口蹄疫灭活疫苗中间品或抗原146s含量的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种口蹄疫灭活疫苗中间品或抗原146S含量的测定方法，该方法是利用经典的蔗糖密度梯度离心技术，将被检抗原直接加至蔗糖梯度顶部超速离心，再利用连续紫外检测器连续检测，根据抗原峰面积计算146S含量，从而达到快速、稳定检测口蹄疫灭活疫苗中间品或抗原146S的含量的目的。本发明过程简单，操作性强，周期短，且所需样品量少，重复性和稳定性好。为下一步研究疫苗中抗原含量与免疫后动物所获得的保护力之间的关系研究提供了保障，同时解决了疫苗生产中间品检测和成品口蹄疫疫苗体外检测方法的技术瓶颈。
【专利说明】口蹄疫灭活疫苗中间品或抗原146S含量的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽医学领域，具体为口蹄疫灭活疫苗中间或抗原品146S含量的测定方法。【背景技术】
[0002]口蹄疫(Food and Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Food and MouthDisease Virus,FMDV)引起的偶蹄类动物的急性、热性、接触性、烈性传染病。由于该病的发生会造成巨大的经济损失和政治影响，因此，口蹄疫防治工作始终得到世界各国政府的高度重视。疫苗接种是我国预防控制口蹄疫的重要战略，农业部要求强制免疫接种，免疫密度常年维持在90 %以上，其中应免畜禽免疫密度要达到100 %，各口蹄疫生产厂家检验用阴性动物(牛、猪)基本无处可选，企业面临无检验动物可用的局面，因为口蹄疫灭活疫苗效力评价方法是采用OIE标准的本动物(牛、猪)半数保护量(PD50)检测方法，即用健康易感牛或猪(乳鼠中和抗体滴度≤1:4或细胞中和抗体滴度≤1:8或ELISA抗体效价≤1:16)30头，将待检疫苗按3组(I头份、1/3头份、1/9头份)各接种10头牛。21~28日后连同对照牛非别攻击O型、亚洲I型口蹄疫病毒强毒104ID50，根据免疫牛保护数，按Reed-Muench法计算被检疫苗的TO50。而初步估计国内6个口蹄疫定点生产厂每年口蹄疫阴性牛使用量最少应该在10000头左右，猪至少在20000头，要想保证这个数量非常困难。所以口蹄疫灭活疫苗效力评价筛选检验用阴性动物非常困难，同时各企业动物来源、动物品系均不同，动物来源复杂、背景不清，不易标准化等问题严重困扰着我国口蹄疫疫苗生产企业。同时这种方法需要大面积负压强毒动物舍，感染动物体外排毒造成活病毒逃逸是一直困扰专家的难题。
[0003]为了解决口蹄疫疫苗检验用本动物来源困难这一现实问题，2005年，对牛的口蹄疫疫苗农业部提出并批准生产企业每连续生产五批疫苗选择进行一批效力评价的策略，虽然稍稍缓解动物来源的困难，但是又为市场疫苗质量、口蹄疫的发生埋下了隐患，因为未进行效力评价的疫苗进入市场后效力一旦存在问题，就会出现不可估量的损失。所以2006年农业部兽医局责成各生产企业及研究单位要尽快寻找替代本动物进行效力评价的方法。可见建立一种新型、有效、稳定、科学评价口蹄疫灭活疫苗效价体系迫在眉睫。
[0004]国际上主要采用密度梯度离心法检测有效抗原含量，我国采取本动物效力实验检测终端产品的方法对疫苗质量进行控制，但此方法存在成本较高和因动物个体差异导致的检测结果不准确等问题，且不能用于疫苗生产环节的中间品检验，因此建立快速有效的口蹄疫灭活疫苗抗原检测和定量方法极为重要。国际上采用的密度梯度离心法检测有效抗原含量的方法样品必须浓缩，过程比较复杂，最终导致的结果是检测结果不稳定，重复性差，而且周期长。
【发明内容】
[0005]本发明所解决的技术问题是利用经典的蔗糖密度梯度离心技术，将被检抗原直接加至蔗糖梯度顶部超速离心，再利用连续紫外检测器连续检测，根据抗原峰面积计算146S含量，从而达到快速、稳定检测口蹄疫灭活疫苗中间品或抗原146S的含量，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
口蹄疫灭活疫苗中间品或抗原146S含量的测定方法，包括以下步骤:
(1)样品前处理，步骤如下:
1)在无菌条件下将中间品或抗原样品分装于已灭菌管；
2)将分装后的中间品平衡后置于高速台式离心机内，在4°C条件下离心5min;
3)吸取上清液即为试验用样品；
(2)将实验用样品直接用于蔗糖密度梯度离心，步骤如下:
1)蔗糖密度梯度制备:使用自动梯度制备仪制备梯度，现制现用；
2)打开离心机进行自检测试，确保离心机可以正常运转；
3)测试完成后，打开舱门，将样品加入蔗糖梯度上层，用配制好的TNE缓冲液两两平衡，放入离心管内，拧紧离心管盖子，再将相应数字的离心管挂到水平离心管架上，放入离心机内，并记录样品号与相对应的离心管号后盖上离心盖，关闭舱门；
4)开始离心 离心参数如下:
转速为 35000rpm/min 温度为10 °C 时间为3h
5)离心结束后，取出离心管，拧开离心管盖子，取出蔗糖梯度，弃掉1.5mL上层液体，将尚心后的样品放直4 C待检；
(3)通过使用连续紫外检测仪器，对离心后的样品进行连续检测:在259nm波长下测定紫外吸光度，并根据紫外吸光度记录并保存检测曲线；
(4)根据检测出的曲线，对146S抗原峰手动积分，结合IPg口蹄疫146S抗原的峰面积(321.4mAU.s)，计算样品146S抗原含量，从而得到所需数据。
[0007]综上所述，本发明与传统技术相比具有以下优势:
1、重复性和稳定性好，同一样品检测结果偏差基本在5%以内；而传统方法同一样品检测结果偏差较大，基本在20%左右，有时达到100% ；
2、过程简单，操作性强，样品不经任何处理即可上样检测，检测结果更接近真实值，而传统方法必须经过浓缩步骤(沉淀、悬浮等过程)，抗原损失多，检测结果不能反映真实值；
3、所需样品量少,仅需1.5mL便可检测，而传统方法至少需10 mL ；
4、周期短，仅需3-5个小时便能完成，而传统方法需过夜分散，两天才能完成整个检测过程。
[0008]本发明为下一步研究疫苗中抗原含量与免疫后动物所获得的保护力之间的关系研究提供了保障，同时解决了疫苗生产中间品检测和成品口蹄疫疫苗体外检测方法的技术瓶颈。
【具体实施方式】[0009]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0010]实施例1
口蹄疫灭活疫苗中间品或抗原146S含量的测定方法，包括以下步骤:
(1)样品前处理，步骤如下:
1)在无菌条件下将中间品或抗原样品分装于已灭菌的2mLEppendorf管；
2)将分装后的中间品平衡后置于高速台式离心机内，在4°C条件下离心5min;
3)轻轻吸取1.5mL上清液即为试验用样品；
(2)将实验用样品直接用于蔗糖密度梯度离心，步骤如下:
1)蔗糖密度梯度制备:使用自动梯度制备仪制备梯度，现制现用；
2)打开离心机进行自检测试，确保离心机可以正常运转；
3)测试完成后，打开舱门，将1.5mL样品加入蔗糖梯度上层，用配制好的TNE缓冲液两两平衡，放入离心管内，拧紧离心管盖子，再将相应数字的离心管挂到水平离心管架上，放入离心机内，并记录样品号与相对应的离心管号后盖上离心盖，关闭舱门；
4)开始离心
离心参数如下:
转速为 35000rpm/min
温度为10 °C
时间为3h
5)离心结束后，取出离心管，拧开离心管盖子，取出蔗糖梯度，弃掉1.5mL上层液体，将尚心后的样品放直4 C待检；
(3)通过使用连续紫外检测仪器，对离心后的样品进行连续检测，步骤如下；
1)将连续紫外检测仪器与电脑联机，打开电脑主机各模块电源(从上至下)，待各模块完成自检后，再双击桌面“仪器I联机”图标，进入化学工作站，从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面；
2)把各流动相放入溶剂瓶中；
3)旋开排气阀(逆时针)，点击“方法”选项进入泵编辑画面。将泵流量设到5mL/min，打开泵，排出管线中的气体2 — 3min，直到管线内由溶剂瓶到泵入口无气泡为止，查看柱前压力(若大于lbar，则应更换排气阀内过滤白头)；
4)设定泵的流速为2mL/min，关闭排气阀(顺时针)，冲洗系统30—60min；
5)将水换成蔗糖溶液，流速设为lmL/min，当柱前压力稳定后，打开检测器氘灯，待基线平衡后，换待检的密度梯度离心后的样品，在259nm波长下测定紫外吸光度，电脑自动记录检测曲线，检测结束时，按中断键，检测曲线即保存；
6)检测下一样品时，先将流速设为0，移竖直金属杆至45%蔗糖溶液，然后流速设为lmL/min重新平衡。待基线平衡后流速设为0，将竖直金属杆移至样品接着检测
7)双击桌面“仪器I脱机”图标，进入化学工作站；
8)从“文件”菜单选择“调用信号”选中您的数据文件名，单击“确定”； 9)积分:从“积分”中选择“自动积分”，积分结果不理想，再从菜单中选“积分选项”，选择合适的“斜率灵敏度，峰宽，最小峰面积，最小峰高”，从“积分”菜单中选择“积分”则数据自动被积分，如果积分不理想则用手动积分；
10)打开排气阀，泵流量5mL/min，用水冲洗柱子和系统7-15min ;然后关闭排气阀，将泵流速设为2mL/min用水冲洗系统0.5_lh,再用已过滤的色谱甲醇冲洗IOmin,然后关泵，退出化学工作站和其它窗口 ；
(4)根据检测出的曲线，对146S抗原峰手动积分，结合IPg 口蹄疫146S抗原的峰面积(321.4mAU.s)，计算样品146S抗原含量，从而得到所需数据。
[0011]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0012]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【权利要求】
1.口蹄疫灭活疫苗中间品或抗原146S含量的测定方法，其特征是，包括以下步骤: (1)样品前处理，步骤如下: 1)在无菌条件下将中间品或抗原样品分装于灭菌管； 2)将分装后的中间品平衡后置于高速台式离心机内，在4°C条件下离心5min; 3)吸取上清液即为试验用样品； (2)将实验用样品直接用于蔗糖密度梯度离心，步骤如下: 1)使用自动梯度制备仪制备梯度； 2)打开离心机进行自检测试，确保离心机可以正常运转； 3)测试完成后，打开舱门，将样品加入蔗糖梯度上层，用配制好的TNE缓冲液两两平衡，放入离心管内，拧紧离心管盖子，再将相应数字的离心管挂到水平离心管架上，放入离心机内，并记录样品号与相对应的离心管号后盖上离心盖，关闭舱门； 4)开始离心 离心参数如下: 转速为 35000rpm/min 温度为10 °C 时间为3h 5)离心结束后，取出离心管，拧开离心管盖子，取出蔗糖梯度，弃掉上层液体，将离心后的样品放直4 C待检； (3)通过使用连续紫外检测仪器，对离心后的样品进行连续检测:在259nm波长下测定紫外吸光度，并根据紫外吸光度记录并保存检测曲线； (4)根据检测出的曲线，对146S抗原峰手动积分，结合IPg口蹄疫146S抗原的峰面积(321.4mAU.s)，计算样品146S抗原含量，从而得到所需数据。
【文档编号】G01N21/33GK103698290SQ201310717661
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】董金杰, 王凡, 智晓莹, 常艳燕, 乔莉萍, 刘学荣, 牟克斌, 王超英, 黄银君, 张云德, 殷宏 申请人:中农威特生物科技股份有限公司