酶联免疫印迹计生四项联合试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种酶联免疫印迹计生四项联合试剂盒。包含载体板、巨细胞病毒、弓形虫、风疹病毒、单纯疱疹病毒抗体或抗原检测线、对照线、硝酸纤维膜等；硝酸纤维素膜粘贴在载体板的表面，四种病毒抗体或抗原检测线、对照线自上而下依次设在硝酸纤维素膜上，各检测线和对照线四周制有温育槽；在四种病毒抗体或抗原检测线处分别包被对应的经SDS-PAGE电泳、电转后的抗原或抗体；在各对照线上分别包被巨细胞病毒、弓形虫、风疹病毒、单纯疱疹病毒抗原或含这四种病毒抗体的病人阳性血清；本实用新型一次性快速检测计生四项、操作简单，成本低、设计新颖，易于观察并做出诊断。
【专利说明】酶联免疫印迹计生四项联合试剂盒
【技术领域】:
[0001]本实用新型涉及一种能适用于酶联免疫印迹技术一次性检测计生四种病毒(种)的检测方法的试剂盒，属于医疗诊断计生四项联合试剂盒检测【技术领域】。
【背景技术】:
[0002]四项计生检测是针对育龄妇女在怀孕早期开展的旨在预防新生儿出生缺陷的一项重要的检测措施，它对于提高出生人口素质，减少新生儿出生风险具有重要的意义，已被医疗机构和孕产妇广泛接受和应用。四项计生检测包括风疹病毒，巨细胞病毒、弓形体和单纯疱疹病毒。通过四项计生检测可检测出孕妇和胎儿是否存在感染的情况，并有针对性地治疗或终止妊娠。
[0003]目前应用酶联免疫印迹法来检测诊断这四项疾病时，每项疾病的检测单独操作完成，各种试剂均为分散放置，没有特制的反应板，所以检测过程复杂、时间长、携带及操作不方便。如:化学反应法及Elisa法均需要使用各自的试剂盒，一次只能进行一种病毒的检测。
【发明内容】
:
[0004]本实用新型的目的在于克服现有技术的缺点，把计生四项即四种不同的病种放到一个反应板上，一次性操作即可得出四种疾病的诊断结果，减少了频繁的操作程序，节约人力、物力、节省时间，易于观察并做出诊断。
[0005]为了实现上述发明目的，本实用新型包含载体板、巨细胞病毒(CMV)抗体(抗原)检测线、弓形虫(TO)抗体(抗原)检测线、风疹病毒(RV)抗体(抗原)检测线、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗体(抗原)检测线、对照线、硝酸纤维膜(NC膜)、温育槽；硝酸纤维素膜粘贴在载体板的表面，巨细胞病毒抗体(抗原)检测线、弓形虫抗体(抗原)检测线、风疹病毒抗体(抗原)检测线、单纯疱疹病毒抗体(抗原)检测线、对照线自上而下依次设在硝酸纤维素膜上，并在各检测线和对照线四周制有温育槽；在巨细胞病毒抗体(抗原)检测线、弓形虫抗体(抗原)检测线、风疹病毒抗体(抗原)检测线、单纯疱疹病毒抗体(抗原)检测线处分别包被对应的经SDS-PAGE电泳、电转后的抗原(抗体)；在自左至右四条对照线上分别包被巨细胞病毒抗原、弓形虫抗原、风疹病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原或分别包被含巨细胞病毒抗体、弓形虫抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体的病人阳性血清；和载体板之外的碱性磷酸酶标记的抗巨细胞病毒抗体、抗弓形虫抗体、抗风疹病毒抗体、抗单纯疱疹病毒抗体或巨细胞病毒抗体、弓形虫抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体及其底物(硝基蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐体积比为1:49的混合物)共同组成酶联免疫印迹计生四项试剂盒。
[0006]酶联免疫印迹计生四项联合试剂盒的制备:
[0007]I)、巨细胞病毒(CMV)抗原(抗体)、弓形虫(TO)抗原(抗体)、风疹病毒(RV)抗原(抗体)、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原(抗体)；碱性磷酸酶标记的抗巨细胞病毒抗体、抗弓形虫抗体、抗风疹病毒抗体、抗单纯疱疹病毒抗体或碱性磷酸酶标记的巨细胞病毒抗体、弓形虫抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体市售购买；
[0008]2)、灌制SDS - PAGE电泳胶，将巨细胞病毒(CMV)抗原(抗体)、弓形虫(TO)抗原(抗体)、风疹病毒(RV)抗原(抗体)、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原(抗体)进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，然后进行脱色；依据经脱色后的电泳胶上的各病毒抗原(抗体)的条带位置进行硝酸纤维素膜上对应条带位置的标记；
[0009]3)、灌制SDS - PAGE电泳胶，分别将巨细胞病毒(CMV)抗原(抗体)、弓形虫(TO)抗原(抗体)、风疹病毒(RV)抗原(抗体)、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原(抗体)进行SDS-PAGE电泳；
[0010]4)、分别用电转膜移装置将电泳后的巨细胞病毒(CMV)抗原(抗体)、弓形虫(TO)抗原(抗体)、风疹病毒(RV)抗原(抗体)、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原(抗体)转至硝酸纤维膜上，电转完毕后，取出膜，用PBS缓冲液冲洗一次，晾干；
[0011]5)、将含有巨细胞病毒(CMV)抗原(抗体)、弓形虫(TO)抗原(抗体)、风疹病毒(RV)抗原(抗体)、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原(抗体)的硝酸纤维膜进行包被；
[0012]6)、将包被好的巨细胞病毒(CMV)抗原(抗体)、弓形虫(TO)抗原(抗体)、风疹病毒(RV)抗原(抗体)、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原(抗体)剪下，粘贴到载体板上；
[0013]7)、标准阳性血清的获得:收集风疹病毒、巨细胞病毒、弓形体和单纯疱疹病毒病人的阳性血清，得到阳性参照血清，定为标准阳性血清，-30°C冻存；
[0014]阳性病人的血清必须经过Elisa实验，结果为阳性(显色明显，阳性OD值/阴性OD值≥2.1);经过荧光免疫实验(IFA)，结果为阳性结果。
[0015]8)、在自左至右四条对照线上分别包被巨细胞病毒抗原、弓形虫抗原、风疹病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原或分别包被含巨细胞病毒抗体、弓形虫抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体的病人阳性血清；晾干；
[0016]9)、和碱性磷酸酶标记的抗巨细胞病毒抗体、抗弓形虫抗体、抗风疹病毒抗体、抗单纯疱疹病毒抗体或巨细胞病毒抗体、弓形虫抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体及其底物(硝基蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐体积比为1:49的混合物)共同组成计生四项免疫印迹试剂盒。
[0017]本实用新型一次性快速检测计生四项、操作简单，成本低、设计新颖，易于观察并做出诊断。
【专利附图】
【附图说明】:
[0018]1、图1为酶联免疫印迹计生四项联合试剂盒的结构示意图。
【具体实施方式】:
[0019]下面通过附图和具体实施例对本实用新型做进一步阐述。
[0020]实施例1、
[0021]如图1所示，本实用新型包含载体板1、硝酸纤维素膜2粘贴在载体板I的表面，巨细胞病毒抗体(抗原)检测线3、弓形虫抗体(抗原)检测线4、风疹病毒抗体(抗原)检测线5、单纯疱疹病毒抗体(抗原)检测线6、对照线7自上而下依次设在硝酸纤维素膜(NC膜)2上，并在各检测线线和对照线四周制有温育槽8 ;在巨细胞病毒抗体(抗原)检测线3、弓形虫抗体(抗原)检测线4、风疹病毒抗体(抗原)检测线5、单纯疱疹病毒抗体(抗原)检测线6处分别包被对应的经SDS-PAGE电泳、电转后的抗原(抗体)；在对照线7处自左至右制有四条对照线9-12，分别包被巨细胞病毒抗原、弓形虫抗原、风疹病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原或分别包被含巨细胞病毒抗体、弓形虫抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体的病人阳性血清；和载体板之外的碱性磷酸酶标记的抗巨细胞病毒抗体、抗弓形虫抗体、抗风疹病毒抗体、抗单纯疱疹病毒抗体或巨细胞病毒抗体、弓形虫抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体及其底物(硝基蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐体积比例为1:49的混合物)共同组成酶联免疫印迹计生四项试剂盒。
[0022]酶联免疫印迹计生四项联合试剂盒的制备方法:
[0023]I)、巨细胞病毒(CMV)抗原(抗体)、弓形虫(TO)抗原(抗体)、风疹病毒(RV)抗原(抗体)、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原(抗体)；碱性磷酸酶标记的抗巨细胞病毒抗体、抗弓形虫抗体、抗风疹病毒抗体、抗单纯疱疹病毒抗体或碱性磷酸酶标记的巨细胞病毒抗体、弓形虫抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体市售购买；
[0024]2)、灌制SDS — PAGE电泳胶，将巨细胞病毒(CMV)抗原(抗体)、弓形虫(TO)抗原(抗体)、风疹病毒(RV)抗原(抗体)、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原(抗体)进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，然后进行脱色；依据经脱色后的电泳胶上的各病毒抗原(抗体)的条带位置进行硝酸纤维素膜上对应条带位置的标记；
[0025]3)灌制SDS - PAGE电泳胶，分别将巨细胞病毒(CMV)抗原(抗体)、弓形虫(TO)
[0026]抗原(抗体)、风 疹病毒(RV)抗原(抗体)、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原(抗体)进行SDS-PAGE电泳；
[0027]4)用电转膜移装置将电泳后的巨细胞病毒(CMV)抗原(抗体)、弓形虫(TO)抗原(抗体)、风疹病毒(RV)抗原(抗体)、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原(抗体)转至硝酸纤维膜上，电转完毕后，取出膜，用PBS缓冲液冲洗一次，晾干；
[0028]5)将含有巨细胞病毒(CMV)抗原(抗体)、弓形虫(TO)抗原(抗体)、风疹病毒(RV)抗原(抗体)、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原(抗体)的硝酸纤维膜进行包被；
[0029]6)将包被好的巨细胞病毒(CMV)抗原(抗体)、弓形虫(TO)抗原(抗体)、风疹病毒(RV)抗原(抗体)、单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原(抗体)剪下，粘贴到载体板上；
[0030]7)标准阳性血清的获得:收集风疹病毒、巨细胞病毒、弓形体和单纯疱疹病毒病人的阳性血清，得到阳性参照血清，定为标准阳性血清，-30°C冻存；
[0031]阳性病人的血清必须经过Elisa实验，结果为阳性(显色明显，阳性OD值/阴性OD值≥2.1);经过荧光免疫实验(IFA)，结果为阳性结果。
[0032]8)在自左至右四条对照线上分别包被巨细胞病毒抗原、弓形虫抗原、风疹病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原或分别包被含巨细胞病毒抗体、弓形虫抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体的病人阳性血清；晾干；
[0033]9)和碱性磷酸酶标记的抗巨细胞病毒抗体、抗弓形虫抗体、抗风疹病毒抗体、抗单纯疱疹病毒抗体或巨细胞病毒抗体、弓形虫抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体及其底物(硝基蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐体积比例为1:49的混合物)共同组成酶联免疫印迹计生四项试剂盒。[0034]实施例2、酶联免疫印迹计生四项联合试剂盒的使用方法:
[0035]1、待测标本采用0.01mol/L PBS缓冲液进行1:50稀释；
[0036]2、取出载体板，吸取待测标本0.2mL-0.3mL，加入到温育槽内，于18_25°C下温育30min ；
[0037]3、吸去槽内液体，用2mL0.01mol/L PBS缓冲液冲洗各温育槽3次，每次5min ；
[0038]4、加酶结合物:在温育槽内分别加入0.2mL-0.3mL酶结合物(采用碱性磷酸酶标记的相应的抗体)，于18_25°C下温育30min ；
[0039]5、吸取槽内液体，用2mL0.01mol/L PBS缓冲液冲洗各温育槽3次，每次5min ；
[0040]6、底物温育:在温育槽内分别加入0.2mL-0.3mL底物液:硝基蓝四唑(NBT)和5_溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)体积比例为1:49的混合物，于室温(18-25) °〇下温育IOmin ；
[0041]7、终止:吸取槽内液体，用蒸馏水清洗各温育槽3次，每次Imin。
[0042]结果判定:将各硝酸纤维素膜风干后判定结果，任一条检测线出现黑色特异性条带，就可判定为相应病 毒的阳性。
【权利要求】
1.酶联免疫印迹计生四项联合试剂盒，其特征在于包含载体板、巨细胞病毒抗体或抗原测线、弓形虫抗体或抗原检测线、风疹病毒抗体或抗原检测线、单纯疱疹病毒抗体或抗原检测线、对照线、硝酸纤维膜、温育槽；硝酸纤维素膜粘贴在载体板的表面，巨细胞病毒抗体或抗原检测线、弓形虫抗体或抗原检测线、风疹病毒抗体或抗原检测线、单纯疱疹病毒抗体或抗原检测线、对照线自上而下依次设在硝酸纤维素膜上，并在各检测线和对照线四周制有温育槽；在巨细胞病毒抗体或抗原检测线、弓形虫抗体或抗原检测线、风疹病毒抗体或抗原检测线、单纯疱疹病毒抗体或抗原检测线处分别包被对应的经SDS-PAGE电泳、电转后的抗原或抗体；在自左至右四条对照线上分别包被巨细胞病毒抗原、弓形虫抗原、风疹病毒抗原、单纯疱疹病毒抗原或分别包被含巨细胞病毒抗体、弓形虫抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体的病人阳性血清；和载体板之外的碱性磷酸酶标记的抗巨细胞病毒抗体、抗弓形虫抗体、抗风疹病毒抗体、抗单纯疱疹病毒抗体或巨细胞病毒抗体、弓形虫抗体、风疹病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体及其底物共同组成酶联免疫印迹计生四项试剂盒；其中，所述底物为硝基蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐体积比例为1:49的混合物。
【文档编号】G01N33/569GK203443963SQ201320585772
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】张述智, 苏冬梅, 夏伟 申请人:青岛中仁药业有限公司