一种蛋白质快速定量方法
【专利摘要】本发明公开了一种蛋白质快速定量方法，将目的蛋白与铁氧还蛋白rubredoxin的融合蛋白在宿主菌中表达，利用rubredoxin的吸收光谱特性，直接测定宿主菌裂解后的上清中融合蛋白的含量。该方法不仅可用于检测目的蛋白的可溶表达量，还可以用于筛选合适的蛋白表达条件，以及实时监测目的蛋白的表达情况。本发明方法定量准确，操作简便快速，成本低廉，且适用范围广泛，不受仪器和试剂限制。
【专利说明】一种蛋白质快速定量方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及蛋白质快速定量方法。
【背景技术】
[0002]将外源基因导入大肠杆菌并诱导其表达，是科学研究以及工业生产过程中获得目的蛋白的重要方法之一。该方法首先需要实验者去优化外源基因的表达条件，如选择合适的菌株、载体、表达温度等等，从而提高蛋白质的表达量并帮助其正确折叠，以获得较多的可溶性目的蛋白。另外，在蛋白质的表达过程中，我们需要在合适的时候收集细菌以提取蛋白。表达时间不足，或者表达时间过长导致的蛋白质的降解，都会降低目的蛋白的产率。为此，我们需要实时监测目的蛋白的表达情况。
[0003]一般情况下，为了获得不同条件下以及不同时间点时的表达情况，我们需要收集一定量的细菌，经破碎、离心后，将上清与沉淀分离，测定上清中目的蛋白的含量。但由于上清中还含有许多细菌本身表达的内源性蛋白，通常情况下我们需要进行分离后才能对目的蛋白进行定量。一种传统方法是取上清制备成样品进行蛋白质凝胶电泳，然后测定目的蛋白条带的大小以及灰度。但该方法比较耗时(约2h)，而且要用到一些有毒试剂。另外，细菌内的某些内源性蛋白可能会与目的蛋白的条带重合，从而造成干扰。我们也可以将目的蛋白从上清中提纯出来后再对其进行定量，但这种方法同样耗费大量时间和人力。
[0004]鉴于纯化和分离过程的复杂性，许多研究者致力于寻找更加直接和快速的蛋白质定量方法。如在蛋白上引入His标签，然后利用识别His标签的酶联抗体进行斑点杂交(dot-blotting)实验来检测蛋白质表达水平(Vincentelli, R., S.Canaan, J.0ffant, C.Cambillau and C.Bignon (2005)."Automated expression and solubility screeningof His-tagged proteins in96_well format.^Anal Biochem346 (I): 77-84.X 或在目的蛋白上融合表达一段含双抗原表位的短肽，向细菌裂解后的上清中加入两种分别识别两种表位的单克隆抗体，两种抗体分别用相互之间可以发生荧光共振能量转移的两种荧光标签标记，通过检测均相时间分辨荧光(HTRF)信号的强弱来对蛋白质定量(Enomoto，K.，K.Uwabe, S.Naito, J.0noda, A.Yamauchi, Y.Numata and H.Takemoto (2008)."A doubleepitope tag for quantification of recombinant protein using fluorescenceresonance energy transfer.^Anal Biochem380 (2): 249-256.)。或在 C 端加一半胱;氛酸残基(cystope tagging),蛋白质通过该残基上的巯基与突光素标记的马来酰亚胺通过加成反应偶联在一起，然后利用流式细胞仪检测细胞内荧光强度(Jose，J.and S.vonSchwichow (2004).〃〃Cystope tagging〃for labeling and detection of recombinantprotein expression.^Anal Biochem331 (2):267-274.)。还有研究者利用突光偏振技术(fluorescence polarization, FP),由于带有C-myc标签的蛋白与一种突光素偶联的C-myc短肽竞争结合C-myc抗体时，会降低C_myc短肽-抗体复合物的突光偏振信号，故可利用突光偏振信号的减弱来指示目的蛋白含量(Sun, S.，L.H.Nguyen, 0.HaroldRoss, G.F.HolI is and R.Wynn (2002)."Quantitative analysis of c-myc-taggedprotein in crude cell extracts using fluorescence polarization.〃AnalBiochem307 (2): 287-296.)。GFP等荧光蛋白也被用来监测蛋白质的表达情况，与GFP融合表达的目的蛋白自身的荧光特性可作为检测蛋白质含量的方法(Coleman, M.A.，V.H.Lao,B.ff.Segelke and P.T.Beernink(2004).^High-throughput, fluorescence-based screening for soluble protein expression.〃J Proteome Res3 (5):1024-1032 ；Omoya, K., Z.Kato, E.Matsukuma, A.Li, K.Hashimoto, Y.Yamamoto, H.0hnishi andN.Kondo(2004)."Systematic optimization of active protein expression usingGFP as a folding reporter.^ProteinExprPurif36 (2):327-332 ；Coutard, B., M.Gagnaire, A.A.Guilhon, M.Berro, S.Canaan and C.Bignon (2008).〃Green fluorescentprotein and factorial approach:an effective partnership for screening thesoluble expression of recombinant proteins in Escherichia col1."ProteinExprPurif61(2):184-190.)。
[0005]然而，抗体的制备以及荧光标记等给检测带来新的成本，某些方法用到的仪器和试剂使得其适用性受限。另外，GFP蛋白在大肠杆菌中表达时易形成包涵体，从而影响目的蛋白的表达，作为一个融合标签其应用受到限制。
[0006]铁氧还蛋白rubredoxin是一种6KDa大小的含铁的蛋白质，当Fe为+2价时rubredoxin无色，当Fe为+3价时rubredoxin呈红色,此时它在380nm和491nm附近各有一个吸收峰。Rubredoxin自身在大肠杆菌中表达时可溶表达量很高,也可作为一种标签蛋白帮助目的蛋白表达，同时利用rubredoxin的颜色可以使融合蛋白的表达和纯化更加方便(Kohli, B.M.and C.0stermeier(2003).〃A Rubredoxin based system for screeningof protein expression conditions and on-line monitoring of the purificationprocess."Protein ExprPurif28 (2):362-367.)。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于`利用rubredoxin的吸收光谱特性,提供一种更加快速、准确、低成本、适用范围广泛、不受仪器和试剂限制的蛋白定量方法。该方法可用于检测目的蛋白可溶表达量，筛选合适的表达条件，以及实时监测目的蛋白的表达情况。
[0008]本发明的蛋白质定量方法，是将目的蛋白与铁氧还蛋白rubredoxin的融合蛋白在宿主菌中表达，利用rubredoxin的吸收光谱特性，直接测定宿主菌裂解后的上清中融合蛋白的含量，从而得到目的蛋白的可溶表达量。其中所述宿主菌优选为大肠杆菌。
[0009]本发明的蛋白质定量方法的实现需要将待测蛋白质与rubredoxin融合表达。
[0010]所述rubredoxin的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:l所示。rubredoxin的编码基因可以是序列表中SEQ ID No:2所示的DNA分子。当然，由于密码子的简并性，其它与SEQ ID No:2所示核苷酸序列同源且编码相同氨基酸序列的DNA分子也可用于构建目的蛋白和rubredoxin的融合蛋白表达载体。
[0011]下面以大肠杆菌为宿主菌为例，说明本发明的蛋白质定量方法的依据和原理。
[0012]一、本发明的蛋白质定量方法依据以下发现:
[0013]I)氧化态rubredoxin在491nm附近有一吸收峰(图2A),而且其在460_520nm范围内的吸光曲线近似为对称抛物线，在472nm和510nm处的吸光系数相同；[0014]2)大肠杆菌裂解后得到的上清在460-520nm范围内的吸光曲线近似线性(图2B)，除非其表达某种在该区域有吸收峰的外源性蛋白或代谢产物；
[0015]3)当大肠杆菌裂解后得到的上清中含有rubredoxin或rubredoxin融合蛋白时，其在460-520nm范围内的吸光曲线由直线(图2C中DEF线)变为曲线(图2C中ABC线)。
[0016]当然，本发明方法涉及的宿主菌并不局限于大肠杆菌，符合上述第(2)条的宿主菌均可应用于本发明。
[0017]二、本发明蛋白定量方法的计算原理如下 :
[0018]参照图2C,当大肠杆菌裂解后的上清中含有rubredoxin融合蛋白时，在460-520nm范围的测得的吸收曲线为ABC。此时，假设将体系中的rubredoxin全部去除，则依据之前所述发现，体系的吸收曲线将下移到原来曲线的下方，并近似为一条直线，假设为DEF。
[0019]设上清中rubredoxin的物质的量浓度(也即融合蛋白或目的蛋白的物质的量浓度)为C，比色皿光路长度为1，rubredoxin在472nm、491nm和5IOnm的摩尔吸光系数分别为ε 472、ε491和ε51(ι;Χ代表横坐标值，y代表纵坐标值，A代表吸光度。
[0020]A、B、C三点的纵坐标即为体系在472nm、491nm和510nm处的吸光值，SP
[0021]Ya=A472
[0022]Yb=A491
[0023]Yc=A510
[0024]另外
[0025]xA=xD=472nm
[0026]xB=xE=491nm
[0027]xc=xF=510nm
[0028]yD=yA- ε 472lc
[0029]yE=yB- ε 510lc
[0030]由于rubredoxin 蛋白的 ε 472= ε 510，
[0031]BPADI = I CF
[0032]故AC//DF
[0033]于是AC和DF两直线斜率相等，即
[0034]kAC=kDF=kDE
Ya-yc yp ye
[0035]_ — ? _ ?
ΛΛ.1?
「00361 yryc = --Α — ￡472^) - (yB — ε491 lc)
-38-19
[0037]从而得到C == fcM①
[0038]其中ΛΑ=2Α491-Α472-Α51?’ k =
[0039]经测定得
[0040]ε 472二 ε 510=3.210 X IO3L.mol—1.cm—1
【权利要求】
1.一种蛋白质定量方法，包括以下步骤: 1)构建待测目的蛋白与铁氧还蛋白rubredoxin的融合蛋白的表达载体,所述表达载体表达的蛋白质除rubredoxin外在460_520nm范围内均没有吸收峰； 2)将构建好的表达载体转入宿主菌，培养宿主菌并表达融合蛋白，其中所述宿主菌除rubredoxin外所表达的外源性蛋白和代谢产物在460_520nm范围内没有吸收峰； 3)表达一定时间后收集宿主菌并裂解，离心，取上清； 4)向上清中加入双氧水,将rubredoxin全部转化为氧化态，充分反应后利用紫外-可见分光光度计测460-520nm范围内上清的吸收曲线，记录472nm、491nm和510nm处的吸光度值A472、A491和A510，计算Δ A-2A491_A472_A510 5)将ΛΑ带入下述公式计算出融合蛋白浓度C，从而得到待测目的蛋白的可溶表达量:
2.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌。
3.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，所述rubredoxin的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。
4.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，步骤I)所述融合蛋白中，rubredoxin连接在目的蛋白的C端或N端。
5.如权利要求4所述的蛋白质定量方法，其特征在于，所述融合蛋白中目的蛋白与rubredoxin之间的连接肽序列如序列表中SEQ ID No:9或SEQ ID No:10所示。
6.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，步骤I)所述融合蛋白中除rubredoxin外还融合了其他标签蛋白。
7.如权利要求6所述的蛋白质定量方法，其特征在于，所述其他标签蛋白是His标签蛋白。
8.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，步骤I)构建融合蛋白表达载体的出发载体是pET-21 a或pGEX-6p-l。
9.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，步骤3)用超声破碎或加裂解液的方法裂解菌。
10.如权利要求1所述的蛋白质定量方法，其特征在于，步骤4)双氧水终浓度为0.06%。
【文档编号】G01N21/31GK103487393SQ201310481432
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】夏斌, 段博 申请人:北京大学