一种利拉鲁肽生物学活性的检测方法
【专利摘要】本发明以细胞内3’,5’-环腺苷酸（cAMP）水平的变化作为检测指标，采用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法测定利拉鲁肽生物学活性。通过培养大鼠胰岛瘤细胞RIN-m5F，分别加入稀释后的利拉鲁肽对照品溶液和供试品溶液，用试剂盒检测刺激后细胞内cAMP水平变化，用多功能酶标仪的超灵敏化学发光检测模块读取相对化学发光单位（RLU），然后利用统计软件拟合实验数据，通过公式计算供试品的生物学活性。该方法能简便、快速、准确地检测利拉鲁肽生物学活性的变化，其准确性和重复性符合生物制品生物学活性测定方法的要求。
【专利说明】一种利拉鲁肽生物学活性的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种利拉鲁肽生物学活性的测定方法。
发明背景
[0002]糖尿病在世界范围内日益严重威胁人类健康。胰高血糖素样肽-l(glucagon-likepeptide-1),简称GLP-1，是肠道L细胞分泌的一种多肽类激素，具有促进胰岛素分泌、促进胰岛β细胞增殖和分化的功能。它通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空发挥降血糖的作用。由于它对胰岛素的刺激具有葡萄糖依赖性，因此不引发低血糖症状。
[0003]天然GLP-1因半衰期短(仅I?2分钟)不适合临床应用。利拉鲁肽与GLP-1有97%的同源性，在临床上用于成人2型糖尿病患者控制血糖。其分子结构与天然人GLP-1分子的不同之处是:第34位的赖氨酸被精氨酸取代，第26位的赖氨酸上增加了一个由谷氨酸介导的16碳脂肪酸侧链。利拉鲁肽半衰期长达13小时，每日只需皮下注射I次，即可有效控制血糖24小时。
[0004]生物制品的生物学活性是生物制品质量评价的重要指标，因此利拉鲁肽的生物学活性测定方法是利拉鲁肽质量研究的重点之一。目前利拉鲁肽生物学活性欠缺简便、快速、准确的测定方法。
[0005]利拉鲁肽属于GLP-1类似物，它与细胞膜上GLP-1受体(G蛋白偶联受体)相互作用后，细胞内腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)被激活,导致胞内cAMP水平升高。胞内cAMP水平检测法被广泛用于定量测定GLP-1及其类似物的体外生物学活性，属于细胞基础的受体结合法。利拉鲁肽原研厂为novo nordisk公司。在该公司专利CN97198413.1中为检测GLP-1衍生物的生物活性，测定了它们在表达人胰腺GLP-1受体的细胞系内刺激cAMP形成的能力，使用了幼仓鼠肾细胞(BHK)和闪烁亲近测定法(说明书第61/62页)。由于表达人胰腺GLP-1受体的幼仓鼠肾细胞难以获得；而且闪烁亲近测定法使用了放射性同位素，对人体有危害，因此需要开发一种操作简单、安全可靠的利拉鲁肽生物活性测定方法。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种利用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法测定利拉鲁肽生物学活性的新方法，从而解决了利拉鲁肽生物学活性测定的难题。
[0007]目前实验中，大多数使用的是放射性同位素测定法和cAMP酶联免疫反应分析法来测定胞内cAMP水平。但是放射性同位素对人体有危害，实验操作不方便。而cAMP酶联免疫反应分析法通过ELISA方法测定，该方法步骤繁琐，整个实验过程周期较长，而且实验误差相对较大，因而结果不是非常理想。
[0008]本申请发明通过大量实验和对比研究后，第一次创造性地将cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法原理应用于利拉鲁肽的生物学活性测定。cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法原理是:裂解细胞释放出胞内cAMP，cAMP激活蛋白激酶A催化蛋白质磷酸化反应而消耗ATP。ATP的减少反映为化学发光信号的减弱。cAMP水平越高，蛋白激酶A的活性就越高，消耗ATP更多，从而化学发光信号越弱。
[0009]发明人发现相比于cAMP酶联免疫反应分析法，cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法更为方便，实验步骤少，试验结果更为精确，误差相对较小，因而是一种比较理想的测定胞内cAMP水平的方法。
[0010]因而，本发明建立了一种利拉鲁肽生物学活性的检测方法，所述方法包括如下步骤:
[0011](I)分别制备利拉鲁肽对照品溶液和供试品溶液，设置稀释浓度梯度；
[0012](2)培养大鼠胰岛瘤细胞RIN-H15F后，加入步骤(1)中制备的对照品及供试品溶液刺激细胞；
[0013](3)用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒检测利拉鲁肽刺激后细胞内cAMP水平变化，用酶标仪的化学发光检测模块读取相对化学发光单位(RLU)。
[0014](4)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以相对化学发光单位为纵坐标，利用统计软件拟合实验数据，得到利拉鲁肽的剂量效应曲线，计算出供试品和对照品的半效稀释倍数，按照以下公式计算供试品的生物学活性:
[0015]供试品生物学活性
【权利要求】
1.一种利拉鲁肽生物学活性的检测方法，所述方法包括如下步骤: (1)分别制备利拉鲁肽对照品溶液和供试品溶液，设置稀释浓度梯度； (2)培养大鼠胰岛瘤细胞RIN-m5F后，加入步骤(1)中制备的对照品及供试品溶液刺激细胞； (3)用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒检测利拉鲁肽刺激后细胞内cAMP水平变化，用酶标仪的化学发光检测模块读取相对化学发光单位(RLU)； (4)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以相对化学发光单位为纵坐标，利用统计软件拟合实验数据，得到利拉鲁肽的剂量效应曲线，计算出供试品和对照品的半效稀释倍数，按照以下公式计算供试品的生物学活性:
供试品生物学活性
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述方法步骤(1)中，利拉鲁肽对照品溶液及供试品溶液根据其初始浓度进行预稀释，以使预稀释后得到利拉鲁肽对照品和供试品的浓度接近或相同；由利拉鲁肽对照品溶液及供试品溶液的初始浓度和最后设定的预稀释浓度确定利拉鲁肽对照品溶液的预稀释倍数(Dr)和供试品溶液的预稀释倍数(Ds)。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于:所述方法步骤(1)中，预稀释后的利拉鲁肽对照品溶液及供试品溶液的浓度范围为0.0OOl~lmg/ml。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于:所述方法步骤(1)中，在预稀释的基础上，对利拉鲁肽对照品和供试品进行进一步的稀释，制备得到系列浓度梯度的拉鲁肽对照品和供试品，稀释倍数范围为I倍至200万倍，在此范围内根据实验情况选择稀释的倍数。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述方法步骤(1)中，稀释溶液为PH范围7.2-9.5的、浓度为1-1OOmM的缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述方法步骤(2)中，RIN-m5F细胞的培养可选择预先铺在细胞培养板中，置25°C -45°CU% -10%二氧化碳培养箱中静置培养2-5天。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述方法步骤(2)中，RIN-m5F细胞在细胞培养器中培养后，吸去培养孔中上清，然后加入利拉鲁肽药物刺激细胞，将细胞培养容器在25-45 °C放置1-30分钟。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述方法步骤(2)中，RIN-m5F细胞的培养可以在步骤(1)所述的利拉鲁肽对照品和供试品溶液的配制之前、与其同时或者在其之后；在细胞培养好之后，再选择加入利拉鲁肽样品进行刺激。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述方法步骤(3冲，cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒为Promega公司的cAMP_Glo?Max Assay试剂盒。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述方法步骤(4)中，利用统计软件进行实验数据拟合时，利用四参数方程拟合实验数据，四参数方程的公式可表示为:Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+1CT ((LogEC50_X)*HiIISlope))； 拟合出利拉鲁肽剂量效应曲线的四个参数Top，Bottom，LogEC50和HillSlope，可得到供试品和对照品的半效稀释倍数或半效浓度(EC50)，然后计算供试品的相对活性和生物学活性 。
【文档编号】G01N21/76GK103884846SQ201410079787
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】卢旻衎, 周亮, 曹阳, 戎亚雯, 吉鹏飞, 马国昌 申请人:杭州九源基因工程有限公司