一种检测溶液中mmp9蛋白的方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，该方法包括以下步骤：⑴设计MMP9特异性小分子配体；⑵小分子配体的化学合成：①制备KF-CaF2熔融物：②制备对甲基苯磺酰氟；③采用催化剂LDA进行反应得化合物Ⅰ；④HCL气体脱去反应物上Boc基团，得化合物Ⅱ；⑤采用催化剂三乙胺进行反应得化合物Ⅲ；⑥化合物Ⅱ与化合物Ⅲ反应得化合物Ⅳ；⑦化合物Ⅳ与NaOH溶液进行反应得化合物Ⅴ；⑧采用催化剂为O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟基胺、NMM、HOBT和EDC进行反应得化合物Ⅵ；⑨化合物Ⅵ脱去保护基团得MMP9小分子配体；⑶SPR法检测溶液中的MMP9：ⅰ裸金膜芯片的修饰；ⅱ小分子配体的固定；ⅲ非特异性小分子吸附的排除；ⅳ检测溶液中的MMP9蛋白；ⅴMMP9非特异性蛋白吸附的排除。本发明方法灵敏度高。
【专利说明】—种检测溶液中MMP9蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学医药领域，尤其涉及一种检测溶液中MMP9蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]分子对接技术(Molecular docking technology)从分子水平上模拟生物大分子特异性的活性中心与配体小分子之间的相互作用，计算出大分子和小分子之间的结合自由能，用于设计新的能和大分子物质特异性结合的、亲和性强的配体小分子，可节省大量时间，缩短实验过程分子。对接技术是计算机辅助药物设计中常用的一种方法和手段，近年来在药物设计方面取得了很大的成功，分子对接技术的引入成为解决特定蛋白的特异性识别的一种可能。
[0003]合成化学是有机化学、无机化学、药物化学、高分子化学、材料化学等学科的基础和核心。合成化学提供了很多药物生产的新途径，合成了磺胺类、抗生素类、维生素类以及口服避孕药等。现在很多镇痛剂、麻醉剂、防腐剂、催眠剂等都是合成出来的。合成化学与生物学、物理学等学科的密切配合，预计将来在征服疾病如癌症、精神病，以及控制遗传，延长人类的寿命等方面会发挥重要作用。
[0004]表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)技术利用全反射时入射光可以和金属表面的等离子发生共振的原理，探测生物分子之间是否发生作用以及反应的动力学参数，是发生在光学介质界面(SPR芯片)上的非常灵敏的光学现象。SPR技术由瑞典科学家Liedberg等于80年代首次运用于IgG抗体与其抗原相互反应的测定。随后，该技术被引入生物传感器领域并迅速渗透到基础生命科学研究中。基于SPR技术的光学生物传感器具有其它相互作用技术所无法比拟的优点:如高灵敏度(无需逐级放大试验，检测灵敏度就可达到Pg水平)，不需对分子进行标记、能实时检测生物分子结合反应的全过程等，其发展非常迅速，已经成为一种成熟的检测生物分子间相互作用的方法。研究发现SPR较ELISA方法相比有着无需逐级放大反应即可达到相似的检测敏感度(ng/ml )，且无需标记，步骤简单的特点，从而达到对所检测微量蛋白质的无需标记、无需逐级放大反应的直接检测。SPR生物传感器目前在生物分子相互作用、药物筛选、食物检测及环境监控等领域广泛应用。
[0005]近年来由于分子对接技术在大分子物质的特异性识别优势，在药物靶标设计等方面获得了广泛应用，并取得了良好的成绩；但基于用分子对接原理设计的小分子配体在SPR芯片表面检测特异性蛋白方面的研究上尚未见报道。因此寻找一种新的基于分子对接技术、合成化学和SPR技术相结合的方法对溶液中特异性蛋白进行检测不仅具有创新性，更具有重要的科研价值。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度的检测溶液中MMP9蛋白的方法。[0007]为解决上述问题，本发明所述的一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，包括以下步骤:
⑴应用分子对接技术设计MMP9的特异性小分子配体，该MMP9的特异性小分子配体的化学结构式如下:
【权利要求】
1.一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，包括以下步骤: ⑴应用分子对接技术设计MMP9的特异性小分子配体，该MMP9的特异性小分子配体的化学结构式如下:
2.如权利要求1所述的一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步骤②中的干燥乙腈是指在乙腈中加入五氧化二磷回流2~3天并用碳酸钾蒸馏，最后用分馏柱分馏即得；所述五氧化二磷与所述乙腈的质量体积比为0.5^1mg:1L ;所述碳酸钾与所述乙腈的质量体积比为Ig:1~2?0
3.如权利要求1所述的一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步骤③中的石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按10~15mL:l mL的比例混合而成的混合物。
4.如权利要求1所述的 一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步骤⑤中的石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按25~35mL:1 mL的比例混合而成的混合物。
5.如权利要求1所述的一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步骤⑥中的石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按remL:1 mL的比例混合而成的混合物。
6.如权利要求1所述的一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步骤⑧中的石油醚-丙酮是指石油醚与丙酮按f 1.5mL:1 mL的比例混合而成的混合物。
7.如权利要求1所述的一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步骤⑨中的I，4 二氧六环-无水甲醇溶液是指I，4 二氧六环与无水甲醇按2~3mL:1 mL的比例混合而得。
8.如权利要求1所述的一种检测溶液中MMP9蛋白的方法，其特征在于:所述步骤i中浓度为0.2^0.3%w/v的交联剂对苯二异硫氰酸酯的溶液是指在IL吡啶-DMF混合液中加入`0.2^0.3mg的对苯二异硫氰酸酯，搅拌均匀所得；所述吡啶-DMF混合液是指吡啶与DMF按ImL:8~10mL的比例混合而得。
【文档编号】G01N21/552GK103940784SQ201410180514
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】王志平, 刘映前, 姚小军, 王静, 张丽秀, 祁萍 申请人:兰州大学