一种肝素含量的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种肝素含量的检测方法，是通过发色底物法，将待测样品与FXa活性检测试剂混合并孵育后，检测发色底物的信号强度；最后通过计算信号强度并和标准曲线比对获得待测样品中肝素含量，其中发色底物为活化因子X(FXa)的发色底物，选自以下底物中的任一一种：Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide?HCl；CH3O-CO-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroanilide?AcOH；Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide?2HCl；4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide?2HCl。本发明的检测范围包括普通未分级肝素、低分子量肝素和磺达肝素，且本发明检测稳定性和重复性好，能准确反应肝素含量，具有很高的灵敏度和准确度，可以较快找到肝素的最佳剂量范围，患者无需进行多次检测。此外，本发明还可用在自动化仪器如血凝分析仪或生化分析仪上，实现自动化有助于临床推广应用，具有操作简便，灵敏度高，重复性好的特点。
【专利说明】一种肝素含量的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物学检测【技术领域】，涉及一种肝素含量的检测方法。
【背景技术】
[0002]肝素(heparin)是一种糖胺聚糖，是被广泛应用的抗凝血药物。肝素是由D-葡糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡糖胺及葡糖醛酸交替组成的粘多糖硫酸酯，分子量从5至30KDa，其中硫酸根约占40%。肝素的抗凝血功能主要是通过它与抗凝血酶的结合来实现的。抗凝血酶III (AT-1II)的精氨酸酶活性部位可以与含丝氨酸的凝血酶和凝血因子Xlla、XIa、Xa、IXa的丝氨酸酶活性部位结合，形成无凝血活性的抗凝血酶II1-凝血因子复合物，而达到抗凝血作用。肝素带有大量负电荷，能与抗凝血酶III上带正电荷的赖氨酸结合，肝素中独特的戊聚糖序列，就是肝素与抗凝血酶III的结合位点。肝素与抗凝血酶III结合，使抗凝血酶III发生分子构象变化，暴露精氨酸活性部位，增加与凝血因子中丝氨酸接触的概率，使反应速率增加约1000倍，从而增强抗凝血酶III的抗凝血活性。
[0003]肝素作为临床医学中一种最常用的抗凝治疗剂，使用肝素时要精确把握肝素用量，以避免出现用量过少达不到抗凝效果，用量过多又会引起自发性出血的状况，保持机体出凝血功能有效平衡。但是，由于肝素是一种高度带负电荷的异质性混合物，容易与血液中带正电荷的蛋白非特异性结合，导致难以计算与抗凝血酶III特异性结合的肝素含量。因此，在临床应用中，必须通过实验检测肝素抗凝的实际效果从而得出肝素的最佳剂量。
[0004]常见的应用于临床的肝素有普通未分级肝素(Unfract1nated heparin, UFH),低分子量肝素(low-molecular-weight heparin, LMWH)和横达肝素(fondaparinux)。普通未分级肝素的平均分子量是15000。低分子量肝素的平均分子量是4000到6500。而磺达肝素是化学合成的戊聚糖化合物，它的分子量为1728，基本上由与抗凝血酶结合的戊聚糖序列组成。普通未分级肝素既可抑制抗凝血酶也可抑制活化因子X，低分子量肝素则主要抑制活化因子X。磺达肝素只能抑制活化因子X，而不能抑制抗凝血酶。
[0005]普通未分级肝素价格相对低廉，是最早应用到临床的肝素。它是一种带大量负电荷的异质性的混合物。在血液里，它和带正电荷的蛋白非特异性结合，因此有多少肝素和抗凝血酶特异性结合很难计算。这样，普通未分级肝素的用量难以预测，用量过少达不到抗凝效果，用量过多又会导致出血。所以在临床应用中，必须通过实验室的严格监测来测量肝素抗凝的实际效果来找到并维持最佳剂量。
[0006]低分子量肝素比普通未分级肝素的糖链要短很多。这样就减少了许多与血液中蛋白的非特异结合。因此，它在血液中的半衰期比普通未分级肝素要长，抗凝血效果也更容易预测，由于和血小板作用引起的副作用也降低。磺达肝素虽然价格相对昂贵，但它基本上由与抗凝血酶结合的戊聚糖序列组成，所以它的特异性更强，在血液中的半衰期也更长。
[0007]然而，低分子量肝素和磺达肝素在临床应用中，由于病人的体质，性别，年龄，体重，用药等的不同，也会出现药量不足或过量的情况。因此，为了避免引起出血和对病人实施个体化治疗，实验室的监测必不可少。
[0008]现有技术中关于测定肝素含量的方法有多种。其中，临床中常用活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time, APTT)常用来间接反映肝素治疗是否恰当，其基本操作是在血浆中加入钙离子，脑磷脂和其他激活物质如白陶土，这些物质激活内源性凝血级联系统，促进血浆凝固，而活化部分凝血活酶时间(APTT)就是血浆凝固所需的时间。肝素的用量可以根据APTT时间的长短来进行调整，从而找到最佳剂量范围。APTT是一种凝固法。作为检测肝素的方法之一，它操作简单、快速、便宜。然而，通过活化部分凝血活酶时间(APTT)推测肝素最佳剂量范围的方法，在临床实践中经常被质疑，尤其是对低分子量肝素和磺达肝素的应用。主要是因为利用这种方法得出的肝素最佳剂量也常常出现血栓和出血现象，而且应用此法时，患者需要多次检测、调整肝素剂量。因此，活化部分凝血活酶时间(APTT)并不是一个能被用来准确推测的肝素最佳剂量范围的指标。并且，活化部分凝血活酶时间(APTT)只能用于普通肝素检测，不能用于低分子肝素和磺达肝素检测。
[0009]相对于凝固法，发色底物法具有灵敏度高，操作简便的特点。Demers等人(Thrombosis and Hemostasia,69 (3),pp.231-235 (1993))报道了一种测定抗凝血酶活性的方法。他们发现在测定过程中，如果采用FXa替代凝血酶，那么得到的抗凝血酶活性的结果会更加准确。他们这项研究的目的是测定抗凝血酶活性，而不是肝素。可值得注意的是，该文献中所用测定方法所使用的就是发色底物法。这说明发色底物法是可以被成功地应用在血液检测领域的。美国药典第32版(United States Pharmacopeia 32, USP32)对肝素活性测定采用发色底物法，这个方法的基本原理就是上面提到的肝素-抗凝血酶III复合物能够抑制活化的FXa，从而抑制其水解发色底物的显色反应。但此法需采用对数方程拟合标准曲线，而进行对数方程的计算导致检测结果与实际偏差较大。
[0010]此外，中国专利CN 103063592 A公开了一种肝素活性的测定方法，包括样品先后与抗凝血酶、活化的牛凝血因子X、发色底物、乙酸混合后测其吸光度来计算肝素活性含量，但其相对来说更适应于较低肝素活性样品的检测。中国专利CN 103063593 A公开了一种人抗凝血酶III浓缩物中肝素含量的测定方法，虽然测定了和抗凝血酶III结合的肝素的含量，但其采用的是手动加样的微孔板方法，无法用在自动检测仪器上。
[0011]综上述，现有产品中并无检测方法简便、检测结果精确可靠且可适用于自动检测仪器上的肝素含量检测。
【发明内容】
[0012]针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的之一是提供一种相较于检测AT-1II活性更为灵敏且应用范围更广的用于检测活化因子X (以下简称FXa)活性的试剂，尤其是用于检测血液中肝素含量的FXa活性检测试剂。为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下:
一种FXa活性检测试剂，包括试剂I和试剂2，其中试剂I为活化因子X (FXa)的发色底物，试剂2为活化因子X (FXa);其中活化因子X (FXa)的发色底物选自以下底物中的任种:
Benzoyl-1Ie-Glu-Gly-Arg-p-nitroaniIide.HCl ；CH3O-CO-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroanilide.AcOH ；Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroaniIide.2HC1 ；4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroaniIide *2HC1。
[0013]优选地，上述试剂I或试剂2为相应的溶液或冻干剂，优选为冻干粉剂。
[0014]优选地，上述发色底物的工作浓度为0.05~2mM，优选工作浓度为0.f ImM，最佳工作浓度为0.5mM ；
上述FXa的工作浓度为0.05^2 μ M，优选工作浓度为0.1~? μ Μ，最佳工作浓度为0.5 μ M(工作浓度的定义:在用上述任一试剂检测样本活性的过程中，该试剂的冻干剂采用其复溶试剂复溶后，与稀释样本混合，所形成的分析混合物中各组分的浓度被定义为其工作浓度)。
[0015]优选地，试剂I由包含发色底物、缓冲剂、无机盐、表面活性剂和防腐剂的混合试齐?制成。
[0016]优选地，试剂2由包含FXa、缓冲剂、无机盐、表面活性剂和防腐剂的混合试剂制成。
[0017]更优选地，缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷缓冲液(以下简称Tris缓冲液)或硼酸缓冲液，最佳为三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)。
[0018]更优选地，无机盐选自氯化钠或氯化钾，最佳为氯化钠。
[0019]更优选地，表面活性剂选自聚乙二醇-8000或吐温-20，最佳为聚乙二醇-8000。
[0020]更优选地，防腐剂可选择本领域技术人员已知的防腐剂，如Proclin 300或叠氮纳，最佳为置氣纳。
[0021]优选地，FXa选自为人、牛、猪FXa中的任意一种，优选牛FXa。
[0022]作为优选，上述试剂还包括含有肝素的人血浆标准品；人血浆标准品为含有准确肝素含量的人血浆。该标准品由正常健康人血浆添加稳定剂和防腐剂，经冷冻干燥制成。正常健康人血浆可以从商业途径获得，也可以从健康个体获得，将收集的正常健康人血浆混合后进行肝素活性检测。血浆中加入适当的甘氨酸、叠氮钠，混合后通过过滤除去不溶颗粒，调节pH值至6.(T9.0，优选7.5，分装后冻干，并用WHO肝素国际标准品血浆对肝素标准品进行定值。此外，也可省略此标准品而提供标准曲线。
[0023]本发明的另一目的是提供上述的FXa活性检测试剂的制备方法，包括分别制备试剂I和试剂2 ;其中:
制备试剂I的方法为:将发色底物溶于缓冲剂中；再加入盐酸，调节PH值至71 ;再依次加入无机盐和表面活性剂，室温下搅拌10分钟。
[0024]其中，试剂I中各组分的终浓度或百分含量分别为:发色底物0.flmM，缓冲剂10~50禮，无机盐0.1~0.3M，表面活性剂0.5~1%。
[0025]优选地，还包括将试剂I的溶液制成冻干剂的步骤，可参考现有技术中的冻干粉剂的制备工艺，以获得稳定性更高的试剂I。
[0026]制备试剂2的步骤为:将FXa溶于缓冲剂；再加入盐酸，调节pH值至广8 ;再依次加入无机盐和表面活性剂，室温下搅拌10分钟。
[0027]其中，试剂2中各组分的终浓度或百分含量分别为:FXa 0.flyM，缓冲剂10~50禮，无机盐0.1~0.3M，表面活性剂0.5~1%。
[0028]优选地，还包括将试剂2的溶液制成冻干剂的步骤，可参考现有技术中的冻干粉剂的制备工艺，以获得稳定性更高的试剂2。
[0029]此外，上述试剂I和试剂2中还分别加入0.2%的防腐剂，可参考现有技术中的方法加入，在此不做赘述。
[0030]本发明的另一目的是提供上述FXa活性检测试剂的应用，即将上述试剂作为检测试剂用于制备检测肝素含量的检测试剂。
[0031]作为一种优选方案，该检测试剂可制备相应的检测试剂盒，包括盒体和装有上述试剂的试剂瓶，试剂瓶放置于所述盒体内。
[0032]作为一种优选方案，上述检测试剂盒分别包含试剂I或试剂2。该试剂盒检测待测样品中肝素含量时，将待测样品与试剂I混合并孵育后，再加入试剂2混合并孵育后，然后读取待测样品中发色底物的信号强度；最后通过计算信号强度并和已知浓度标准品的标准曲线比对得到血液中肝素含量。
[0033]本发明的另一目的是提供另一种FXa活性检测试剂，除上述试剂I和试剂2外，还包括试剂3;同上述，试剂I为活化因子X (FXa)的发色底物，试剂2为活化因子X (FXa)；试剂3为抗凝血酶；其中活化因子X (FXa)的发色底物选自以下底物中的任一一种:
Benzoyl-1Ie-Glu-Gly-Arg-p-nitroaniIide.HCl ；CH3O-CO-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroanilide.AcOH ；Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroaniIide.2HC1 ；
4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroaniIide *2HC1。
[0034]优选地，试剂3为溶液或冻干剂，优选为冻干粉剂。
[0035]优选地，上述抗凝血酶的工作浓度为0.1~10/mL,优选工作浓度为0.2^0.5U/mL,最佳工作浓度为0.5U/mL。
[0036]优选地，试剂3由包含抗凝血酶、缓冲剂、无机盐、表面活性剂和防腐剂的混合试齐?制成。
[0037]更优选地，抗凝血酶为人抗凝血酶。
[0038]更优选地，上述缓冲剂、氯化钠、表面活性剂和防腐剂同试剂I或试剂2。
[0039]发明的另一目的是提供上述FXa活性检测试剂的制备方法，包括分别制备试剂1、试剂2和试剂3，其中试剂I和2的制备方法同上述，此外，
制备试剂3的步骤为:将抗凝血酶溶于浓度为l(T50mM的缓冲剂；再加入盐酸，调节pH值至7~8 ;再依次加入无机盐和表面活性剂，室温下搅拌10分钟。
[0040]其中，试剂3中各组分的终浓度或百分含量分别为:抗凝血酶0.2、.5U/mL，缓冲剂10~50禮，氯化钠0.1~0.3M，表面活性剂0.5~1%。
[0041]优选地，还包括将试剂3的溶液制成冻干剂的步骤，可参考现有技术中的冻干粉的制备工艺，以获得稳定性更高的试剂3。
[0042]本发明的另一目的是提供上述FXa活性检测试剂的应用，即将上述试剂作为检测试剂用于制备肝素检测试剂。值得一提的是，针对不同人群中抗凝血酶的表达量是不同的，在极少部分低表达人群中，如新生儿等；如果不加入外源性抗凝血酶来测定肝素含量，那么测定结果会有一些误差。本发明针对此，提供了上述两种不同的FXa活性检测试剂在需纠正这些误差时的应用，即采用不同的试剂分别检测是否需要考虑被检者体内的内源抗凝血酶表达水平的肝素含量。
[0043]作为一种优选方案，该检测试剂可制备相应的检测试剂盒，所述试剂盒包括盒体和装有上述试剂的试剂瓶，试剂瓶放置于所述盒体内。
[0044]作为一种优选方案，上述检测试剂盒分别包含试剂1、试剂2试剂3。该试剂盒检测待测样品中肝素含量时，将待测样品与试剂3混合并孵育后，再与试剂I混合并孵育后，再加入试剂2混合并孵育后，然后读取发色底物的信号强度；最后通过计算信号强度并和已知浓度标准品的标准曲线比对得到血液中肝素含量。
[0045]本发明的另一目的是提供一种肝素含量的检测方法，具体是通过发色底物法，将待测样品与上述FXa活性检测试剂混合并孵育后，检测发色底物的信号强度；最后通过计算信号强度并和标准曲线比对获得待测样品中肝素含量。
[0046]其中，当无需考虑被检者内源抗凝血酶表达水平时，上述FXa活性检测试剂包括试剂I和试剂2。
[0047]其中，当需要考虑被检者内源抗凝血酶表达水平时，上述FXa活性检测试剂包括试剂1、2和试剂3。
[0048]上述检测方法，具体包括以下步骤:
步骤a，标准曲线的制作:根据不同肝素浓度的标准品及其相应的信号强度绘制标准曲线；
步骤b，待测样品处理:获得待测样品的血浆，与上述FXa活性检测试剂混合并孵育； 步骤C，检测待测样品中发色底物的信号强度；
步骤d，通过计算待测样品中信号强度并和标准曲线比对获得待测样品中肝素含量。
[0049]优选地，当无需考虑被检者内源抗凝血酶表达水平时，步骤b中待测样品的处理顺序为:将待测样品与试剂I混合并孵育后，再加入试剂2混合并孵育。
[0050]优选地，当需要考虑被检者内源抗凝血酶表达水平时，步骤b中待测样品的处理顺序为:将待测样品与试剂3混合并孵育后，再与试剂I混合并孵育后，再加入试剂2混合并孵育。
[0051]更优选地，步骤b中待测样品处理的温度为37 °C，孵育温度也为37 °C。
[0052]更优选地，步骤a是采用缓冲剂将已知浓度的含有肝素的人血浆标准品稀释至
0.1~1.0 IU/mL的四种或以上的已知浓度，作为标准溶液；再根据人血浆标准品中不同肝素浓度与测得的相应吸光值绘制标准曲线。
[0053]更优选地，步骤b中待测样品的血浆是将新鲜抽取的静脉血按9:1的比例与枸橼酸抗凝液混匀后离心，分离即得待测样品血浆。
[0054]更优选地，步骤b中待测样品血浆与试剂I的体积比为1:1，在37°C下混合并孵育2分钟。
[0055]更优选地，步骤b中待测样品血浆与试剂2的体积比为1:1，在37 °C下混合并孵育2分钟。
[0056]更优选地，步骤b中待测样品血浆与试剂3的体积比为1:1，在37 °C下混合并孵育2分钟。
[0057]优选地，上述信号为405nm下的吸光度。
[0058]更优选地，步骤c中吸光度的检测时间不少于5分钟。
[0059]优选地，肝素包括但不限于普通未分级肝素、低分子量肝素和磺达肝素。
[0060]上述肝素含量的检测方法应用于自动检测仪上(如血凝分析仪或生化分析仪)进行检测的具体条件为:在自动监测仪上设定参数:反应温度:37°C ;检测波长:405nm ;检测方法:终点法或动态法。
[0061]应当注意的是，在使用不同的自动检测仪(血凝分析仪或生化分析仪)时，具体参数应根据仪器不同进行相应调整。
[0062]为了使发色底物法在肝素检测方面得到广泛应用，本发明提供一种与上述肝素检测方法匹配的检测试剂。发色底物法的测量原理是利用肝素抑制活化因子X(FXa)的活性从而抑制凝血，通过测量含肝素血浆对活化因子X(FXa)的抑制程度来推测肝素的最佳剂量范围。该肝素测量方法比活化部分凝血活酶时间(APTT)优越。首先，本发明的检测范围包括但不限于普通未分级肝素、低分子量肝素和磺达肝素，而活化部分凝血活酶时间(APTT)只能用于检测普通未分级肝素。同时，血浆中高浓度因子、凝血酶原、收集管中血浆量不足以及血浆中很多凝血因子缺乏等因素都会对活化部分凝血活酶时间(APTT)的检测结果产生影响，而本发明测量结果则不受以上述因素的影响，检测稳定性和重复性好，能准确反应肝素含量，具有很高的灵敏度和准确度，可以较快找到肝素的最佳剂量范围，患者无需进行多次检测。此外，本发明还可用在自动化仪器如血凝分析仪或生化分析仪上，实现自动化有助于临床推广应用，具有操作简便，灵敏度高，重复性好的特点。因此，本发明应用前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0063]图1为实施例1所用肝素的标准曲线。
[0064]图2为实施例2所用肝素的标准曲线。
[0065]图3为实施例3所用肝素的标准曲线。
【具体实施方式】
[0066]下面结合实施例及对比例对本发明作进一步详细、完整地说明。以下所用试剂或设备均为市售品种，如无特殊说明，均按照说明书操作，在此不做赘述。
[0067]以下为结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不应视为对本发明的限定。
[0068]1、实验材料和试剂
Tris (是Tris (Hydroxymethyl) aminomethane的常用缩写；中文品名:三轻甲基氨基甲烷)，盐酸，氯化钠和聚乙二醇-8000购自西格马(Sigma，活化因子X (FXa)和活化因子X(FXa)的发色底物:
Benzoyl-1le-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide.HCl (S-2222)；
CH30-C0-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroaniIide.AcOH ；
Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide.2HC1 (S-2772)；
4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1 (S-2782)，购自 Chromogenix ;
2、试验仪器
血凝分析仪购自Sysmex ；
血浆来自合作医院。
[0069]实施例1
制备本发明提供的试剂盒一，包含试剂I和试剂2，用于测定血液中肝素含量。
[0070]具体为:试剂I活化因子X (FXa)的发色底物，其具体制备方法为:取4-Nz-D_Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide ?2HC1 (S-2782)溶于浓度为20mM的Tris缓冲液,再加入盐酸调节pH值至7.4 ;再加入氯化钠和聚乙二醇-8000，搅拌后制得试剂1，其终浓度分别为:4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide *2HC1 0.5 mM,氯化钠 0.15 Μ,聚乙二醇-8000 1%。
[0071]试剂2为活化因子X (FXa)，其具体制备方法为:取活化因子X (FXa)溶于浓度为20mM的Tris缓冲液，再加入盐酸调节pH值至7.4 ;再加入氯化钠和聚乙二醇-8000，搅拌后制得试剂2，其终浓度分别为:活化因子X (FXa) 0.5 μ M,氯化钠0.15 Μ，聚乙二醇-8000 1%。
[0072]肝素标准品的制备:将已知浓度的含有普通未分级肝素(Unfract1natedheparin, UFH)的人血浆标准品稀释成一定浓度的已知肝素浓度的标准液。重复上述操作，配制多个不同浓度的已知肝素浓度的标准液分别为0.1 IU/ml,0.4IU/ml,0.7 IU/ml，1.0IU/ml。
[0073]标准曲线制作:
(I)取200 μ L稀释好的标准液与200 μ L试剂I混合均匀，并孵育2分钟，孵育和反应的温度均为37 °C。
[0074](2)然后加入200 μ L试剂2，混合均匀，在405nm波长测量吸光度5分钟。
[0075](3)根据肝素标准液梯度浓度与所对应吸光值，采用线性方程绘制标准曲线，请见附图1，其标准曲线公式为y=-l.428X+1.7473 (R2=0.9859)。
[0076]样品检测:
取3份200 μ L稀释好的血浆与200 μ I试剂I混合均匀，37 ° C孵育2分钟，然后加Λ 200 111试剂2，37 °C反应在405 nm波长测量吸光度5分钟。每份样品重复测量两次，记录试验结果，计算信号强度，和标准曲线比对得到活化因子X(FXa)的活性和血液中肝素含量；此时测得的为无需考虑样品的内源抗凝血酶表达水平下的肝素含量。
[0077]检测所得试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围见如下实验。
[0078]实施例2
本实施例与实施例1的差别仅在于实施例1所述标准品和样品所含肝素为普通未分级肝素(Unfract1nated heparin, UFH),而本实施例中所述标准品和样品所含肝素为低分子量肝素(low-molecular-weight heparin, LMWH)。其他操作及配比与实施例1 一致。
[0079]根据肝素标准液梯度浓度与所对应吸光值，采用线性方程绘制标准曲线，请见附图 2，其标准曲线公式为 y=-l.0344X+1.3977 (R2=0.9867)。
[0080]检测所得试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围见如下实验。
[0081]实施例3
制备本发明提供的试剂盒三，包含试剂1、试剂2和试剂3，用于测定血液中肝素含量，此时测得的为需要考虑样品的内源抗凝血酶表达水平下的肝素含量。
[0082]其中，试剂I和试剂2的制备以及标准曲线同实施例1。
[0083]试剂3为抗凝血酶，其具体制备方法为:取抗凝血酶溶于浓度为20mM的Tris缓冲液，再加入盐酸调节PH值至7.4。再加入氯化钠和聚乙二醇-8000，得到试剂3，其终浓度分别为:抗凝血酶0.2~0.5U/mL，氯化钠0.1~θ.3Μ，聚乙二醇0.5~1%。
[0084] 根据肝素标准液梯度浓度与所对应吸光值，采用线性方程绘制标准曲线，请见附图 3，其标准曲线公式为 y=-l.2914X+1.6414 (R2=0.9838)。
[0085]样品检测:
取3份200 μ L稀释好的血浆与200 μ L试剂3混合均匀，37 °C孵育2分钟，再加入200 μ L试剂I，混合均匀孵育2分钟，然后加入200 μ L试剂2，37 °C反应在405nm波长测量吸光度5分钟。每份样品重复测量两次，记录试验结果，计算信号强度，和标准曲线(实施例I)比对得到活化因子X(FXa)的活性和血液中肝素含量。
[0086]检测所得试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围见如下实验。
[0087]实施例4
本实施例与实施例1的差别仅在于试剂I中发色底物为Benzoyl-1le-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide.HCl (S-2222)。其他制备方法及检测操作与实施例1 一致。
[0088]该试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围的检测结果与实施例1所得数据存在理论误差范围的一致性。
[0089]实施例5
本实施例与实施例1的差别仅在于试剂I中发色底物为CH30-C0-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroanilide.AcOH。其他制备方法及检测操作与实施例1 一致。
[0090]该试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围的检测结果与实施例1所得数据存在理论误差范围的一致性。
[0091]实施例6
本实施例与实施例1的差别仅在于试剂I中发色底物为Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilide.2HC1 (S-2772)。其他制备方法及检测操作与实施例1 一致。
[0092]该试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围的检测结果与实施例1所得数据存在理论误差范围的一致性。
[0093]实施例7
本实施例与实施例1的差别在于:
试剂I中各组分终浓度为:发色底物2mM，Tris缓冲液10mM，氯化钠0.3M，PEG-8000
1% ；
试剂2中各组分终浓度为:活化因子X(FXa) 2 μ M，Tris缓冲液10mM，氯化钠0.3M，PEG-8000 1%。其他制备方法及检测操作与实施例1 一致。
[0094]该试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围的检测结果与实施例1所得数据存在理论误差范围的一致性。
[0095]实施例8
本实施例与实施例1的差别在于:
试剂I中各组分终浓度为:发色底物lrnM，Tris缓冲液20mM，氯化钠0.3M，PEG-8000
1% ；
试剂2中各组分终浓度为:活化因子X(FXa) I μ M，Tris缓冲液20mM，氯化钠0.3M，PEG-8000 1%。
[0096]其他制备方法及检测操作与实施例1 一致。
[0097]该试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围的检测结果与实施例1所得数据存在理论误差范围的一致性。
[0098]实施例9
本实施例与实施例3的差别在于:
试剂I中各组分终浓度为:发色底物0.05mM，Tris缓冲液50mM，氯化钠0.1M，PEG-8000 0.5% ；
试剂2中各组分终浓度为:活化因子X (FXa) 0.05 4 1，1^8缓冲液50禮，氯化钠0.1M，PEG-8000 0.5% ；
试剂3中各组分终浓度为:抗凝血酶0.3U/mL, Tris缓冲液50mM，氯化钠0.1M，PEG-8000 0.5%ο
[0099]其他制备方法及检测操作与实施例3 —致。
[0100]该试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围的检测结果与实施例3所得数据存在理论误差范围的一致性。
[0101]实施例10
本实施例与实施例3的差别在于:
试剂I中各组分终浓度为:发色底物0.lmM，Tris缓冲液20mM，氯化钠0.1M，PEG_8000
0.5% ；
试剂2中各组分终浓度为:活化因子X(FXa) 0.ΙμΜ, Tris缓冲液20mM，氯化钠0.1M，PEG-8000 0.5% ；
试剂3中各组分终浓度为:抗凝血酶0.3U/mL, Tris缓冲液20mM，氯化钠0.1M，PEG-8000 0.5%ο
[0102]其他制备方法及检测操作与实施例3 —致。
[0103]该试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围的检测结果与实施例3所得数据存在理论误差范围的一致性。
[0104]试剂盒的特异性、灵敏度及线性范围的检测
1.试剂盒特异性检测
【权利要求】
1.一种肝素含量的检测方法，其特征是通过发色底物法，将待测样品与FXa活性检测试剂混合并孵育后，检测发色底物的信号强度；最后通过计算信号强度并和标准曲线比对获得待测样品中肝素含量，其中发色底物为活化因子X (FXa)的发色底物，选自以下底物中的任--种:
Benzoyl-1Ie-Glu-Gly-Arg-p-nitroaniIide.HCl ；CH3O-CO-D-CHA-Gly-Arg-p-nitroanilide.AcOH ；Acetyl-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroaniIide.2HC1 ；
4-Nz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroaniIide *2HC10
2.根据权利要求1所述的肝素含量的检测方法，其特征在于:当检测待测样品中的肝素含量时，所述FXa活性检测试剂包括试剂I和试剂2，其中，试剂I为活化因子X (FXa)的发色底物，试剂2为活化因子X (FXa)。
3.根据权利要求1所述的肝素含量的检测方法，其特征在于:当检测待测样品中的肝素含量时，上述FXa活性检测试剂包括试剂1、2和3，其中，试剂I为活化因子X (FXa)的发色底物，试剂2为活化因子X (FXa)，试剂3为抗凝血酶。
4.根据权利要求1~3任一所述的肝素含量的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤: 步骤a，标准曲线 的制作:根据不同肝素浓度的标准品及其相应的信号强度绘制标准曲线； 步骤b，待测样品处理:获得待测样品的血浆，与上述FXa活性检测试剂混合并孵育； 步骤C，检测待测样品中发色底物的信号强度； 步骤d，通过计算待测样品中信号强度并和标准曲线比对获得待测样品中肝素含量。
5.根据权利要求4所述的肝素含量的检测方法，其特征在于，当无需考虑被检者内源抗凝血酶表达水平时，步骤b中待测样品的处理顺序为:将待测样品与试剂I混合并孵育后，再加入试剂2混合并孵育。
6.根据权利要求4所述的肝素含量的检测方法，其特征在于，当需要考虑被检者内源抗凝血酶表达水平时，步骤b中待测样品的处理顺序为:将待测样品与试剂3混合并孵育后，再与试剂I混合并孵育后，再加入试剂2混合并孵育。
7.根据权利要求5或6所述的肝素含量的检测方法，其特征在于，步骤b中待测样品血浆与试剂I的体积比为1:1，在37 °C下混合并孵育2分钟。
8.根据权利要求5或6所述的肝素含量的检测方法，其特征在于，步骤b中待测样品血浆与试剂2的体积比为1:1，在37 ° C下混合并孵育2分钟。
9.根据权利要求6所述的肝素含量的检测方法，其特征在于，步骤b中待测样品血浆与试剂3的体积比为1:1，在37° C下混合并孵育2分钟。
10.根据权利要求1~9任一所述的肝素含量的检测方法，其特征在于，所述肝素含量的检测方法应用于自动检测仪上进行检测的具体条件为:反应温度:37°C ;检测波长:405nm ；检测方法:终点法或动态法。
【文档编号】G01N21/31GK104048931SQ201410159017
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】赵铁铭 申请人:上海贞元诊断用品科技有限公司