十字花科种子活力的检测方法
【专利摘要】本发明属分析【技术领域】，具体涉及种子活力检测方法，采用表面解吸常压化学电离质谱法，通过直接对萝卜、白菜、青菜等十字花科种子表面的芥子碱含量进行测定来检测种子活力，无需任何样品预处理。所建立的新方法具有快速、无损、高通量等优点，单个种子的平均检测时间仅需4.4s，为种子活力的快速检测提供了新的方案。
【专利说明】十字花科种子活力的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属分析【技术领域】，具体涉及种子活力检测。
技术背景
[0002]种子活力即种子的健壮度，是种子发芽和出苗率、幼苗生长的潜势、植株抗逆能力和生产潜力的总和，是种子品质的重要指标。高活力种子具有明显的生长优势和优良的生产潜力，对农业生产具有十分重要的意义。快速有效的种子活力检测有助于优质种子的筛选，为农业增产提供保障。目前，常规的种子活力检测方法有:目测法、X光放射显影法、乙烯含量法、电导法、染色法和荧光法等。上述的几种方法，除目测法外，都会在一定程度上破坏种子，导致检测后的种子不能用于生产。发芽试验法比较直观，指标明确，但通常一次实验需要6-10天，耗时长，操作繁琐。因此，建立直接、快速、高通量的种子活力检测方法迫在眉睫。
[0003]芥子碱(Sinapoylcholine/sinapine, C16H24N05)为季铵盐生物碱，是一种非常有价值的天然抗氧化剂，具有多种生理活性，如抗辐射、抗衰老、降血压、消炎止泻等，广泛存在于十字花科植物的种子中。芥子碱硫氰酸盐(Sinapine thiocyanate,C16H24N05SCN)是芥子碱在植物体中存在的最为广泛的形式，是芥子碱与SCN-相结合的形式。常用芥子碱硫氰酸盐作为标准品来测定芥子碱。电导率法通过检测种子细胞膜的完整性来判断种子活力的大小，已被广泛认可，其原理为细胞膜受损会导致包括氨基酸，多糖以及次生代谢物等在内的细胞内容物渗出。芥子碱作为十子花科植物种子细胞中普遍存在的次生代谢产物，活力弱或者没有活力的种子表面将会不同程度渗出芥子碱，活力强的十字花科种子表面不渗出或者少渗出芥子碱(Sinapine leakage)。因此,可通过测定十字花科种子表面的芥子碱强度来预测种子的活力。
[0004]表面解吸常压化学电离串联质谱(SDAPC1-MSn)可对样品表面进行直接分析，因其无需样品预处理、灵敏度高、特异性好，检测速度快等优点，已经广泛应用于食品、医药等多个领域。本发明运用SDAPC1-MSn直接对十字花科种子表面的芥子碱进行测定，来预测十字花科种子活力。
【发明内容】
[0005]为解决现有种子活力检测技术存在破损种子、检测效率低的问题，本发明提供技术方案如下:
十字花科种子活力的检测方法，包括如下步骤:
(1)取十字花科种子，洗净，备用；
(2)表面解吸常压化学电离串联质谱SDAPCI仪器设置:采用液体辅助SDAPCI，主要由涂有绝缘层的放电针和两个不绣钢三通套管组成，一个不锈钢套管中通入氮气解吸气体，另外一个不锈钢套管中通入解吸气体，大流速的鞘气和液体形成的高速喷雾对样品表面分析物进行解吸，分析物在放电针的电场下形成离子进入到质谱；调节实验参数条件:设置LTQ-MS为正离子检测模式，质谱检测扫描范围为《Λ200-400 ;离子源电压为4.0 kV ;毛细管温度为275 V ;辅助解吸气N2气压为1.8 MPa ;解吸剂为甲醇/水溶液(1:1，V: V)，流速为7 μ L/min;在串联质谱时，母离子的选择窗口为
1.4 Da，碰撞时间为30 ms，碰撞能量为10-30% ;其它参数采由LTQ-MS系统自动优化；(3)将步骤(1)所得种子直接放在离子源下方，对其表面进行检测，分析芥子碱信号强
度；
(4)取不同芥子碱信号强度的种子，进行种子发芽试验，绘制芥子碱信号强度与种子发芽率关系曲线，得出样品种子发芽率。
[0006]所述步骤(2)调节试验参数条件中所有质谱记录时间为I min ;质谱入口与离子源距离为15 mm;离子源与样品表面的距离为2 mm ;喷雾针与样品表面的角度为45° ;样品表面与质谱仪入口毛细管的角度:15° -30° ;种子老化箱的相对湿度RH为95%，温度分别设置为50 1:和65 °C。
[0007]步骤(3)所述分析芥子碱信号为分析芥子碱二级质谱特征离子《Λ 251净响应信号强度。
[0008]本发明的有益效果是:本文运用表面解吸常压化学电离串联质谱(SDAPC1-MSn)直接对十字花科种子表面的芥子碱进行测定，来预测十字花科种子活力的方法。该方法分析速度快，可以快速、批量、无损的检测种子的活力，实现了种子的高通量检测。测定后种子发芽率不受影响，节约了种子资源。因为本方法中被检测的种子没有受到任何的损害，因此可应用于监控存储过程中种子的品质，实时指导种子存储条件的调控。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1 SDAPC1-MS检测种子结构示意图。
[0010]图2萝卜种子表面的SDAPC1-MS质谱图a) m/z 310的二级串联质谱图；b) m/z 310的三级串联质谱图。
[0011]图3不同老化程度种子和芥子碱信号强度关系。
[0012]图4不同芥子碱强度与萝卜种子发芽率和发芽势关系图。
[0013]图5 —级质谱》Λ 310 CID离子流图。
[0014]图6大白菜种子表面SDAPC1-MS质谱图a)芥子碱310)的二级串联质谱图；b)芥子碱Wz 310)的三级质谱图。
[0015]图7青菜种子表面SDAPC1-MS质谱图a)芥子碱(jn/z 310)的二级串联质谱图；b)芥子碱Qn/z 310)的三级质谱图。
【具体实施方式】
[0016]实施例1
1、仪器与试剂
实验室采用自制液体辅助DAPCI离子源，如图1.1所示。，将两个三通套管同轴串联使用，其中一个不绣钢套管通入萃取溶液，另外一个通入解吸气；而放电针从两个三通的轴心穿过。萃取溶液流入石英毛细管，并在鞘气的作用下雾化成细小的液滴，然后通过电晕放电使其带电，带电的液滴再与样品表面相互作用，发生能量转移或电荷转移反应将表面的分析物萃取出来形成待测物的离子。在直接分析生物样品中芥子碱时，更容易将芥子碱解吸出来，尤其是易与生物样品结合牢固的芥子碱的解吸。实验采用线性离子阱质谱仪(Finnigan LTQ XL)，配有 LTQ Xcalibur 2.0 软件处理系统(美国 Finnigan 公司);HH_2 型数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；LH-150S型种子老化试验箱(浙江托普仪器有限公司)；GXZ-380B智能光照培养箱(宁波东南仪器有限公司)。
[0017]萝卜种子(南畔洲品种,抚州当地种植),青菜种子(上海七宝青品种，南昌市新兴种子有限公司)，大白菜种子(早熟5号品种，温州市神鹿种业有限公司)，保存于4 °C冰箱。
[0018]甲醇(HPLC,美国Dikmapure公司)。实验室用水为二次蒸懼水,其它试剂均为分析纯。
[0019]2、实验条件
如图1所示，本文采用液体辅助SDAPCI，主要由涂有绝缘层的放电针和两个不绣钢三通套管组成。一个不锈钢套管中通入氮气等解吸气体，另外一个不锈钢套管中通入解吸气体。大流速的鞘气和液体形成的高速喷雾对样品表面分析物进行解吸，分析物在放电针的电场下形成离子进入到质谱。实验条件设置LTQ-MS为正离子检测模式，质谱检测扫描范围为?Λ 200-400 ;离子源电压为4.0 kV ;毛细管温度为275 V ;辅助解吸气(N2)气压为1.8 MPa;解吸剂为甲醇/水溶液(1:1，v:v)，流速为7 μ L/min。在串联质谱时，母离子的选择窗口为1.4 Da，碰撞时间为30 ms，碰撞能量为10_30%。其它参数采由LTQ-MS系统自动优化。所有质谱记录时间为I min。质谱入口与离子源距离为15 mm ;离子源与样品表面的距离为2 mm ;喷雾针与样品表面的角度为45° ;样品表面与质谱仪入口毛细管的角度:15° -30°。种子老化箱的相对湿度RH为95%，温度分别设置为50 1:和65 °C。
[0020]3、实验方法 种子质谱检测方法:如图1所示，将种子洗净，直接放在离子源下方，同时对其表面进行检测，可以获得芥子碱信号。
[0021]种子发芽实验方法:采用培养皿滤纸发芽法，将种子置于直径9 cm培养皿中，内垫双层湿润的滤纸，每个培养皿摆放50粒种子，加盖I层湿润的滤纸，每处理重复3次，然后将培养皿放到25±1.0 1:人工气候智能光照培养箱中暗培养。试验过程中及时补充水分，保持滤纸湿润，每天下午观察记录I次，以胚根露出种皮I 2 _为发芽标准，记录每天出芽数，培养4 d时统计发芽率(种子发芽数/种子总数*100%)。
[0022]分析速度测定方法:如图1所示，将种子粘成一排，放在离子源下方，手动进样，进行高通量实验。
[0023]种子加速老化方法:挑选大小、色泽、饱满度、成熟度一致的萝卜种子500粒，随机分10组，每组50粒。将种子放置在老化箱中进行老化处理。其中五组分别在50 °C温度下加速老化30，60，80，100，120 min，另外五组在65 1:温度下进行加速老化。
[0024]SDAPC1-MSn检测对种子发芽率的影响检测:挑选大小、色泽、饱满度等相似的萝卜种子600粒，随机分成6份，每份100粒种子，每份样品中随机取50粒作为对照组，另外50粒作为实验组。实验组种子样品，老化处理后进行质谱检测，质谱检测后的种子进行发芽实验。对照组的种子样品，仅做老化处理而不进行质谱检测，直接进行发芽实验。
[0025]4结果与讨论
本研究采用SDAPC1-MS直接测定十字花科种子表面的芥子碱，从而预测种子活力，以萝卜种子为例。
[0026]4.1萝卜种子表面芥子碱的SDAPC1-MSn检测
在芥子碱SDAPC1-MSn检测中，一级质谱,二级质谱,三级质谱的信号位点分别为取今310, m/z 251, 207和m/z 175，其中，二级质谱中251位点的信号值一般视为芥子碱强度。图2为随机选取的萝卜种子表面质谱图，一级质谱图中可以看到310，对一级质谱母离子进行串联质谱分析，可排除假阳性，确定其是否为芥子碱。实验结果发现310的二级质谱特征碎片峰251和三级质谱图特征峰207,m/z 175等都和文献中芥子碱硫氰酸盐标准品的谱图一致，说明在一级质谱中检测到的分子离子峰310的物质为芥子碱。结果表明萝卜种子表面存在芥子碱。
[0027]4.2芥子碱信号强度和种子活力关系
4.2.1种子老化程度和芥子碱强度的关系
用SDAPC1-MS进行直接检测经老化后的萝卜种子，探究芥子碱的净响应信号强度和种子活力之间的关系。每粒种子平均测定三次，每组得到150次测定结果，芥子碱二级质谱特征离子251净响应平均信号强度。获得萝卜种子不同的老化程度和芥子碱净响应信号强度的关系(图3)。由图3中可以看出老化的时间越长，芥子碱的浓度越高；老化的温度越高，芥子碱的浓度越高。实验表明萝卜种子的老化程度和芥子碱信号强度成正相关即种子活力和芥子碱信号强度成负相关。图3中还可以看出，65 1:实验组和50 °C实验组相比，芥子碱的信号强度上升更快，可能是因为老化温度越高的时候，对细胞膜破坏性越强，导致芥子碱的信号强度越高。
[0028]4.2.2不同老化程度种子的活力
在本实验中拟用发芽势和发芽率来表征种子活力。经质谱检测后的老化萝卜种子，进行发芽实验。种子的老化程度不同，种子活力就有一定的差别，因而种子的发芽势和发芽率也不一样。得到不同芥子碱浓度与萝卜种子发芽率与发芽势的关系(图4)。由图中可以看出，芥子碱的净响应信号强度越高，萝卜种子发芽率和发芽势就越低。随着芥子碱的浓度的增高，种子的发芽率和发芽势都明显的下降。芥子碱的净响应信号的强度为4.6时，种子的发芽率为90%，当芥子碱净响应信号强度在13时，种子的发芽率为82%，当种子的芥子碱含量达到一定的程度时，种子不能发芽。萝卜种子的发芽率与芥子碱净信号强度的关系曲线与y = -24.437Ln(x) + 138.12 (R2=0.9462)相拟合，发芽势与芥子碱信号强度的关系曲线与 y = -21.523Ln (x) + 117.76 (R2=0.9661)相拟合。因此，根据 SDAPC1-MS 检测到的种子表面的芥子碱含量来评估种子品质。
[0029]为了检测本检测方法对种子活力的破坏情况，本研究还设置对照实验。结果表明实验组的发芽势和发芽率都高于对照组。在实验组中，种子表皮接触到甲醇水解吸溶剂后，发芽势和发芽率反而上升，原因可能是:一是甲醇挥发性强，溶剂喷到种子表面后迅速挥发，没有与种子进行长时间的接触；二是SDAPC1-MS测定种子表面的芥子碱，分析速度快，喷雾溶剂短时间内尚未在种子表面积聚；三是喷到种子表面的甲醇水溶剂对种子表面的蜡质有一定的破坏作 用，从而增大了种皮的渗透性，利于种皮的吸水和透气，进而促进种子的萌发。综上，虽然实验中引入了甲醇试剂，但并没有对种子造成破坏，反而增加了种皮的通透性，有助于种子的发芽。
[0030]4.3分析速度分析速度是考察方法的重要参数。选取12粒在65 °C下加速老化60 min的萝卜种子粘成一排，直接进样，进行高通量实验(图5)。图5为一级质谱目标离子310碰撞诱导解离实验的离子流图，不到I min就已经完成12个样品的全部测定。高通量分析方法主要受样品导入装置的限制，本实验采用手动操作方法，测定每个样品的二级质谱平均仅需要4.4 S。如果采用传送带机械化操作，检测速度将更快。
[0031]4.4方法适用范围
为考察本实验方法的适用范围，采用SDAPC1-MS测定了早熟5号大白菜种子和上海七宝青菜种子表面的芥子碱。图6和7为这两类种子的质谱图，一级质谱图中可以看到芥子碱的分子离子峰310，对一级质谱母离子进行二级和三级串联质谱分析，确定大白菜和青菜的种子表面都含有芥子碱。结果说明用SDAPC1-MS测定种子表面的芥子碱的方法来评估种子活力，不仅仅适用于萝卜种子，还同样适用于其它十字花科种子种子活力的检测。十字花科其他种类种子表面的芥子碱的强度和种子活力的关系还需要通过实验进行进一步的研究。[0032]实施例2
1、十字花科种子活力的检测方法，包括如下步骤:
(1)取十字花科种子，洗净，备用；
(2)表面解吸常压化学电离串联质谱SDAPCI仪器设置:采用液体辅助SDAPCI，主要由涂有绝缘层的放电针和两个不绣钢三通套管组成，一个不锈钢套管中通入氮气解吸气体，另外一个不锈钢套管中通入解吸气体，大流速的鞘气和液体形成的高速喷雾对样品表面分析物进行解吸，分析物在放电针的电场下形成离子进入到质谱；
调节实验参数条件:设置LTQ-MS为正离子检测模式，质谱检测扫描范围为《Λ200-400 ;离子源电压为4.0 kV ;毛细管温度为275 °C;辅助解吸气N2气压为1.8 MPa ;解吸剂为甲醇/水溶液(1:1，V: V)，流速为7 μ L/min ;在串联质谱时，母离子的选择窗口为1.4Da，碰撞时间为30 ms，碰撞能量为10-30% ;其它参数采由LTQ-MS系统自动优化；所有质谱记录时间为I min ;质谱入口与离子源距离为15 mm ;离子源与样品表面的距离为2 mm ;喷雾针与样品表面的角度为45° ;样品表面与质谱仪入口毛细管的角度:15° -30° ;种子老化箱的相对湿度RH为95%，温度分别设置为50 1:和65 0C。
[0033](3)将步骤(1)所得种子直接放在离子源下方，同时对其表面进行检测，分析芥子碱二级质谱特征离子?Λ 251净响应信号强度；
(4)取不同芥子碱信号强度的种子，进行种子发芽试验，绘制芥子碱信号强度与种子发芽率关系曲线，得出样品种子发芽率。
【权利要求】
1.十字花科种子活力的检测方法，包括如下步骤: (1)取十字花科种子，洗净，备用； (2)表面解吸常压化学电离串联质谱SDAPCI仪器设置:采用液体辅助SDAPCI，主要由涂有绝缘层的放电针和两个不绣钢三通套管组成，一个不锈钢套管中通入氮气解吸气体，另外一个不锈钢套管中通入解吸气体，大流速的鞘气和液体形成的高速喷雾对样品表面分析物进行解吸，分析物在放电针的电场下形成离子进入到质谱； 调节实验参数条件:设置线性离子阱质谱LTQ-MS为正离子检测模式，质谱检测扫描范围为取Λ 200-400 ;离子源电压为4.0 kV;毛细管温度为275 °C;辅助解吸气N2气压为1.8MPa;解吸剂为体积比1:1甲醇/水溶液，流速为7 yL/min;在串联质谱时，母离子的选择窗口为1.4 Da，碰撞时间为30 ms，碰撞能量为10-30% ;其它参数采由LTQ-MS系统自动优化； (3)将步骤(1)所得种子直接放在离子源下方，同时对其表面进行检测，分析芥子碱信号强度； (4)取不同芥子碱信号强度的种子，进行种子发芽试验，绘制芥子碱信号强度与种子发芽率关系曲线，得出样品种子发芽率。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)调节试验参数条件中所有质谱记录时间为I min ;质谱入口与离子源距离为15 mm ;离子源与样品表面的距离为2 mm ;喷雾针与样品表面的角度为 45° ;样品表面与质谱仪入口毛细管的角度:15-30° ;种子老化箱的相对湿度RH为95%，温度分别设置为50 1:和65 0C。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)所述分析芥子碱信号为分析芥子碱二级质谱特征离子251净响应信号强度。
【文档编号】G01N27/68GK103597929SQ201310569742
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】罗丽萍, 陈焕文, 姜翠翠, 罗火林, 郭夏丽 申请人:南昌大学