双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株e2抗原重链抗体vhh和用途
【专利摘要】本发明公开了一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH和用途，以解决现有猪瘟病毒抗原诊断试剂研发过程中存在的无法获得高纯度、高亲和力的抗猪瘟病毒抗体的生产和制备的问题。一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH，所述的抗体具有核苷酸序列：SEQIDNO.1，SEQIDNO.2或SEQIDNO.3。所述的双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH在制备检测猪瘟病毒抗原诊断试剂中的应用。本发明的发明特点是首次获得利用双峰驼筛选获得抗猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株抗原蛋白E2的VHH抗体编码序列；ELISA实验结果表明，E.coli中表达的重组VHH抗体与猪瘟病毒多克隆抗血清具有相同的抗原结合能力，可代替猪瘟病毒多克隆抗体用于猪瘟病毒抗原诊断试剂的研究中。
【专利说明】双峰驼源抗猪瘍兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH和用途
【技术领域】
[0001]本发明属于疫苗领域，具体涉及一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH。
【背景技术】
[0002]猪瘟又称猪霍或者古典猪瘟(Classical swine fever，CSF)，其病原是猪瘟病毒(CSF virus，CSFV)。猪瘟是猪的重要传染病之一，其病理特征是小血管壁变性，导致内脏器官多发性出血、坏死和梗死。我国是养猪大国，预防接种猪瘟兔化弱毒疫苗(C-strain)是防控猪瘟的最有效方式，尽管如此，猪瘟仍是养猪业危害最为严重的传染病之一，在我国预防和控制猪瘟的发生，具有重要的经济意义和社会意义。在CSFV感染的或者C-strain疫苗免疫后的猪体内，特异性抗病毒中和抗体是机体最主要的抗病毒免疫反应，CSFV基因组编码地E2蛋白是机体产生抗猪瘟病毒血清抗体的最主要抗原蛋白，是研制基因工程疫苗和抗原、抗体诊断方法的最重要的候选蛋白。
[0003]1993年，Hamers等首先发现在骆驼和鲨鱼等血清中存在一种天然缺失轻链，仅有重链的IgG2和IgG3型的抗体，其抗原结合位点仅由重链可变区单结构域组成，故也称为单域重链抗体(variable domain of the heavy chain of HCAbs, VHH)。大量研究证实，缺失了轻链和CHl恒定区VHH抗体仍保持同普通IgG抗体相同的生物学功能，并且表现出普通IgG抗体和单克隆不具备的新的生物学功能。VHH抗体拥有更长的抗原互补结合区(CDR3)氨基酸序列，不仅可与抗原表面的抗原表位结合，还能够深入具有裂缝凹陷结构的抗原内部，如酶的活性位点，病毒与宿主细胞结合位点等；因其是分子量小(单克隆抗体的1/10)，所以组织穿透性能力强于常规IgG抗体，研究发现其甚至可以跨过血脑屏障，到达普通IgG抗体分子无法接触的位置，充分发挥VHH抗体的生物学功能；VHH抗体FR2区存在一些不同于常规IgG抗体的亲水性氨基酸，使得VHH抗体在水溶液中具有良好的稳定性，可以实现抗体规模化生产和纯化，获得水溶性好、稳定性强、生物活性和抗体结构更加接近天然抗体的高纯度重组抗体；VHH与抗原结合的亲和力达到纳摩尔级,与单链抗体亲和力相当，该抗体作为一种小型化的基因工程抗体在病原学研究，高敏感性抗原诊断方法领域有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH，以解决现有猪瘟病毒抗原诊断试剂研发过程中存在的无法获得高纯度、高亲和力的抗猪瘟病毒抗体的生产和制备的问题。
[0005]本发明的另一个目的是提供一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH的用途。
[0006]本发明技术方案如下:一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH，其特征在于所述的抗体具有核苷酸序列:SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3。[0007]进一步的，本发明提供一种重组表达载体，含有所述的核苷酸序列。
[0008]进一步的，本发明提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞为含有所述的核苷酸序列的原核细胞。所述的宿主细胞为含有所述的表达载体的原核细胞。
[0009]进一步的，本发明提供一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH在制备检测猪瘟病毒抗原诊断试剂中的应用。 [0010]本发明的发明特点是首次获得利用双峰驼筛选获得抗猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株抗原蛋白E2的VHH抗体编码序列；ELISA实验结果表明，疋coli中表达的重组VHH抗体与猪瘟病毒多克隆抗血清具有相同的抗原结合能力，可代替猪瘟病毒多克隆抗体用于猪瘟病毒抗原诊断试剂的研究中。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为VHH抗体氨基酸特征分析图；
图2为SDS-PAGE分析抗CSFV E2 VHH抗体在疋coli中的表达图；
图 2 中 1:VHH-E2-1 包涵体，2:VHH-E2_1 上清；3:VHH-E2_2 包涵体，4:VHH-E2_2 上清；5 VHH-E2-3包涵体；M:蛋白质标准分子量(由上而下
分子量依次为:75，65，40, 35，14 kDa) ；6:VHH-E2_3上清；7和8:空载体对照；9:未加IPTG对照组；图中箭头指示的是目的条带；
图 3 为 Western blotting 分析 VHH-E2 蛋白图。
【具体实施方式】
[0012]下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0013]实施例1
一、双峰驼免疫、外周血淋巴细胞分离和cDNA合成 1.材料和方法
1.1材料一试验动物、抗原、佐剂
选择两峰年龄在I岁左右的雌性幼双峰驼作为免疫受体动物(这些双峰驼常年散养在甘肃金昌市附近的戈壁滩上，主要是剪驼毛销售。畜主仅在冬季草枯、夏季极度干旱和母驼产羔时召回补充饲草、水和盐，从未接种过任何疫苗，是制备VHH抗体的合适受体动物。)，佐剂用206佐剂，抗原为E2-GST抗原。
[0014]猪瘟兔化弱毒疫苗株(CSFV) E2抗原制备采用现有方法:利用亲和层析方法纯化可溶性E2融合蛋白(GST-tag)作为免疫双峰驼的抗原，筛选特异性重链单域抗体(VHH)的E2抗原。利用SDS-PAGE电泳确定蛋白纯度，通过紫外吸收法定量。
[0015]1.2 方法
用206佐剂和E2-GST抗原等体积充分混匀乳化完全，分别在双峰驼的颈部、双后肢和背部皮下多点注射，首次免疫剂量为300 μ g/次(2mL)，第14天、第21天、第35天、第49天和第54天加强免疫，免疫剂量为200 μ g/次(2mL)。每次免疫前采集静脉血，分离血清,用间接ELISA试验测定血清抗体滴度。双峰驼用E2抗原免疫后，体内抗E2蛋白特异性抗体滴度随着免疫时间延长而逐渐上升，第4次(35天时)免疫后，抗体水平达到最高水平，第5次免疫后抗体滴度无显著提高，根据血清抗体消长特点，第6次免疫后5天采集颈静脉外周血。
[0016]分别采集两峰实验动物外周静脉血各200mL混匀作为样品，然后用3.8%枸橼酸钠作为抗凝剂与样品按1:9的体积比混合，加入淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞(PBMC)，共收集与2 X IO9个淋巴细胞，淋巴细胞按照I X IO8个/管分装，保存在液氮中。用Trizol试剂提取细胞总RNA，反转录合成第一链cDNA，以其作为模板采用扩增VHH的引物(见表1一表达抗E2的VHH抗体序列的引物)，进行3轮PCR扩增得到大小约450bp的特异性VHH片段用于构建噬菌体展示文库。
【权利要求】
1.一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH，其特征在于所述的抗体具有核苷酸序列:SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2 或 SEQ ID N0.3。
2.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的核苷酸序列。
3.一种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求1所述的核苷酸序列的原核细胞。
4.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求2所述的表达载体的原核细胞。
5.权利要求1所述的双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH在制备检测猪瘟病毒抗原诊断试剂.中的应用。
【文档编号】G01N33/569GK103467599SQ201310448137
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】刘湘涛, 尹双辉, 尚佑军, 杨顺利, 田宏, 吴锦艳, 张克山, 刘永杰 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所