专利名称：一种生物法多级定向转化邻甲酚的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及用生物法转化邻甲酚类化合物的方法。
背景技术：
甲酚类化合物是酚类化合物中具有代表性的一种物质，是生产杀螟松、倍硫磷、速灭威、二氯苯醚菊酯等杀虫剂以及彩色胶片、树脂、增塑剂和香料合成的中间体，具有强烈的腐蚀性及毒性，被美国EPA列入环境优先控制污染物的名单。关于含甲酚废水的处理方法，与物化法相比较，生物法具有经济、安全、处理阈值低、残留少、无二次污染等方面的优点。目前，人们在无害化生物降解甲酚类化合物研究中，发现在甲酚类化合物污染的土壤、水体中存在的很多细菌、真菌、藻类及水生动植物都具有降解甲酚的能力，在好氧微生物治理过程中，几乎所有的甲酚类化合物被微生物不同程度的氧化/降解为小分子化合物(X)2和H2O。同时，研究发现微生物代谢甲酚类化合物能够形成二醇类、苯甲酸及粘糠酸半醛类中间产物，而这些物质正是现代化工、制药工业中的重要有机中间体，应用前景十分广泛。因此，对邻甲酚及其同系物的污染物的处理可以从传统意义上的降低COD、将污染物完全降解矿化为(X)2和H2O,改变为生成有用中间体的生物转化，以最大程度地实现污染物资源化。2002年，BUhler等利用恶臭假单胞菌Pseudomonas putida mt_2的二甲苯单加氧酶基因工程菌多级转化甲苯和偏甲基苯，分别生成相应的醇和醛。(Characterization and Application of Xylene Monooxygenase for MultistepBiocatalysis. Applied Environmental Microbiology, 2002,68 :560-568)该工程菌对底物的多级转化是通过二甲苯单加氧酶基因对甲基进行三步转化生成相应羧酸。这种多级生物转化方法很难控制各级转化过程，该方法在转化过程中，未转化的底物如甲苯和偏甲基苯抑制了第二步和第三步转化反应，第二步转化所得的相应的醇类抑制了第三步反应，很难实现甲苯和偏甲基苯可控、定向转化。大连理工大学从石化公司污水处理系统二沉池污泥中筛选到的高效苯酚降解菌ArthrcAacter sp. W1，结合生理生化鉴定、菌株的形态观察、Biolog鉴定及16S rDNA 序列分析，该菌株属于ArthrcAacter种属，在GenBank中的注册号为EU339930。曲媛媛等人在 Applied Biochemistry and Biotechnology (159 (3). 623-633，2009)上发表题为“Biodegradation of Mixed PhenolicCompounds Under High Salt Conditions and Salinity Fluctuations byArthrobacter sp. Wl”的文章中提到，该菌能在温度20 30°C， PH 5. O 9. O和盐度10 100g/L NaCl条件下以苯酚为唯一碳源进行生长，能够降解邻甲酚、间甲酚、对甲酚、苯甲酸、水杨酸、对甲基酚、氨基酚、对苯二酚等多种芳香化合物。根据苯酚羟化酶的保守序列合成一对引物，以ArthrcAacter sp. Wl的基因组DNA为模板，通过PCR反应，扩增出的基因保守序列，再根据该苯酚羟化酶基因保守序列，采用染色体步移的方法，获得了总长为^90bp的ArthrcAacter sp. Wl菌株的苯酚羟化酶基因全长序列，其Genbank注册号为FJ610336。由该基因构建的基因工程菌对酚类同系物具有降解作用。大连理工大学从石化公司污水处理系统二沉池污泥中筛选到高效的联苯降解菌株Dyella ginsengisoli sp. LA-4，结合生理生化鉴定、菌株的形态观察、Biolog鉴定及16S rDNA序列分析，该菌株归属于Dyellaginsengisoli种属，其16S rDNA序列在GenBank中的注册号为EF1913M。该菌株已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，入册编号为CGMCC No. 2723。利用染色体步移的方法从菌株LA-4的基因组DNA中扩增得到完整的bph基因簇，全长为12186bp，全序列登录GenBank，序列号为EU258607，其中联苯外二醇双加氧酶基因BphC为bph基因簇中的5281bp到61%bp。由该基因构建的基因工程菌能将3-甲基儿茶酚、儿茶酚、4-氯儿茶酚和4-甲基儿茶酚转化为相应的粘康酸类物质。上述两种菌株的发现及其相关基因工程菌的构建，为邻甲酚类化合物的生物转化提供了有效的微生物资源。
发明内容
本发明的目的，是提供一种利用苯酚羟化酶基因工程菌PH_ind和联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，实现邻甲酚可控的、多级定向转化的方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种生物法多级定向转化邻甲酚方法，其特征在于，采用苯酚羟化酶基因工程菌 PH_IND全细胞，对邻甲酚进行第一级生物转化，得到的产物为3-甲基儿茶酚，然后采用联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_LA-4全细胞，对3-甲基儿茶酚进行第二级生物转化；生物转化反应液成分和含量及反应条件为第一级生物转化反应时，反应液中苯酚羟化酶基因工程菌PH_IND全细胞干重为 20 40g/L，邻甲酚浓度为50 700mg/L，葡萄糖浓度为5 40mmol/L ；在20 40°C温度下，控制摇床转速为50 200r/min，振荡反应时间为10 MOmin ；第二级生物转化反应时，在第一级生物转化反应后的反应液中加入全细胞干重为20 40g/L的联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，在20 40°C温度下，控制摇床转速为50 200r/min，振荡反应时间为5 50min。苯酚羟化酶基因工程菌PH_ind是通过获取高效苯酚降解菌ArthrcAactersp. Wl中苯酚羟化酶基因全长序列，连接至载体质粒(pET28a (+) Vector)，并转化至宿主细胞大肠杆菌中构建的，该工程菌PH_ind经扩大培养即得全细胞培养物，能够作为全细胞催化剂对邻甲酚及其同系物进行生物转化。高效苯酚降解菌ArthrcAacter sp. Wl是从石化公司污水处理系统二沉池污泥中筛选到的，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,入册编号为CGMCC No. 4763，该菌株的16SrDNA序列的GenBank注册号为EU339930 ；通过PCR反应，扩增获得高效苯酚降解菌ArthrcAacter sp. Wl的苯酚羟化酶基因保守区序列，并采用染色体步移法获取未知的侧翼序列，得到含有6个阅读框、按KLMNOP六组分顺序排列的M90bp苯酚羟化酶基因全长序列，其Genbank注册号为FJ610336。联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_LA_4，是通过获取高效联苯降解菌Dyella ginsengisoli LA-4中的联苯外二醇双加氧酶基因，连接至载体质粒(pEI^8a(+) Vector)， 并转化至宿主细胞大肠杆菌中构建的，该工程菌BphC_LA-4经扩大培养即得全细胞培养物，能够将3-甲基儿茶酚及其同系物转化为粘糠酸类物质；高效联苯降解菌株Dyella ginsengisoli sp. LA-4是从石化公司污水处理系统二沉池污泥中筛选到的，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，入册编号为CGMCC No. 2723，该菌株的 IBSrDNA序列的GenBank注册号为EF191354，利用染色体步移的方法从该菌株的基因组DNA 中扩增得到完整的bph基因簇，全长为12186bp，其Genbank注册号为EU258607，其中联苯外二醇双加氧酶基因BphC为bph基因簇中的5281bp到61%bp。上述第一级生物转化是通过工程菌PH_ind的苯酚羟化酶作用，将邻甲酚转化为 3-甲基儿茶酚，第二级生物转化是通过工程菌BphC_LA_4的联苯外二醇双加氧酶作用，将 3-甲基儿茶酚转化为粘糠酸类物质。生物转化的反应液成分、含量和反应条件最佳参数为第一级生物转化反应时，反应液中苯酚羟化酶基因工程菌PH_ind全细胞干重为35 40g/L，邻甲酚浓度为75 125mg/ L,葡萄糖浓度为15 20mmol/L，在25 35°C温度下，控制摇床转速为100 180r/min，振荡反应时间为180 MOmin ；第二级生物转化反应时，在第一级生物转化反应后的反应液中加入全细胞干重为30 35g/L的联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，在25 35°C温度下，控制摇床转速为100 180r/min，振荡反应时间为30 40min。生物转化反应前，苯酚羟化酶基因工程菌PH_ind和的联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_LA-4的扩大培养按常规条件进行。扩大培养苯酚羟化酶基因工程菌PH_im时，首先将工程菌PH_im接种到固体平板 LB培养基上培养(即平板活化种子)，再将其接种到液体LB培养基中，制得种子培养液， 然后按体积百分比2 5%的接种量接入液体LB培养基中振荡培养，待菌体生长至对数期 OD600 = 0 . 4 0. 6，加入80 100 μ L (8 10mmol/L)的IPTG，诱导2h，离心收集菌体，经 PH值为7. 0 7. 5、浓度为0. 1 0. 2mol/L的磷酸缓冲液洗涤，然后用相同缓冲液悬浮，使其全细胞干重达到20 40g/L。扩大培养工程菌BphC_LA_4的条件与工程菌PH_IND的基本相同，但在加入80 100 μ L (8 10mmol/L)的IPTG后需诱导3h，再离心收集菌体。本发明的多级定向转化邻甲酚的方法反应条件温和、产物单一、提取步骤简单，可对产物进行资源化回收利用，使生产过程定向可控，生产周期短，成本低，生产清洁，适合工业生产和应用。该方法也可以用于多级定向转化邻甲酚的同系物对甲酚和间甲酚。
图1为本发明第一级生物转化反应时，3-甲基儿茶酚的生成量(mg/mL)随工程菌 PH_IND全细胞干重(g/L)变化的曲线，其他参数不变。图2为本发明第二级生物转化反应时，3-甲基儿茶酚的转化率(％ )随工程菌 BphC_LA-4全细胞干重(g/L)变化的曲线，其他参数不变。图3为本发明生物转化反应时3-甲基儿茶酚的生成量(曲线a，mg/L)和3_甲基儿茶酚转化率(曲线b，%)随邻甲酚浓度(mg/L)变化的曲线，其他参数不变。图4为本发明生物转化反应时3-甲基儿茶酚的生成量(mg/L)随时间变化的曲线，其他参数不变。图5为本发明生物转化反应时3-甲基儿茶酚转化率(％ )随时间变化的曲线，其他参数不变。
本发明涉及的高效联苯降解菌的生物保藏信息保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区大屯路、中国科学院微生物研究所，日期为 2008 年 10 月 24 日，编号 CGMCC No. 2723，分类命名为=Dyella ginsengisoli ；
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1，苯酚羟化酶基因工程菌PH_ind和联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多级定向转化邻甲酚，并考察部分参数对3-甲基儿茶酚的生成量和转化率的影响。工程菌PH_ind和工程菌BphC_LA_4扩大培养的培养基均为LB培养基，配方为 10g/L NaCl, 10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，调节pH至7. 0 7. 2，121°C条件下灭菌 20min，培养基冷却后添加终浓度为10 20mmol/L卡那霉素作为抗生素。固体平板培养基配方为LB培养基基础上添加15 20g/L琼脂。基因工程菌的扩大培养和生物转化邻甲酚反应步骤和参数如下1、分别将工程菌ΡΗ_ΙΝΙ^Π工程菌BphC_LA_4接种到固体平板LB培养基上，于 37°C静置培养2天，4°C冰箱保存，作为平板活化种子；2、将步骤1所得的工程菌PH_im和工程菌BphC_LA_4的平板活化种子分别接种到液体LB培养基中，在30°C下150r/min振荡培养12h，制得种子培养液；3、使用步骤2所得的工程菌PH_im种子培养液，按体积百分比2 5%的接种量接入液体LB培养基中振荡培养，待菌体生长至对数期(0D· = 0. 4 0. 6)，加入80 100 μ L (8 10mmol/L)的IPTG，诱导2h，诱导至OD600 = 1. 0 1. 2，离心收集菌体，经pH 值为7. 0 7. 5、浓度为0. 1 0. 2mol/L的磷酸缓冲液洗涤，然后用相同缓冲液悬浮，使其干重为35g/L ；使用步骤2所得的工程菌BphC_LA-4种子培养液，按体积百分比2 5% 的接种量接入液体LB培养基中振荡培养，待菌体生长至对数期(0D_ = 0. 4 0. 6)，加入 80 100 μ L (8 10mmol/L)的IPTG，诱导3h，离心收集菌体，经pH值为7. 0 7. 5、浓度为0. 1 0. 2mol/L的磷酸缓冲液洗涤，然后用相同缓冲液悬浮，使其干重为30g/L ；4、制备邻甲酚溶液(IOg邻甲酚溶于IOOmL无菌水)，然后用滤膜过滤除菌，使溶液中邻甲酚浓度为lX105mg/L;5、制备葡萄糖储备液，取198. 16g葡萄糖溶于IL去离子水，储备液中葡萄糖浓度为 lmol/L ；6、第一级生物转化反应在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制备出的工程菌PH_ IND全细胞、步骤4制备出的邻甲酚溶液20 μ L、步骤5制备出的葡萄糖储备液400 μ L，使反应液中邻甲酚的浓度为100mg/L，葡萄糖的浓度为20mmol/L(加入邻甲酚和葡萄糖后反应液中的工程菌PH_ind全细胞干重变化很小，可以忽略不计)，在30°C下，摇床转速150r/min， 振荡反应180min ；7、第二级生物转化反应在第一级生物转化后的反应液中加入5mL全细胞干重为 30g/L的工程菌BphC_LA-4，在30°C温度下，控制摇床转速在150r/min，振荡反应30min。测定3-甲基儿茶酚的生成量和3-甲基儿茶酚转化率第一级生物转化反应结束时，取2mL反应液，利用浓盐酸调节反应液pH值至2. 0， 然后以等体积的乙醚萃取2次，用旋转蒸发器浓缩蒸干，放入-20°C冰箱备用。检测时以氯仿(液体)二甲基甲酰胺(液体)=2 1(体积比，共3mL)回溶旋转蒸发器浓缩蒸干的产物，并用0. 22 μ m有机膜过滤；第二级生物转化反应结束时，取2mL反应液，利用浓盐酸调节反应液PH值至2. 0，然后以等体积的乙醚萃取2次，用旋转蒸发器浓缩蒸干，放入_20°C 冰箱备用。检测时以氯仿(液体)二甲基甲酰胺(液体)=2 1(体积比，共3mL)回溶旋转蒸发器浓缩蒸干的产物，并用0. 22 μ m有机膜过滤；利用Agilent 1100高效液相色谱仪检测第一、二级反应萃取液，检测波长276nm，流速1. OmL/min，进样量为10 μ L，柱温为室温；流动相A为甲醇，流动相B为超纯水。每个样品的测定时间为30min，其中第1 20min 时，流动相A为30 40%，流动相B为70 60%，第20. 10 30min时流动相A为30%， 流动相B为70%。测得第一级生物转化反应3-甲基儿茶酚的生成量为83. 51mg/L，第二级生物转化反应3-甲基儿茶酚的转化率为99%。最后，就全细胞干重、邻甲酚浓度、反应时间对3-甲基儿茶酚的生成量、3-甲基儿茶酚的转化率的影响进行实验，结果如下1)当其他参数采用本实施例的数值时，3-甲基儿茶酚的生成量随工程菌PH_ind全细胞干重变化的曲线如图1所示。2)当其他参数采用本实施例的数值时，3-甲基儿茶酚转化率随工程菌BphC_LA_4 全细胞干重变化的曲线如图2所示。3)当其他参数采用本实施例的数值时，3-甲基儿茶酚的生成量和3-甲基儿茶酚转化率随邻甲酚浓度变化的曲线如图3 (a, b)所示。如图3 (a)所示，当邻甲酚浓度为IOOmg/ L时，3-甲基儿茶酚的生成量最大；从图3(b)可以看出，3-甲基儿茶酚转化率均在98%以上。4)当其他参数采用本实施例的数值时，3-甲基儿茶酚的生成量和3-甲基儿茶酚转化率随时间变化的曲线如图4和图5所示。实施例2，苯酚羟化酶基因工程菌PH_ind和联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多级定向转化邻甲酚。LB培养基配方及基因工程菌的扩大培养和生物转化邻甲酚反应步骤1 5同实施例1，通过控制所收集的菌体质量使步骤3制得的工程菌PH_ind全细胞干重为20g/L，工程菌BphC_LA-4全细胞干重为25g/L。第一级生物转化反应在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的工程菌PH_IND 全细胞，步骤4制备的邻甲酚溶液15 μ L，步骤5制备的葡萄糖储备液600 μ L，使反应液中邻甲酚的浓度为50mg/L，葡萄糖的浓度为30mmol/L，在40°C下，摇床转速180r/min，振荡反应 60mino第二级生物转化反应在第一级生物转化后的反应液中加入5mL全细胞干重为 25g/L的工程菌BphC_LA-4，在40°C温度下，控制摇床转速在180r/min，振荡反应5min。按实施例1所述的测量方法，测得第一级生物转化反应3-甲基儿茶酚的生成量为 30. 51mg/L，第二级生物转化反应3-甲基儿茶酚的转化率为84%。实施例3，苯酚羟化酶基因工程菌PH_ind和联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多级定向转化邻甲酚。LB培养基配方及基因工程菌的扩大培养和生物转化邻甲酚反应步骤1 5同实施例1，其中步骤3制得的工程菌PH_ind全细胞干重为25g/L，工程菌BphC_LA-4全细胞干重为 20g/L。第一级生物转化反应在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的工程菌PH_IND 全细胞，步骤4制备的邻甲酚溶液40 μ L，步骤5制备的葡萄糖储备液100 μ L，使反应液中邻甲酚的浓度为200mg/L，葡萄糖的浓度为5mmol/L，在35°C下，摇床转速200r/min，振荡反应 240min ；第二级生物转化反应在第一级生物转化后的反应液中加入5mL全细胞干重为 20g/L的工程菌BphC_LA-4，在35°C温度下，控制摇床转速200r/min，振荡反应50min。按实施例1所述的测量方法，测得第一级生物转化反应3-甲基儿茶酚的生成量 44. 38mg/L，第二级生物转化反应3-甲基儿茶酚的转化率95%。实施例4，苯酚羟化酶基因工程菌PH_ind和联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多级定向转化邻甲酚。LB培养基配方及基因工程菌的扩大培养和生物转化邻甲酚反应步骤1 5同实施例1，其中步骤3制得的工程菌PH_ind全细胞干重为30g/L，工程菌BphC_LA-4全细胞干重为 40g/L。第一级生物转化反应在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的工程菌PH_IND 全细胞，步骤4制备的邻甲酚溶液140 μ L，步骤5制备的葡萄糖储备液300 μ L，使反应液中邻甲酚的浓度为700mg/L，葡萄糖的浓度为15mmol/L，在25°C下，摇床转速50r/min，振荡反应 120min ；第二级生物转化反应在第一级生物转化后的反应液中加入5mL全细胞干重为 40g/L的工程菌BphC_LA-4，在25°C温度下，控制摇床转速在50r/min，振荡反应20min。按实施例1所述的测量方法，测得第一级生物转化反应3-甲基儿茶酚的生成量 17. 45mg/L，第二级生物转化反应3-甲基儿茶酚的转化率98%。实施例5，苯酚羟化酶基因工程菌PH_ind和联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_ LA-4多级定向转化邻甲酚。LB培养基配方及基因工程菌的扩大培养和生物转化邻甲酚反应步骤1 5同实施例1，其中步骤3制得的工程菌PH_ind全细胞干重为40g/L，工程菌BphC_LA-4全细胞干重为 35g/L。第一级生物转化反应在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的工程菌PH_IND 全细胞，步骤4制备的邻甲酚溶液40 μ L，步骤5制备的葡萄糖储备液400 μ L，使反应液中邻甲酚的浓度为125mg/L，葡萄糖的浓度为40mmol/L，在20°C下，摇床转速lOOr/min，振荡反应IOmin ；第二级生物转化反应在第一级生物转化后的反应液中加入5mL全细胞干重为 35g/L的工程菌BphC_LA-4，在20°C温度下，控制摇床转速在lOOr/min，振荡反应40min。按实施例1所述的测量方法，测得第一级生物转化反应3-甲基儿茶酚的生成量 10. 56mg/L，第二级生物转化反应3-甲基儿茶酚的转化率98%。
权利要求
1.一种生物法多级定向转化邻甲酚的方法，其特征在于，采用苯酚羟化酶基因工程菌 PH_IND全细胞，对邻甲酚进行第一级生物转化，得到的产物为3-甲基儿茶酚，再采用联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_LA-4全细胞，对3-甲基儿茶酚进行第二级生物转化；苯酚羟化酶基因工程菌PH_im是通过获取中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心入册编号为CGMCC No. 4763的高效苯酚降解菌Arthrobacter sp. Wl中总长为5490bp、Genbank 注册号为FJ610336的苯酚羟化酶基因全长序列，连接至载体质粒(pED8a(+) Vector)，并转化至宿主细胞大肠杆菌中构建的；联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_LA-4是通过获取中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心入册编号为CGMCC No. 2723的高效联苯降解菌Dyella ginsengisoli LA-4中的联苯外二醇双加氧酶基因，连接至载体质粒 (pET28a(+) Vector)，并转化至宿主细胞大肠杆菌中构建的；生物转化的反应液成分和含量及反应条件为第一级生物转化反应时，反应液中苯酚羟化酶基因工程菌PH_IND全细胞干重为20 40g/L，邻甲酚浓度为50 700mg/L，葡萄糖浓度为5 40mmol/L，在20 40°C温度下，控制摇床转速为50 200r/min，振荡反应时间为10 MOmin ；第二级生物转化反应时，在第一级生物转化反应后的反应液中加入全细胞干重为20 40g/L的联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，在20 40°C温度下，控制摇床转速为50 200r/min，振荡反应时间为 5 50min。
2.如权利要求1所述的生物法多级定向转化邻甲酚的方法，其特征在于，生物转化的反应液成分和含量及反应条件为第一级生物转化反应时，反应液中苯酚羟化酶基因工程菌PH_ind全细胞干重为35 40g/L，邻甲酚浓度为75 125mg/L，葡萄糖浓度为15 20mmol/L，在25 35°C温度下，控制摇床转速为100 180r/min，振荡反应时间为180 240min ；第二级生物转化反应时，在第一级生物转化反应后的反应液中加入全细胞干重为 30 35g/L的联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，在25 35°C温度下，控制摇床转速为100 180r/min，振荡反应时间为30 40min。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及用生物法转化邻甲酚类化合物。其特征在于，第一级生物转化反应时，反应液中苯酚羟化酶基因工程菌PH IND全细胞干重为20～40g/L，邻甲酚浓度为50～700mg/L，葡萄糖浓度为5～40mmol/L，在20～40℃温度下，控制摇床转速为50～200r/min，振荡反应时间为10～240min，得到的产物为3-甲基儿茶酚；第二级生物转化反应时，在反应液中加入全细胞干重为20～40g/L的联苯外二醇双加氧酶基因工程菌BphC_LA-4，控制摇床转速为50～200r/min，振荡反应时间为5～50min。本发明反应条件温和，产物单一，提取步骤简单，可对产物进行资源回收利用，适合工业生产和应用。
文档编号C12P7/44GK102226205SQ20111011835
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月9日 优先权日2011年5月9日
发明者周豪, 周集体, 孔春雷, 张旭旺, 张瑞杰, 时胜男, 曲媛媛, 李新亮, 许炳雯, 马桥 申请人:大连理工大学