一种检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法【专利摘要】本发明公开了一种检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，包括，富集油脂中极性组分的步骤；将富集到的极性组分分为三组，第一组添加内标物3-MCPD-d5，第二组在酸催化醇解后添加内标物3-MCPD-d5，第三组经固相萃取柱处理后进行酸催化醇解并添加内标物3-MCPD-d5处理的步骤；将处理后三组混合物进行苯硼酸衍生化处理分别得到衍生产物的步骤；将得到的衍生产物分别进行GC-MS检测的步骤；以及，计算油脂中游离及结合3-MCPD的含量的步骤。本方法可将油脂中3-MCPD不同存在形式的含量分别进行检测，得到游离3-MCPD、3-MCPD单酯和3-MCPD双酯的含量数据。【专利说明】—种检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及油脂样品中危害因子的检测方法，尤其涉及油脂中游离及结合3-MCPD含量的检测方法。【
背景技术：
】[0002]大量毒理学研究表明，3-氯-1，2-丙二醇(即游离3-MCPD)具有减少精子数，降低精子活性，并干扰体内性激素平衡而减弱雄性动物生殖能力的作用，它可使大鼠致癌，具有潜在的致癌性，且具有肾脏、肝脏和生殖毒性，能造成肾小管增生及肝功能损伤，在体外具有遗传毒性(ElRamy,R.，OuldElhkim,M.，Lezmi,S.，Poul,J.M.，Evaluationofthegenotoxicpotentialof3-monochloropropane-l,2-diol(3-MCPD)anditsmetabolites,glycidolandbeta-chlorolacticacid,usingthesinglecellgel/cometassay.FoodChemToxicol.2007,45,41-48；Cho,ff.S.,Han,B.S.,Lee,H.,Kim,C.,Nam,K.T.,Park,K.,Choi,M.,Kim,S.J.,Kim,S.H.,Jeong,J.,Jang,D.D.,Subchronictoxicitystudyof3-monochloropropane-l,2-dioladministeredbydrinkingwatertoB6C3Flmice.FoodChemToxicol.2008，46，1666-1673；Cho,ff.S.，Han,B.S.,Nam,K.T.,Park,K.,Choi,M.,Kim,S.H.,Jeong,J.,Jang,D.D.,Carcinogenicitystudyof3-monochloropropane-l,2-diolinSprague-Dawleyrats.FoodChemToxicol.2008,46,3172-3177;Kim,K.,Differentialexpressionofneuronalandinduciblenitricoxidesynthaseinratbrainaftersubchronicadministrationof3-monochloro-l,2-propanediol.FoodChemToxicol.2008，46，955-960)。鉴于3-MCPD的毒性，2001年6月WH0/FA0食品添加剂联合专家委员会(JECFA)第57次会议对3-MCPD的危险性进行了评估，根据最敏感的肾脏毒性提出暂定3-MCPD人体每日最大耐受摄入量(PMTDI)为2μg/kg体重(以安全系数为500计)((JECFA),J.F.ff.E.C.0.F.A.:Safetyevaluationofcertainfoodadditivesandcontaintspreparedbythefifty-seventhmeetingoftheJointFAO/WHOExpertComitteeonFoodAdditives(JECFA),in:WHOFoodAdditivesSeries48,WHO,Genevs2002,pp.401-432)。油脂中结合3-MCPD以3-氯-1，2_丙二醇酯(3-MCPDE)的形式存在，是油脂及含油脂食品在热加工过程中形成的副产物。3-MCPDE是3-MCPD的一个或两个羟基分别与脂肪酸发生酯化反应而生成的化合物，有3-氯-1，2-丙二醇双酯、3-氯-1，2-丙二醇-1-单酯、3-氯-1，2-丙二醇-2-单酯三种。由于3-MCPDE在特定的条件下可水解形成游离的3-MCPD从而表现其毒性，因此研究学者认为其是一种潜在的食品安全危害因子。[0003]最新研究表明3-氯-1，2-丙二醇-1-单酯的毒性要高于3-氯-1，2-丙二醇双酯(Liu，Μ.，Gao,B.Y.，Qin,F.，Wu,P.P.，Shi,H.M.，Luo,ff.，Ma,A.N.，Jiang,Y.R.，Xu,X.B.,Yu,L.L.,Acuteoraltoxicityof3-MCPDmono-andd1-palmiticestersinSwissmiceandtheircytotoxicityinNRK-52Eratkidneycells.FoodChemToxicol.2012，50，3785-3791)，它们都可作为肠道脂肪酶的底物，但3-氯_1，2_丙二醇-1-单酯生成3-MCPD的速率要快于3-氯-1，2-丙二醇双酯(Seefelder，ff.，Varga,N.,Studer,A.,Williamson,G.,ScanIan,F.P.,Stadler,R.H.,Estersof3-chloro-l,2-propanediol(3-MCPD)invegetableoils:significanceintheformationof3-MCPD.Foodadditives&contaminants.PartA,Chemistry,analysis,control,exposure&riskassessment.2008，25，391-400)，前者可被Caco_2细胞水解，后者则明显被Caco_2细胞吸收和代谢(Buhrke,T.,ffeisshaar,R.,Lampen,A.,Absorptionandmetabolismofthefoodcontaminant3-chloro_l,2-propanediol(3-MCPD)anditsfattyacidestersbyhumanintestinalCaco-2cells.ArchToxicol.2011,85,1201-1208)。因此有如下结论:在人体肠道中3-氯-1，2-丙二醇-1-单酯可水解，肠道细胞有能力代谢3-氯-1，2-丙二醇双酯，从而使3-氯-1，2-丙二醇-1-单酯的毒性高于3-氯-1，2-丙二醇双酉旨(Buhrke,T.,ffeisshaar,R.,Lampen,A.,Absorptionandmetabolismofthefoodcontaminant3-chloro_l,2-propanediol(3-MCPD)anditsfattyacidestersbyhumanintestinalCaco-2cells.ArchToxicol.2011,85,1201-1208)。基于上述研究结论，3-MCPD单酯对人体健康的危害更大些，为进一步研究油脂中3-MCPDE这种潜在的食品安全危害因子对人体健康的危害程度，准确的测定出不同存在形式的3-MCPD(尤其是3-MCPD单酯)含量是非常关键的。[0004]文献报道的检测油脂中游离及结合3-MCPD的方法中，根据所针对的目标化合物的种类，可以大体分为两类:间接法和直接法。间接法是通过将结合3-MCPD通过碱催化、酶催化或酸催化的方法进行醇解后生成游离3-MCPD，再对游离3-MCPD进行衍生化反应后通过GC-MS检测；直接法是将结合3-MCPD通过LC-MS进行分析，而不需进行醇解操作。由于油脂组成中脂肪酸的种类较多，按照植物油中主要的7种脂肪酸来计算，3-MCPDE在甘油骨架sn-1、sn-2位的排列组合的种类就有63种之多，若将其余种类的脂肪酸也统计进来，3-MCPDE的种类将更加繁多。直接测定方法的主要缺陷就在于可商品化供应的3-氯丙醇酯及相应的氘代3-氯丙醇酯的种类有限，无法从市场上购买到不同碳数脂肪酸组成的3-氯丙醇酯及相应的氘代3-氯丙醇酯化合物标准品，要想对油脂样品中的3-氯丙醇酯用3-氯丙醇酯及相应的氘代3-氯丙醇酯化合物标准品进行一一的对应非常困难。因此，目前研究学者多数采用间接法对游离及结合3-MCPD进行检测。但是目前将油脂中3-MCPD不同存在形式的含量分别进行检测的方法尚未见文献报道。【
发明内容】[0005]本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。[0006]鉴于上述和/或现有检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法中存在的问题，提出了本发明。[0007]因此，本发明的目的是提供了一种灵敏度高、重复性好的用于检测油脂中游离及结合3-MCPD含量的方法，在食品、医药、环境等许多分析领域有着较高的应用价值。[0008]为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案:一种检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，包括，富集油脂中极性组分的步骤；将富集到的极性组分分为三组，第一组添加内标物3-MCPD-d5，第二组在酸催化醇解后添加内标物3-MCPD-d5，第三组经固相萃取柱处理后进行酸催化醇解并添加内标物3-MCPD-d5处理的步骤；将处理后三组混合物进行苯硼酸衍生化处理分别得到衍生产物的步骤；将得到的衍生产物分别进行GC-MS检测的步骤；以及，计算油脂中游离及结合3-MCPD的含量的步骤。[0009]作为本发明所述检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一种优选方案，其中:所述富集油脂中极性组分的步骤中采用的富集方法为，称取油脂并添加油脂体积2.5?6倍的乙腈，旋涡振荡充分混匀，待分层后将乙腈相转出，真空条件下50?55°C旋转蒸发挥干乙腈得到干残渣。[0010]作为本发明所述检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一种优选方案，其中:将所述干残渣用体积比乙醚:正己烷=2:98的乙醚-正己烷溶液溶解，上样到活化好的硅胶SPE固相萃取柱，用体积比乙醚:正己烷=2:98的乙醚-正己烷洗脱，并收集洗脱液，于55°C旋转蒸发挥干溶剂得到残留物。[0011]作为本发明所述检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一种优选方案，其中:将所述干残渣和所述残留物分别用THF溶解并添加98%浓度的硫酸与甲醇体积比1:100?1.8:100的溶液，40°C水浴加热16?24h，室温冷却，加饱和碳酸氢钠溶液中和，旋涡振荡充分混匀，添加适量氘代3-氯-1，2-丙二醇内标，真空条件下旋转蒸发挥干溶齐U，然后用超纯水溶解，添加正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，再次添加正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，水相用于后续衍生化处理。[0012]作为本发明所述检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一种优选方案，其中:将所述干残渣用THF溶解，添加浓度0.001mg/mL的内标3-MCPD_d5，真空条件下旋转蒸发挥干溶剂，然后用超纯水溶解，添加正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，再次添加正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，水相用于后续衍生化处理。[0013]作为本发明所述检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一种优选方案，其中:将得到的所述水相，添加衍生剂，于80?90°C水浴加热30?40min后室温冷却，加入适量正己烷，旋涡振荡，充分混匀，静置分层后将上层正己烷相移入塑料离心管中，10000转/分，离心分离lOmin，将上层正己烷相进行有机滤膜过滤后转入玻璃进样瓶中，准备进行GC-MS分析。[0014]作为本发明所述检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一种优选方案，其中:所述的GC-MS检测采用的色谱柱为TR-5MS，程序升温条件为，以10°C/min速率从50°C升至190°C，然后以30°C/min速率从190°C升至270°C，在270°C保持5min，以30C/min速率从270°C升至300°C，在300°C保持IOmin。[0015]作为本发明所述检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法的一种优选方案，其中:所述的计算油脂中游离及结合3-MCPD含量的方法为，将所述第一组中添加内标物3-MCPD-d5，然后进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为Al;将所述第二组中酸催化醇解后添加内标物3-MCPD-d5，然后进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为A2;将所述第三组中固相萃取柱处理后进行酸催化醇解并添加内标物3-MCPD-d5，然后进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为A3;游离3-MCPD含量记为B，结合3-MCPD中3-MCPD单酯记为C1，3_MCPD双酯记为C2，则计算公式为B=Al,C1=A2-A1-A3,C2=A3。[0016]本发明方法包括富集油脂中的极性组分、将得到的极性组分分别进行添加内标物3-MCPD-d5、酸催化醇解后添加内标物3-MCPD-d5和固相萃取柱前处理后进行酸催化醇解并添加内标物3-MCPD-d5的处理后进行苯硼酸衍生化处理、衍生产物进行GC-MS检测并计算油脂中游离及结合3-MCPD含量的步骤，可将油脂中3-MCPD不同存在形式的含量分别进行检测，得到游离3-MCPD、3-MCPD单酯和3-MCPD双酯的含量数据。【具体实施方式】[0017]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。[0018]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。[0019]其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。[0020]实施例1[0021]用于油脂中游离及结合3-MCPD含量的检测方法:[0022]量取IOmL—级大豆油(准确称量其质量为9.12g)于50mL螺旋盖玻璃试管中，添加25mL乙腈，旋涡振荡，充分混匀I?3min之后静置分层约I小时，用一次性吸管将上层乙腈相移入25mL量筒中，读取乙腈相的体积数并准确记录，然后将量筒中的乙腈相移入IOOmL圆底烧瓶中，并用适量乙腈(约3mL)清洗量筒，清洗用的乙腈并入IOOmL圆底烧瓶中，于55°C，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂4°C冰箱冷藏备用。[0023](I)游离型的3-MCPD测定的进一步处理:[0024]上述残渣用2.5mL四氢呋喃(THF)溶解，移取ImL该四氢呋喃溶液添加ImL内标3-MCPD-d5(浓度0.001mg/mL)移入25mL圆底烧瓶中，于55°C，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂，残渣用2mL超纯水重溶，用一次性吸管将水相移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行后续GC-MS分析的衍生化处理。[0025](2)结合型的3-MCPD测定的进一步处理:[0026]上述残渣用2.5mL四氢呋喃(THF)溶解，移取ImL该四氢呋喃溶液添加1.8mL硫酸液(98%浓度，1.8mL溶在IOOmL甲醇中)移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，然后密闭，40°C水浴加热16h，室温冷却，加0.5mL饱和碳酸氢钠溶液(5%浓度)中和，振荡混匀，加ImL内标3-MCPD-d5(浓度0.001mg/mL)，将混合物转入25mL圆底烧瓶中，并用适量THF(约2mL)清洗圆底烧瓶，清洗用的THF并入25mL圆底烧瓶中，于55°C，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂，残洛用2mL超纯水重溶,用一次性吸管将水相移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行后续GC-MS分析的衍生化处理。[0027](3)3-MCPD双酯测定的进一步处理:[0028]上述残渣用20mL浓度2%的乙醚-正己烷(乙醚:正己烷=2:98(体积比))溶解，移取ImL该溶解液并用2%的乙醚-正己烷(乙醚:正己烷=2:98(体积比))定容至10mL，将定容后的2mL样品上样到活化好的硅胶SPE固相萃取柱(505048SupelcoSupelcleanTMLC-SiSPETubebed)，用11.5mL浓度2%的乙醚-正己烷洗脱并收集洗脱液(共收集13.5mL于圆底烧瓶中)，于55°C旋转蒸发挥干溶剂，添加ImLTHF移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，添加1.8mL硫酸液(98%浓度，1.8mL溶在IOOmL甲醇中)，密闭，40°C水浴加热16h—室温冷却，加0.5mL饱和碳酸氢钠溶液(5%浓度)中和，振荡混匀，加ImL内标3-MCPD_d5(浓度0.001mg/mL)，将混合物转入25mL圆底烧瓶中，并用适量THF(约2mL)清洗圆底烧瓶，清洗用的THF并入25mL圆底烧瓶中，于55°C，真空条件下，旋转蒸发，残渣用2mL水(娃哈哈纯净水)重溶，用一次性吸管将水相移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烧，旋涡振荡，充分混匀I?3min后静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min后静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行苯硼酸衍生化。[0029]苯硼酸衍生化处理:[0030]将ImL上述水相添加400μL衍生剂(5g苯硼酸溶解于19mL丙酮+ImL水)移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，密闭，90°C水浴加热30min，室温冷却后加入3mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min后静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相约2mL移入塑料离心管中，于10000转/分，离心分离IOmin后将上层正己烷相进行有机滤膜过滤后转入2mL玻璃进样瓶中，用封口膜封口，于冰箱冷冻室储藏备用，准备进行GC-MS分析。[0031]苯硼酸衍生产物的GC-MS检测:[0032]采用的色谱柱为TR-5MS(0.25mmX30m,0.25μm)，程序升温条件为:以10°C/min速率从50°C(Imin)升至190°C，然后以30°C/min速率从190°C升至270°C，在270°C保持5min,以3°C/min速率从270°C升至300°C，在300°C保持IOmin；内标3-MCPD_d5用于定量。[0033]计算油脂中游离及结合3-MCPD含量的方法:[0034]将权利要求1所述的步骤(2)中添加内标物3-MCPD_d5、进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为Al，将权利要求1所述的步骤(2)中酸催化醇解后添加内标物3-MCPD-d5、进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为A2，将权利要求1所述的步骤(2)中固相萃取柱前处理后进行酸催化醇解并添加内标物3-MCPD-d5、进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为A3，游离3-MCPD含量记为B，结合3-MCPD中3-MCPD单酯记为C1、3-MCPD双酯记为C2[0035]检测的Al为2.4μg/kg,A2为4.5μg/kg,A3为4μg/kg。[0036]根据计算公式B=Al，为2.4μg/kg;C1=A2-A1_A3，为0.5μg/kg,C2=A3,为4μg/kgο[0037]实施例2[0038]用于油脂中游离及结合3-MCPD含量的检测方法:[0039]量取IOmL食用调和油(准确称量其质量为9.02g)于50mL螺旋盖玻璃试管中，添加25mL乙腈，旋涡振荡，充分混匀I?3min之后静置分层约I小时，用一次性吸管将上层乙腈相移入25mL量筒中，读取乙腈相的体积数并准确记录，然后将量筒中的乙腈相移入IOOmL圆底烧瓶中，并用适量乙腈(约3mL)清洗量筒，清洗用的乙腈并入IOOmL圆底烧瓶中，于55°C，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂4°C冰箱冷藏备用。[0040](I)游离型的3-MCPD测定的进一步处理:[0041]上述残渣用2.5mL四氢呋喃(THF)溶解，移取ImL该四氢呋喃溶液添加ImL内标3-MCPD-d5(浓度0.001mg/mL)移入25mL圆底烧瓶中，于55°C，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂，残渣用2mL超纯水重溶，用一次性吸管将水相移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行后续GC-MS分析的衍生化处理。[0042](2)结合型的3-MCPD测定的进一步处理:[0043]上述残渣用2.5mL四氢呋喃(THF)溶解，移取ImL该四氢呋喃溶液添加1.8mL硫酸液(98%浓度，1.8mL溶在IOOmL甲醇中)移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，然后密闭，40°C水浴加热16h，室温冷却，加0.5mL饱和碳酸氢钠溶液(5%浓度)中和，振荡混匀，加ImL内标3-MCPD-d5(浓度0.001mg/mL)，将混合物转入25mL圆底烧瓶中，并用适量THF(约2mL)清洗圆底烧瓶，清洗用的THF并入25mL圆底烧瓶中，于55°C，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂，残洛用2mL超纯水重溶,用一次性吸管将水相移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行后续GC-MS分析的衍生化处理。[0044](3)3-MCPD双酯测定的进一步处理:[0045]上述残渣用20mL浓度2%的乙醚-正己烷(乙醚:正己烷=2:98(体积比))溶解，移取ImL该溶解液并用2%的乙醚-正己烷(乙醚:正己烷=2:98(体积比))定容至IOmL，将定容后的2mL样品上样到活化好的硅胶SPE固相萃取柱(7086-03硅胶SPE萃取柱J.T.Baker),用11.5mL浓度2%的乙醚-正己烷洗脱并收集洗脱液(共收集13.5mL于圆底烧瓶中)，于55°C旋转蒸发挥干溶剂，添加ImLTHF移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，添加1.8mL硫酸液(98%浓度，1.8mL溶在IOOmL甲醇中)，密闭，40°C水浴加热16h—室温冷却，加0.5mL饱和碳酸氢钠溶液(5%浓度)中和，振荡混匀，加ImL内标3-MCPD-d5(浓度0.001mg/mL)，将混合物转入25mL圆底烧瓶中，并用适量THF(约2mL)清洗圆底烧瓶，清洗用的THF并入25mL圆底烧瓶中，于55°C，真空条件下，旋转蒸发，残渣用2mL水(娃哈哈纯净水)重溶，用一次性吸管将水相移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min后静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min后静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行苯硼酸衍生化。[0046]苯硼酸衍生化处理:[0047]将ImL上述水相添加400μL衍生剂(5g苯硼酸溶解于19mL丙酮+ImL水)移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，密闭，80°C水浴加热40min，室温冷却后加入3mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min后静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相约2mL移入塑料离心管中，于10000转/分，离心分离IOmin后将上层正己烷相进行有机滤膜过滤后转入2mL玻璃进样瓶中，用封口膜封口，于冰箱冷冻室储藏备用，准备进行GC-MS分析。[0048]苯硼酸衍生产物的GC-MS检测:[0049]采用的色谱柱为TR-5MS(0.25mmX30m,0.25μm)，程序升温条件为:以10°C/min速率从50°C(Imin)升至190°C，然后以30°C/min速率从190°C升至270°C，在270°C保持5min,以3°C/min速率从270°C升至300°C，在300°C保持IOmin；内标3-MCPD_d5用于定量。[0050]计算油脂中游离及结合3-MCPD含量的方法:[0051]将权利要求1所述的步骤(2)中添加内标物3-MCPD_d5、进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为Al，将权利要求1所述的步骤(2)中酸催化醇解后添加内标物3-MCPD-d5、进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为A2，将权利要求1所述的步骤(2)中固相萃取柱前处理后进行酸催化醇解并添加内标物3-MCPD-d5、进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为A3，游离3-MCPD含量记为B，结合3-MCPD中3-MCPD单酯记为C1、3-MCPD双酯记为C2[0052]检测的Al为63.8μg/kg,A2为17.9μg/kg,A3为15.9μg/kg。[0053]根据计算公式B=Al，为63.8μg/kg;C1=A2-A1_A3，为2.0μg/kg,C2=A3，为15.9μg/kg。[0054]实施例3[0055]用于油脂中游离及结合3-MCPD含量的检测方法:[0056]量取IOmL玉米胚芽油(准确称量其质量为9.13g)于50mL螺旋盖玻璃试管中，添加25mL乙腈，旋涡振荡，充分混匀I?3min之后静置分层约I小时，用一次性吸管将上层乙腈相移入25mL量筒中，读取乙腈相的体积数并准确记录，然后将量筒中的乙腈相移入IOOmL圆底烧瓶中，并用适量乙腈(约3mL)清洗量筒，清洗用的乙腈并入IOOmL圆底烧瓶中，于55°C，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂4°C冰箱冷藏备用。[0057](I)游离型的3-MCPD测定的进一步处理:[0058]上述残渣用2.5mL四氢呋喃(THF)溶解，移取ImL该四氢呋喃溶液添加ImL内标3-MCPD-d5(浓度0.001mg/mL)移入25mL圆底烧瓶中，于55°C，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂，残渣用2mL超纯水重溶，用一次性吸管将水相移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行后续GC-MS分析的衍生化处理。[0059](2)结合型的3-MCPD测定的进一步处理:[0060]上述残渣用2.5mL四氢呋喃(THF)溶解，移取ImL该四氢呋喃溶液添加1.8mL硫酸液(98%浓度，1.8mL溶在IOOmL甲醇中)移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，然后密闭，40°C水浴加热16h，室温冷却，加0.5mL饱和碳酸氢钠溶液(5%浓度)中和，振荡混匀，加ImL内标3-MCPD-d5(浓度0.001mg/mL)，将混合物转入25mL圆底烧瓶中，并用适量THF(约2mL)清洗圆底烧瓶，清洗用的THF并入25mL圆底烧瓶中，于55°C，真空条件下，旋转蒸发挥干溶剂，残洛用2mL超纯水重溶,用一次性吸管将水相移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min，静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行后续GC-MS分析的衍生化处理。[0061](3)3-MCPD双酯测定的进一步处理:[0062]上述残渣用20mL浓度2%的乙醚-正己烷(乙醚:正己烷=2:98(体积比))溶解，移取ImL该溶解液并用2%的乙醚-正己烷(乙醚:正己烷=2:98(体积比))定容至10mL，将定容后的2mL样品上样到活化好的硅胶SPE固相萃取柱(CertifiedSep-PakSilica[186004615]WaterS)，用11.5mL浓度2%的乙醚-正己烷洗脱并收集洗脱液(共收集13.5mL于圆底烧瓶中)，于55°C旋转蒸发挥干溶剂，添加ImLTHF移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，添加1.8mL硫酸液(98%浓度，1.8mL溶在IOOmL甲醇中)，密闭，40°C水浴加热16h—室温冷却，加0.5mL饱和碳酸氢钠溶液(5%浓度)中和，振荡混匀，加ImL内标3-MCPD_d5(浓度0.001mg/mL)，将混合物转入25mL圆底烧瓶中，并用适量THF(约2mL)清洗圆底烧瓶，清洗用的THF并入25mL圆底烧瓶中，于55°C，真空条件下，旋转蒸发，残渣用2mL水(娃哈哈纯净水)重溶，用一次性吸管将水相移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，加入2mL正己烧，旋涡振荡，充分混匀I?3min后静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，再次加入2mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min后静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相移出并舍弃，水相准备进行苯硼酸衍生化。[0063]苯硼酸衍生化处理:[0064]将ImL上述水相添加400μL衍生剂(5g苯硼酸溶解于19mL丙酮+ImL水)移入IOmL螺旋盖玻璃试管中，密闭，85°C水浴加热35min，室温冷却后加入3mL正己烷，旋涡振荡，充分混匀I?3min后静置分层，用一次性吸管将上层正己烷相约2mL移入塑料离心管中，于10000转/分，离心分离IOmin后将上层正己烷相进行有机滤膜过滤后转入2mL玻璃进样瓶中，用封口膜封口，于冰箱冷冻室储藏备用，准备进行GC-MS分析。[0065]苯硼酸衍生产物的GC-MS检测:[0066]采用的色谱柱为TR-5MS(0.25mmX30m,0.25μm)，程序升温条件为:以10°C/min速率从50°C(Imin)升至190°C，然后以30°C/min速率从190°C升至270°C，在270°C保持5min,以3°C/min速率从270°C升至300°C，在300°C保持IOmin；内标3-MCPD_d5用于定量。[0067]计算油脂中游离及结合3-MCPD含量的方法:[0068]将权利要求1所述的步骤(2)中添加内标物3-MCPD_d5、进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为Al，将权利要求1所述的步骤(2)中酸催化醇解后添加内标物3-MCPD-d5、进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为A2，将权利要求1所述的步骤(2)中固相萃取柱前处理后进行酸催化醇解并添加内标物3-MCPD-d5、进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为A3，游离3-MCPD含量记为B，结合3-MCPD中3-MCPD单酯记为C1、3-MCPD双酯记为C2[0069]检测的Al为20.1μg/kg,A2为Oμg/kg,A3为Oμg/kg。[0070]根据计算公式B=Al，为20.1μg/kg;C1=A2-A1_A3，为Oμg/kg，C2=A3，为Oμg/kg。[0071]由此可见，本发明方法所用到的固相萃取柱具有如下优点:无筛板，完美避免了由筛板引起的“非特异性吸附”;填料稳固性能良好，不会出现常见的填料松散等问题；整体填料一体化设计，有效避免了“沟渠效应”;可选用粒径低至8?10微米的填料，极大地提高了分离效能和载样量。目前在固相萃取柱中最常用的吸附剂仍然是硅胶或键合硅胶，其PH适用范围2?8。本发明方法包括富集油脂中的极性组分、将得到的极性组分分别进行添加内标物3-MCPD_d5、酸催化醇解后添加内标物3-MCPD_d5和固相萃取柱如处理后进行酸催化醇解并添加内标物3-MCPD-d5的处理后进行苯硼酸衍生化处理、衍生产物进行GC-MS检测并计算油脂中游离及结合3-MCPD含量的步骤，可将油脂中3-MCPD不同存在形式的含量分别进行检测，得到游离3-MCPD、3-MCPD单酯和3-MCPD双酯的含量数据。[0072]应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。【权利要求】1.一种检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:包括，富集油脂中极性组分的步骤；将富集到的极性组分分为三组，第一组添加内标物3-MCPD-d5，第二组在酸催化醇解后添加内标物3-MCPD-d5，第三组经固相萃取柱处理后进行酸催化醇解并添加内标物3-MCPD-d5处理的步骤；将处理后三组混合物进行苯硼酸衍生化处理分别得到衍生产物的步骤；将得到的衍生产物分别进行GC-MS检测的步骤；以及，计算油脂中游离及结合3-MCPD的含量的步骤。2.根据权利要求1所述的检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:所述富集油脂中极性组分的步骤中采用的富集方法为，称取油脂并添加油脂体积2.5~6倍的乙腈，旋涡振荡充分混匀，待分层后将乙腈相转出，真空条件下50~55°C旋转蒸发挥干乙腈得到干残渣。3.根据权利要求2所述的检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:将所述干残渣用体积比乙醚:正己烷=2:98的乙醚-正己烷溶液溶解，上样到活化好的硅胶SPE固相萃取柱，用体积比乙醚:正己烷=2:98的乙醚-正己烷洗脱，并收集洗脱液，于55°C旋转蒸发挥干溶剂得到残留物。4.根据权利要求2或3所述的检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:将所述干残渣和所述残留物分别用THF溶解并添加98%浓度的硫酸与甲醇体积比1:100~1.8:100的溶液，40°C水浴加热16~24h，室温冷却，加饱和碳酸氢钠溶液中和，旋涡振荡充分混匀，添加适量氘代3-氯-1，2-丙二醇内标，真空条件下旋转蒸发挥干溶剂，然后用超纯水溶解，添加正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，再次添加正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，水相用于后续衍生化处理。5.根据权利要求2所述的检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:将所述干残渣用THF溶解，添加浓度0.001mg/mL的内标3-MCPD_d5，真空条件下旋转蒸发挥干溶剂，然后用超纯水溶解，添加正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，再次添加正己烷，旋涡振荡充分混匀，待分层后将正己烷相弃去，水相用于后续衍生化处理。6.根据权利要求4或5所述的检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:将得到的所述水相，添加衍生剂，于80~90°C水浴加热30~40min后室温冷却，加入适量正己烷，旋涡振荡，充分混匀，静置分层后将上层正己烷相移入塑料离心管中，10000转/分，离心分离lOmin，将上层正己烷相进行有机滤膜过滤后转入玻璃进样瓶中，准备进行GC-MS分析。7.根据权利要求1所述的检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:所述的GC-MS检测采用的色谱柱为TR-5MS，程序升温条件为，以10°C/min速率从50°C升至190°C，然后以30°C/min速率从190°C升至270°C，在270°C保持5min，以3°C/min速率从270°C升至300°C，在300°C保持IOmin。8.根据权利要求1所述的检测油脂中游离及结合3-氯-1，2-丙二醇含量的方法，其特征在于:所述的计算油脂中游离及结合3-MCPD含量的方法为，将所述第一组中添加内标物3-MCPD-d5，然后进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为Al；将所述第二组中酸催化醇解后添加内标物3-MCPD-d5，然后进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为A2；将所述第三组中固相萃取柱处理后进行酸催化醇解并添加内标物3-MCPD-d5，然后进行苯硼酸衍生化处理后检测到的3-MCPD含量记为A3；游离3-MCPD含量记为B，结合3-MCPD中3-MCPD单酯记为Cl，3-MCPD双酯记为C2，则计算公式为B=A1，C1=A2-A1-A3,C2=A3。【文档编号】G01N30/06GK103913523SQ201410117872【公开日】2014年7月9日申请日期:2014年3月26日优先权日:2014年3月26日【发明者】金青哲,周红茹,纪聪利,曾君瑞,王兴国,刘睿杰,邹孝强申请人:江南大学