能在研究中被鉴定，相对于非纤维化细胞，这些蛋白在纤维化细胞中被上调(倍数变化正值)或下调(倍数变化负值):
[0017]上调蛋白:
[0018]
【权利要求】
1.检测生物样品中选自如下所述的至少一种蛋白质的浓度的检测试剂在制备试剂盒或诊断设备中的用途:hMFAP4、ER60、波形蛋白、肌动蛋白α I骨骼肌蛋白、原肌球蛋白、PTGES2、淀粉样P-组分、transgel in、钙调理蛋白1、人p20蛋白、17kDa肌球蛋白轻链、H链H IgG B12、脯氨酰4-羟化酶β亚基、亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、PR02619、醛脱氢酶1、纤维蛋白原α链前蛋白原、果糖-二磷酸-醛缩酶B、精氨酸琥珀酸合成酶、Eefla2、ATP5Al、α-2-肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶，所述试剂盒或诊断设备用于肝脏炎症的诊断。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述肝脏炎症是肝脏纤维化和/或肝硬变。
3.如权利要求1所述的用途，特征在于:原肌球蛋白是肌节原肌球蛋白κ、β原肌球蛋白、TPMl人原肌球蛋白、或原肌球蛋白4。
4.如权利要求1至3任一项所述的用途，特征在于:所述试剂盒或诊断设备用于生物分析方法。
5.如权利要求4所述的用途，所述生物分析方法为免疫组织化学技术、抗体阵列、luminex、ELISA、免疫荧光和放射免疫分析法。
6.如权利要求1至3任一项所述的用途，特征在于:所述试剂盒或诊断设备用于质谱法以定量确定标志蛋白质。
7.如权利要求6所述的用途，所述质谱法为多反应监测质谱法或绝对量化AQUA质谱法。
8.如权利要求1至3任一项所述的用途，特征在于:所述试剂盒或诊断设备用于2-D电泳，第一维度为等电聚焦，第二维度为凝胶电泳。
9.如权利要求8所述的用途，特征在于:凝胶电泳是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
10.如权利要求8所述的用途，特征在于:所述试剂盒或诊断设备包含在进行2-D凝胶电泳之前对样品进行标记的染料。
11.如权利要求10所述的用途，特征在于:染料是Cy2、Cy3和/或Cy5。
12.如权利要求1至3任一项所述的用途，特征在于:样品是肝脏活组织检查样品。
13.如权利要求1至3任一项所述的用途，特征在于:样品是血清、血浆或全血。
14.如权利要求1至3任一项所述的用途，所述试剂盒或诊断设备用于鉴别诊断早期识另O、肝脏疾病的进程预测、严重程度的判断、伴随治疗的进程判断、病因学和体外诊断学。
【文档编号】G01N33/68GK103630693SQ201310424171
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2007年8月10日 优先权日:2006年8月10日
【发明者】沃尔夫·施米格尔, 本斯·西波斯, 克里斯蒂安·默勒肯, 京特·克勒佩尔, 赫尔穆特·E·迈耶, 巴巴拉·斯泰克, 凯·斯图勒 申请人:凯·施蒂勒, 沃尔夫·施米格尔, 本斯·西波斯, 赫尔穆特·E·迈耶, 芭芭拉·西泰克