专利名称：：培育高蛋氨酸转基因植物方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种培育高蛋氨酸转基因植物方法。
背景技术：
：蛋氨酸是人类和动物所必需氨基酸之一。大豆(Glycinemax(L.)Merr.)作为优质高蛋白作物，其含硫氨基酸尤其是蛋氨酸含量偏低。通过常规育种方法进行高蛋氨酸品种培育存在较大的困难，因此需要借助分子育种手段来解决这一瓶颈问题。拟南芥CGS基因编码蛋氨酸合成过程中的关键酶一胱硫醚Y-合成酶，可促进游离蛋氨酸的合成。拟南芥D-AyCGS基因是CGS基因的氮端部分缺失形式，它具有对反馈抑制的不敏感性，通过对该基因在拟南芥中的过表达，能够大幅度提高植株游离蛋氨酸的含量。叶片是蛋氨酸合成的主要场所，因此，通过D-AtCGS的组成型表达，可使叶片中蛋氨酸大量合成，扩大了蛋氨酸的“源”，更利于大豆籽粒“库”中蛋氨酸的积累。同时也有报道认为大豆籽粒中也可进行游离蛋氨酸的合成，提高籽粒中蛋氨酸的含量。
发明内容本发明的一个目的是提供一种培育高蛋氨酸转基因植物方法。本发明提供的方法，为将D-AtCGS蛋白的编码基因导入目的植物，得到转基因植物，所述转基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述D-AtCGS蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I。所述转基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物为如下I)或2):所述转基因植物籽粒中的游离氨基酸含量高于所述目的植物；所述转基因植物籽粒中的总氨基酸含量高于所述目的植物。所述游离氨基酸为游离蛋氨酸、游离丙氨酸(Alanine)、游离缬氨酸(Valine)、游离丝氨酸(Serine)、游离亮氨酸(Leucine)、游离苏氨酸(Threonine)、游离异亮氨酸(Isoleucine)、游离脯氨酸(Proline)、游离甘氨酸(Glycine)、游离高丝氨酸(Homoserine)、游离蛋氨酸(Methionine)、游离天冬氨酸(Aspartate)、游离苯基丙氨酸(Phenylalanine)、游离半胱氨酸(Cysteine)、游离谷氨酸盐(Glutamate)、游离高半胱氨酸(Homocysteine)、游离天冬酰胺酸(Asparagine)、游离赖氨酸(Lysine)、游离酪氨酸(Tyrosine)和/或游离色氨酸(Tryptophan)。所述D-AtCGS蛋白的编码基因通过植物表达载体导入所述目的植物；所述植物表达载体为pLEG-DCGS；所述pLEG-DCGS按照如下方法构建I)将启动子leguminB4插入pGPTV-Bar的HindIII和NcoI酶切位点间得到中间载体；2)将D-AtCGS蛋白的编码基因插入步骤I)得到的中间载体的NcoI和XbaI酶切位点间得到的重组载体。所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，优选为双子叶植物；所述双子叶植物具体为大豆。大豆为自贡冬豆、吉林小粒I号大豆。本发明的另一个目的是提供一种培育高蛋氨酸转基因植物方法。本发明提供的方法，为将D-AtCGS蛋白的编码基因导入目的植物，得到转基因植物，所述转基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述D-AtCGS蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I;所述转基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物为所述转基因植物叶片中的游离蛋氨酸的含量高于所述目的植物。所述D-AtCGS蛋白的编码基因通过植物表达载体导入所述目的植物；所述植物表达载体按照如下方法制备DpBIN-TMTL经HindIII和BamHI，回收750bp小片段；2)将步骤I)得到的750bp小片段插入pET-28a的HindIII和BAmHI识别位点间，得到中间载体A;3)将D-AtCGS蛋白的编码基因插入步骤2)得到的中间载体A的NcoI和XbaI识另Ij位点，得到中间载体B;4)将中间载体B经HindIII和XbaI酶切得到3.3kb的片段插入pTFlOl.I的HindIII和XbaI识别位点间得到的重组载体。所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，优选为双子叶植物；所述双子叶植物具体为大豆。大豆品种为自贡冬豆或吉林小粒I号。本发明的实验证明，通过分别构建含有拟南芥D-AtCGS基因的种子特异性植物表达载体和组成型植物表达载体，采用农杆菌介导的子叶节转化方法，将氮端部分缺失的拟南介CGS基因导入吉林小粒I号和晚熟大ii品种自贝冬ii中，以实现大ii杆粒游尚蛋氣酸含量的提高，并获得大豆全株蛋氨酸含量提高的大豆品系。通过草丁膦涂抹和PCR检测转基因阳性植株进行鉴定，并对转基因后代进行了相应的草丁膦抗性实验和分子检测，获得了生长正常的转基因阳性植株，为大豆分子育种工作提供优异育种材料。图I为pLEG-DCGS质粒部分结果示意2为pET-DCGS亚克隆的构建流程图3为pTF-DCGS载体的构建流程图4为农杆菌介导的大豆子叶节转化流程图5为T2代转D-AtCGS自贡冬豆植株(pLEG-DCGS)草丁膦涂抹检测结果图6为T2代转D-AtCGS吉林小粒I号植株(pLEG-DCGS)草丁膦涂抹检测结果图7为转化植株的PCR检测图8为SouthernBlot检测结果图9为SouthernBlot检测结果图10为WesternBlot检测结果图11为转D-AtCGS基因植株的种子游离蛋氨酸含量图12为转D-AtCGS植株的种子总蛋氨酸含量图13为Ttl代转D-AtCGS吉林小粒I号植株(pTF_DCGS)涂抹实验图14为草丁膦阳性Ttl代转D-AtCGS自贡冬豆植株(pTF-DCGS)的PCR检测图15为PCR检测阳性Ttl代转D-AtCGS自贡冬豆植株(pTF-DCGS)成熟期的短日处理图16为T1代转D-AtCGS自贡冬豆植株(pTF-DCGS)涂抹实验图17为T1代转D-AtCGS自贡冬豆植株(pTF-DCGS)PCR检测图18为T1代转D-AtCGS自贡冬豆植株(pTF-DCGS)RT-PCR检测图19为组成型转基因植株的WesternBlot结果图20为组成型转基因植株的蛋氨酸含量具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、种子特异性表达载体和组成型的转化载体的获得大豆受体材料转化实验采用的大豆(Glycinemax(L.)Merr.)受体品种为自贡冬豆、吉林小粒I号；吉林小粒I号记载在郑惠玉，杨兆宇，韩春凤，孙运岭，利用野生大豆(G.soja)种质育成小粒大豆新品种“吉林小粒I号”的选育报告，吉林农业科学，1991，03-0029-11中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。自贡冬豆(Zigongdongdou)记载在DongCao,WenshengHou,ShikuiSong,HongboSun，CunxiangWu,YongshengGao,TianfuHan.AssessmentofconditionsaffectingAgrobacteriumrhizogenes-mediatedtransformationofsoybean.PlantCellTissueOrganCulture(2009)96:45-52中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。菌株实验使用的大肠杆菌菌株为DH5a(购于百泰克公司)。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHAlOl记载在HoodEE.，HelmerGL，FraleyRT，ChiltonM-D.ThehypervirulenceofAgrobacteriumtumefaciensA281isencodedinaregionofpTiBo542outsideofT-DNA[J].JBacteriol，1986，168:1291-1301.中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens)EHA105记载在PazMM，MartinezJC，KalvigAB，FongerTM，KanW.ImprovedcotyledonarynodemethodusinganalternativeexplantderivedfrommatureseedforefficientAgrobacterium-mediated[J].PlantCellRep,2006,25:206-213.中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。I、种子特异性表达载体pLEG-DCGS将拟南芥CGS基因的氮端部分缺失即为D-AtCGS基因，其核苷酸序列为序列表中的序列1，其氨基酸序列为序列表中的序列2，可人工合成。启动子为leguminB4(accessionnoX03677的第1534-2766位核音酸。)，插ApGPTV-Bar(DetlefBecker,ElkeKemper,JeffSchellandRobertMasterson.NewplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftT-DNAborder.1992.PlantMolecularBiology20:1195-1197,公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)的HindIII和NcoI酶切位点间，得到中间载体。再将D-AtCGS基因插入中间载体的NcoI和XbaI酶切位点间，得到重组质粒。将重组质粒送去测序，结果为将序列表中的序列I(序列表中的序列I)插入pGPTV-Bar的NcoI和XbaI酶切位点间得到的载体，将该载体命名为pLEG-DCGS，该载体中含有目的基因D-AtCGS及基于Bar基因的植物抗性筛选标记表达盒。pLEG-DCGS的结构示意图如图I所/Jno2、组成型的转化载体pTF-DCGS将pBIN_TMTL(记载在王庆中，转BoTMT基因大豆的获得及鉴定，中国农业科学院硕士学位论文，2006中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)经HindIII和BamHI，回收750bp的小片段，即为启动子D35S::Q。将启动子D35S::Q与经过HindIII和BamHI酶切的pET_28a(Novagen公司，cat.NO.69864-3)连接，得到pET_D35S::Q；将pLEG-DCGS经NcoI和XbaI酶切，得到2.4kb的目的片段(D-AtCGS)，将该片段与经过同样酶切的pET-D35S::Q载体骨架连接，得到PET-D35S-DCG，构建流程如图2所示；将pET-D35S-DCG经HindIII和XbaI酶切，得到3.3kb的片段(D35S::Q、中间序列和D-AtCGS)，将该片段与经过同样酶切的pTFlOl.I(记载在Paz，M.，Martinez,J.C.,Kalvig,A.,Fonger,T.,Wang,K.ImprovedcotyledonarynodemethodusinganalternativeexplantderivedfrommatureseedforefficientAgrobacterium-mediatedsoybeantransformation.PlantCe11Reports,25:206-213(2006)中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)载体骨架连接，将连接产物转入大肠杆菌，得到转化子，将转化子提取质粒。将质粒用HindIII和XbaI酶切，得到3.3bp目的片段的片段的为阳性质粒。将阳性质粒送去测序,结果为将含有序列表中的序列I的DNA分子(该DNA分子由D35S::Q启动子、中间序列和D-AtCGS组成)插入pTFlOl.I的HindIII和XbaI酶切位点间得到的载体，将该载体命名为PTF-DCGS，构建流程如图3所示，中间序列为序列表中的序列3自5’末端第7-98位核苷酸。实施例2、转D-AtCGS大豆的获得及功能研究I、自贡冬豆和吉林小粒I号种子灭菌分别挑选无病害、无裂痕、饱满的自贡冬豆(以下称为野生型自贡冬豆)和吉林小粒I号大豆(以下称为野生型吉林小粒I号)种子，将种子平铺于干燥器中的培养皿中。干燥器中放置装有IOOml次氯酸钠溶液的烧杯，沿壁缓缓加入4ml12mol/L的盐酸，迅速关闭干燥器顶盖，使大豆种子在氯气中灭菌12h。灭菌后的种子放入超净工作台释放残余氯气，并将种子接种于发芽培养基上，盖上培养皿盖子，不封口，放入培养间，温度24°C，光照时数18h，自贡冬豆发芽4天，吉林小粒I号发芽5天，得到自贡冬豆外植体和吉林小粒I号外植体，用于转化。转化相关培养基I)发芽培养基(GM)GamborgB5basesalt+Sucrose20mg/L，pH5.8，Agar7.6g/L02)共培养培养基(CCM)l/10GamborgB5basesalt+GamborgB5Vitamin+MES3.9g/L+BAPI.6mg/L+GA30.25ml/L+AS0.04g/L+DTT150mg/L+Cys400mg/L+Sucrose30g/L+Washedagar8g/L，pH5.4。3)芽诱导培养基(SIM)GamborgB5salt+BAPI.6mg/L+Sucrose20g/L+MES3mM+PhytageI3g/L，pH5.I,Cefotaxime200mg/L，Timentin50mg/Lo4)伸长培养基(SEM)MSbasesalt+GamborgB5Vitamin+MES3mM+Asplml/L+Glulml/L+IAA300ug/L+Zeatin-Rlmg/L+GA3500ug/L+Sucrose20mg/L+Phytagel3g/L,pH5.I,Cefotaxime200mg/L，Timentin50mg/Lo5)生根培养基(RM)MSbasesalt+GamborgB5Vitamin+MES3mM+Asplml/L+Glulml/L，Agar8g/L，pH5.6,Cefotaxime200mg/L，Timentin50mg/Lo6)大肠杆菌培养基(LB)Yeastextract5g/L+TryptonelOg/L+Nacl10g/L，(Agar15g/L)，pH7.0。7)农杆菌培养基(YEP)YeastextractlOg/L+TryptonelOg/L+Nacl5g/L，(Agar15g/L)，pH7.0。培养基组成如下表I所示表I培养基各成分权利要求1.一种培育高蛋氨酸转基因植物方法，为将D-AtCGS蛋白的编码基因导入目的植物，得到转基因植物，所述转基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述D-AtCGS蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I。3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述转基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物为如下I)或2):所述转基因植物籽粒中的游离氨基酸含量高于所述目的植物；所述转基因植物籽粒中的总氨基酸含量高于所述目的植物。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述游离氨基酸为游离蛋氨酸、游离丙氨酸、游离缬氨酸、游离丝氨酸、游离亮氨酸、游离苏氨酸、游离异亮氨酸、游离脯氨酸、游离甘氨酸、游离高丝氨酸、游离蛋氨酸、游离天冬氨酸、游离苯基丙氨酸、游离半胱氨酸、游离谷氨酸盐、游离高半胱氨酸、游离天冬酰胺酸、游离赖氨酸、游离酪氨酸和/或游离色氨酸。5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述D-AtCGS蛋白的编码基因通过植物表达载体导入所述目的植物；所述植物表达载体为pLEG-DCGS；所述pLEG-DCGS按照如下方法构建1)将启动子leguminB4插入pGPTV_Bar的多克隆位点得到中间载体；2)将D-AtCGS蛋白的编码基因插入步骤I)得到的中间载体的多克隆位点得到的重组载体。6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，优选为双子叶植物；所述双子叶植物具体为大豆。7.一种培育高蛋氨酸转基因植物方法，为将D-AtCGS蛋白的编码基因导入目的植物，得到转基因植物，所述转基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述D-AtCGS蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列I;所述转基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物为所述转基因植物叶片中的游离蛋氨酸的含量高于所述目的植物。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述D-AtCGS蛋白的编码基因通过植物表达载体导入所述目的植物；所述植物表达载体按照如下方法制备DpBIN-TMTL经HindIII和BamHI，回收750bp小片段；2)将步骤I)得到的小片段插入pET-28a的多克隆位点间，得到中间载体A;3)将D-AtCGS蛋白的编码基因插入步骤2)得到的中间载体A的多克隆位点，得到中间载体B;4)将中间载体B经HindIII和XbaI酶切得到3.3kb的片段的片段插入pTFlOl.I的多克隆位点间得到的重组载体。10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物，优选为双子叶植物；所述双子叶植物具体为大豆。全文摘要本发明公开了一种培育高蛋氨酸转基因植物方法。本发明提供的培育高蛋氨酸转基因植物方法，为将D-AtCGS蛋白的编码基因导入目的植物，得到转基因植物，所述转基因植物的氨基酸含量高于所述目的植物；所述D-AtCGS蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述D-AtCGS蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。本发明通过分别构建含有拟南芥D-AtCGS基因的种子特异性植物表达载体和组成型植物表达载体，采用农杆菌介导的子叶节转化方法，将氮端部分缺失的拟南芥CGS基因导入吉林小粒1号和晚熟大豆品种自贡冬豆中，以实现大豆籽粒游离蛋氨酸含量的提高，并获得大豆全株蛋氨酸含量提高的大豆品系。文档编号C12N15/84GK102776230SQ20111011817公开日2012年11月14日申请日期2011年5月9日优先权日2011年5月9日发明者于洋,伊塔玛·高朵,依法特·马提亚胡,侯文胜,吴存祥,宋时奎,瑞彻尔·埃米尔,韩天富申请人:中国农业科学院作物科学研究所