一种检测赭曲霉素a的胶体金免疫试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测赭曲霉素A的胶体金免疫试剂盒包括检测试纸；所述检测试纸包括底板，粘合在底板上且依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维膜上靠近结合垫的一侧设有检测线，硝酸纤维膜上靠近吸水垫的一侧设有质控线；所述结合垫上涂有被赭曲霉素A单克隆抗体及单链核酸包被的胶体金；所述检测线上涂有BSA-OTA；所述质控线上涂有羊抗鼠IgG；所述单链核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述单链核酸3’端标记有巯基。该试剂盒的特点在于在标记抗体的同时，将一段单链核酸协同标记在胶体金表明，有效减低了非特异性吸附，减少标记抗体的用量，制成的免疫层析试剂盒，灵敏度达到5ng/mL。
【专利说明】一种检测赭曲霉素A的胶体金免疫试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种医疗检测产品及其制作方法，尤其涉及一种检测赭曲霉素A的胶体金免疫试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]免疫层析法是二十世纪九十年代兴起的一种基于免疫胶体颗粒的快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素膜一端接触到样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，从而实现特异性的免疫诊断。
[0003]常用的免疫层析法所用的特异识别检测物的生物大分子都是抗体，通过抗原抗体特异识别反应，标记在抗原或抗体上的免疫胶体颗粒使检测线和质控线显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。但是该方法检测不够快速和灵敏，而且用抗体检测还需要用到相应的仪器设备，操作不简便。
【发明内容】
[0004]本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种制作胶体金免疫层析检测试剂盒，通过在检测线和质控线上显示红色，来实现在样品中直接检测赭曲霉素A。
[0005]为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案为:
[0006]所述检测黄曲霉素BI的胶体金免疫试剂盒，包括检测试纸；所述检测试纸包括底板，粘合在底板上且依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维膜上靠近结合垫的一侧设有检测线，硝酸纤维膜上靠近吸水垫的一侧设有质控线；所述结合垫上涂有被鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体及单链核酸包被的胶体金；所述检测线上涂有BSA-OTA ;所述质控线上涂有羊抗鼠IgG ;所述单链核酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述单链核酸3’端标记有巯基。
[0007]优选地，所述底板为PVC板；样品垫和结合垫的材料为聚醋纤维；所述吸水垫为吸水滤纸。所述检测试纸由硬质塑料卡包装。
[0008]本发明还提供了上述试剂盒的方法，包括如下步骤:
[0009](I)用鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和如SEQ ID N0.1所示的单链核酸包被胶体金，得包被后的胶体金溶液；
[0010](2)将包被后的胶体金溶液喷于结合垫上，烘干备用；
[0011](3)在硝酸纤维膜上检测线位置喷点BSA-OTA溶液；在质控线位置喷点羊抗鼠IgG溶液，烘干备用；
[0012](4)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接并粘合于底板上，切成检测试纸条，将检测试纸条用硬质塑料卡包装。
[0013]优选地，步骤(I)胶体金直径为13_40nm。
[0014]优选地，步骤(I)所述用鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和如SEQ ID N0.1所示的单链核酸包被胶体金是指先将将鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体加入胶体金溶液，此时，胶体金溶液中胶体金颗粒浓度为3.5-4.5nmol/L,鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体浓度为3_5 μ g/mL,于2000rpm/min条件下离心去除沉淀,然后再上清中加入如SEQ ID N0.1所示的单链核酸，此时，胶体金溶液中单链核酸浓度为18-28μ g/mL，于1500rpm/min条件下离心后将沉淀溶于Tris-HCL缓冲溶液，即得包被后的胶体金溶液，备用。
[0015]优选地，步骤(I)所述用鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和如SEQ ID N0.1所示的单链核酸包被胶体金是指先将鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体与如SEQ ID N0.1所示的单链核酸混合,得到抗体核酸混合物,然后将抗体核酸混合物加入胶体金溶液中，此时,胶体金溶液中胶体金颗粒浓度为3.5-4.5nmol/L,鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体浓度为5_8 μ g/mL,单链核酸浓度为20-25 μ g/mL ;再将加入了抗体核酸混合物的胶体金溶液离心，将沉淀溶于Tris-HCL缓冲溶液，即得包被后的胶体金溶液，备用。
[0016]优选地，步骤(3)所述BSA-OTA溶液配制方法是将浓度为1_1.5mg/mLBSA-0TA溶于PBS缓冲液中得到BSA-OTA浓度为0.5-lmg/mL BSA-OTA溶液；所述羊抗鼠IgG溶液中羊抗鼠IgG的浓度为l_2mg/mL。
[0017]使用本试剂盒时，将待测标本加入到点样孔，待测标本在毛细作用下沿着样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜向吸水滤纸端方向层析；检测时，如果待测标本中的含有检测物赭曲霉素A，且浓度高于5ng/mL，赭曲霉素A先与结合垫上的金标抗体结合并使之复溶，复溶后的混合物继续层析到硝酸纤维素膜上，不再和检测线上的BSA-OTA结合，标记金颗粒继续向前，到达质控线区域时，与其上包被的羊抗鼠Ig G发生结合，显现出胶体金的红色线条，此为质控线；检测时，如果待测标本中的不含有检测物赭曲霉素A，结合垫上的金标抗体复溶，复溶后的混合物继续层析到硝酸纤维素膜上，和检测线上的BSA-OTA结合，这样检测线位置出现标记胶体金的红色，标记金颗粒继续向前，到达质控线区域时，与其上包被的羊抗鼠Ig G发生结合，显现出胶体金的红色线条，此为质控线；检测时，如果待测物中赭曲霉素A浓度低于5ng/mL，赭曲霉素A先与结合垫上的金标抗体结合并使之复溶，复溶后的混合物继续层析到硝酸纤维素膜上，再和检测线上的BSA-OTA结合，这样检测线位置也会出现标记胶体金的红色，由于免疫竞争反应，赭曲霉素A浓度比5ng/mL越低,检测线的红色越红，标记金颗粒继续向前，到达质控线区域时，与其上包被的羊抗鼠Ig G发生结合，显现出胶体金的红色线条，此为质控线。
[0018]该试剂盒的特点在于在标记抗体的同时，将一段单链核酸协同标记在胶体金表面，有效减低了非特异性吸附，减少标记抗体的用量，制成的免疫层析试剂盒，灵敏度达到5ng/mL0
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明试剂盒中检测试纸结构示意图；
[0020]图2为本发明的原理示意图；
[0021]图3为本发明检测过程示意图；有检测物:表示检测物浓度高于最低检测浓度，检测线为红色(图中为深色)；无检测物:表示检测物浓度高于最低检测浓度，检测线位置无色(图中为空白)；
[0022]图4为本发明免疫层析法检测结果判定图，其中，T表示检测线，C表示质控线。[0023]图中:1、底板；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、检测线；6、质控线；7吸水垫。
【具体实施方式】
[0024]实施例1
[0025]参见图1，所述检测赭曲霉素A的胶体金免疫试剂盒，包括检测试纸；所述检测试纸包括底板1，粘合在底板I上且依次搭接的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫7 ;所述硝酸纤维膜4上靠近结合垫3的一侧设有检测线5，硝酸纤维膜4上靠近吸水垫7的一侧设有质控线6 ;所述结合垫3上涂有被赭曲霉素A单克隆抗体及单链核酸包被的胶体金；所述检测线5上涂有BSA-OTA ;所述质控线6上涂有羊抗鼠IgG ;所述单链核酸序列为5’ -TrnTnTnTnTr-3’(SEQ ID N0.1)，所述单链核酸3’端标记有巯基，即(5’ -TTTTTTTTTTTTTTT-SH3’)。所述底板I为PVC板；样品垫2和结合垫3的材料为聚醋纤维；所述吸水垫7为吸水滤纸。所述检测试纸由硬质塑料卡包装。
[0026]试剂盒的实际使用
[0027]下面介绍本发明的使用方法，不能做为本发明的限制。
[0028]1.试剂与样品:赭曲霉素A购自SIGMA公司，葡萄酒购自超市。
[0029]2.阳性样品制备:用含50%甲醇(体积比)的0.01 M pH7.4 PBS缓冲液将赭曲霉素A配制成I μ g/mL的标准液。取葡萄酒样品lmL，加入4mL乙酸乙酯，颠倒混匀后静置5min ；取200μ L上层液体，电吹风吹干或凉干；向吹干的样品管中加入0.01 M pH7.4 PBS缓冲液1000 μ L，充分涡动或反复吹打管壁约2min，这样就获得了葡萄酒提取液。分别向8管葡萄酒提取液中加入不同体积的赭曲霉素A标准液,制成终浓度为0ng/mL、2.5ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL 的阳性样品。
[0030]3.阴样品制备:取8管葡萄酒提取液，不添加赭曲霉素A标准液，但添加与各管阳性样品所加标准液体积相同的PBS缓冲液。
[0031]4.分别从16管待检样品中吸取100 μ L液体，滴加到检测卡的样品孔中，IOmin后
观察检测结果。
[0032]5.检测结果:重复以上实验三次，阴性样品检测结果全部为阴性。阳性样品检测结果如表I所示:
[0033]表1:赭曲霉素A检测试剂盒灵敏度
[0034]
【权利要求】
1.一种检测赭曲霉素A的胶体金免疫试剂盒，包括检测试纸；所述检测试纸包括底板(1)，粘合在底板(I)上且依次搭接的样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(7);所述硝酸纤维膜(4)上靠近结合垫(3)的一侧设有检测线(5)，硝酸纤维膜(4)上靠近吸水垫(7)的一侧设有质控线(6);其特征在于，所述结合垫(3)上涂有被鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体及单链核酸包被的胶体金；所述检测线(5)上涂有BSA-OTA ;所述质控线(6)上涂有羊抗鼠IgG ;所述单链核酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述单链核酸3’端标记有巯基。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底板(I)为PVC板；样品垫(2)和结合垫(3)的材料为聚醋纤维；所述吸水垫(7)为吸水滤纸。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试纸由硬质塑料卡包装。
4.制备权利要求1至3任一项所述试剂盒的方法，包括如下步骤: (1)用鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和如SEQID N0.1所示的单链核酸包被胶体金，得包被后的胶体金溶液； (2)将包被后的胶体金溶液喷于结合垫上，烘干备用； (3)在硝酸纤维膜上检测线位置喷点BSA-OTA溶液；在质控线位置喷点羊抗鼠IgG溶液，烘干备用； (4)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接并粘合于底板上，切成检测试纸条，将检测试纸条用硬质塑料卡包装。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(I)胶体金直径为13-40nm。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述用鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和如SEQ ID N0.1所示的单链核酸包被胶体金是指先将将鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体加入胶体金溶液，此时，胶体金溶液中胶体金颗粒浓度为3.5-4.5nmol/L,鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体浓度为3-5 μ g/mL,于2000rpm/min条件下离心去除沉淀，然后再上清中加入如SEQID N0.1所示的单链核酸，此时，胶体金溶液中单链核酸浓度为18-28μ g/mL，于1500rpm/min条件下离心后将沉淀溶于Tris-HCL缓冲溶液，即得包被后的胶体金溶液，备用。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述用鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体和如SEQ ID N0.1所示的单链核酸包被胶体金是指先将鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体与如SEQ ID N0.1所示的单链核酸混合，得到抗体核酸混合物，然后将抗体核酸混合物加入胶体金溶液中，此时，胶体金溶液中胶体金颗粒浓度为3.5-4.5nmol/L,鼠抗赭曲霉素A单克隆抗体浓度为5-8 μ g/mL,单链核酸浓度为20_25 μ g/mL ;再将加入了抗体核酸混合物的胶体金溶液离心，将沉淀溶于Tris-HCL缓冲溶液，即得包被后的胶体金溶液，备用。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述BSA-OTA溶液配制方法是将浓度为1-1.5mg/mLBSA-0TA溶于PBS缓冲液中得到BSA-OTA浓度为0.5-lmg/mLBSA-OTA溶液；所述羊抗鼠IgG溶液中羊抗鼠IgG的浓度为l-2mg/mL。
【文档编号】G01N33/577GK103728451SQ201410031991
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】常荣山, 谭蔚泓 申请人:湖南大学