基于微流控系统的单细胞自动分析方法
【专利摘要】本发明提供一种基于微流控芯片的自动化单细胞分析方法，其特征在于：利用荧光标记的单细胞，受激光激发所发出的荧光信号，以触发该激光光束在进样光路和检测光路双光路间切换的方法，从而实现一个激光器在激光阀门与检测光源两个功能间的自动转换。激光阀门结合液压泵或电动泵，控制单细胞传输，从而在微流控芯片上实现单细胞由进样通道向分离通道引入和进样过程的自动化。激光由进样光路切换至检测光路，又可实现自动单细胞计数或胞内组分检测。
【专利说明】基于微流控系统的单细胞自动分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及单细胞自动分析技术，特别是涉及基于微流控系统实现单细胞内组分自动分析及单细胞自动分拣的方法。
【背景技术】
[0002]单细胞分析无论对于疾病的早期诊断和治疗还是药物的设计和副作用控制都具有潜在的重要意义。因此研究高效、简便的单细胞分析方法和仪器，在临床实践中显得尤为重要。但是，单细胞分析通常包括细胞进样、衍生、溶膜、分离及检测等多个步骤，操作较复杂。尤其对单细胞进样和溶膜等步骤的操作，不论其在毛细管电泳还是在微流控芯片上进行，都需依靠实验人员借助显微镜利用各种细胞操控技术才能完成。微流控芯片的微米级通道网络结合微泵、微阀等装置在细胞分析方面具有广阔的前景。在微流控芯片上研究细胞，如何对细胞进行操纵使其在微通道内任意转移或停留是首先要解决的问题。人们采取了多种微通道液流控制技术，主要包括液压、气压等机械力控制，电压、介电电泳力等电控制，以及光学陷阱(或激光镊子)等，或者上述几种技术的结合。尽管微芯片以其网络通道结合微阀、微泵在单细胞操控方面可以获得比毛细管更大的自由度，但仍存在装置复杂、手工操作、效率低等问题，不易实现连续和自动检测，不易被更多实验人员所掌握。同时也影响了微分析系统在单细胞分析领域的进一步发展。
[0003]经过多年发展，微流控芯片技术已广泛用于细胞研究，实现了包括细胞筛选、分离、操控，以及单细胞培养、单细胞分析等多种研究，但用于单细胞自动分析的方法和技术还未见专利和相关文献报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种在微流控芯片上进行单细胞分析的自动化分析方法，该方法包括在一块微流控芯片上自动实现试样引入、单细胞进样、溶膜、组分分离检测全过程。以克服在微流控芯片上进行单细胞分析存在的速度慢、手工操作、装置复杂、不易被更多实验人员所掌握等问题。
[0005]本发明提供的基于双光路的微流控芯片自动化单细胞分析方法，其特征在于:
单细胞进样和检测分别由进样光路和检测光路完成，即利用荧光标记的单细胞受激光激发所发出的荧光信号触发该激光光束在进样光路和检测光路双光路间切换的方法，实现单一激光器在激光阀门与激发光源两个功能间的自动转换，见图1;
利用液压泵、电动泵结合激光阀门控制单细胞传输的新技术，由计算机控制高压电源，在微流控芯片上实现单细胞由进样通道向分离通道引入和进样过程的自动化，见图2，3 ;利用程控电源结合芯片网络控制单细胞输送或单细胞的溶膜及组分分离过程的自动
化；
最终实现微流控芯片上单细胞计数或单细胞组分分离检测全过程的自动化，制成适用于单细胞组分分析的自动化微流控分析系统。[0006]本发明的微流控芯片单细胞的自动分析方法步骤如下:
一个具有进样光路和检测光路的双光路装置，利用荧光标记的单细胞受激光激发后发出的荧光作为控制信号，使同一激光光源既作为单细胞进样的光控阀门，又作为被分离组分的激发光源。具体设计方案见图1，图中微流控芯片以十字型芯片为例。
[0007]采用悬液稀释结合电动驱动的细胞分散方法，也可适量添加羟丙基甲基纤维素(HPMC)，使细胞分散且不易沉降和聚集。在十字型微流控芯片通道出口处用环氧树脂粘合微量移液管头，作为储液池。在较短通道即进样通道两端安装储液池S、SW。在较长通道即分离通道两端安装B、BW。在储液池S中加入按一定比例稀释的细胞悬液，在储液池B、SW、BW中加入一定体积的电泳缓冲溶液。在进样通道(S-SW)施加一组较高电压，在分离通道(B-BW)施加一组夹流电压，使细胞成单行间隔一定距离以一定流速成单行通过进样通道(S-SW)，见图 2。
[0008]进行单细胞分析之前，首先要将单细胞从进样通道(S-SW)引入分离通道(B-BW)，即实现单细胞自动进样，本发明利用进样光路实现单细胞自动进样，具体做法是，光源
(101)发出的光束沿OX轴穿过光路转换盘(102)上的圆孔，经平面反射镜(103~105)反射至显微镜物镜(106)，在通道交叉点聚焦成直径10-20 μ m的光斑(图1)，当被荧光物质标记的某个单个细胞经过激光斑点(图2)，发出荧光，荧光和激光经聚光透镜(107)汇聚到达半透半反镜(108)，在此，激光透过(108)，而荧光被反射至平面反射镜(109)，然后，荧光被反射至凹面反射镜(110)，将荧光平行反射至针孔(117)，荧光经过针孔(117)过滤并透过长波通滤光片(118)，最终到达光电倍增管(119)，检测器将此单细胞信号送至数据处理单元(2)(图1)，由数据处理单元(2)控制多通道高压直流电源(4)，改变通道两端电压差，使该单细胞运输方向改变，即由S-SW变为B-BW，从而实现光控阀门作用，完成单细胞进自动进样(图3);为避免细胞成团经过影响单细胞进样，通过编制峰值程序由数据处理单元(2)判断信号大小，从而剔除过大信号，因此不会对成团细胞进行响应，避免出现多个细胞进入分离通道的情况。
[0009]完成单细胞进样的同时，数据处理单元(2)控制伺服电机(3)转动光路转换盘
(102),改变激光传输方向，即将激光切换至检测光路。光束经平面反射镜(111，112)反射至显微镜物镜(113)，在分离通道末端聚焦成直径10-20 μ m的光斑，用作激光诱导荧光检测。荧光和激光经聚光透镜(114)汇聚到达半透半反镜(115)，在此，激光透过半透半反镜(115)，而荧光被反射至平面反射镜(116)，之后，荧光被反射至凹面反射镜(110)，被平行反射至针孔(117)，荧光经过针孔(117)过滤并透过长波通滤光片(118)，最终到达光电倍增管(119)，检测器将此单 细胞信号送至数据处理单元(2)(图1)，并输出结果(图4)。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为本发明微流控自动分析系统的结构图1:双光路光学单元101:激光光源102:光路转换盘
103~105，109，111 ~112，116:平面反射镜
106、113:显微镜物镜 107、114:聚光透镜108、115:半透半反镜
110:凹面反射镜117:针孔118:长波通滤光片
119:光电倍增管120:样品台2:数据处理单元3:伺服电机4:直流高压电源
图2为单细胞自动进样示意图 图3为单细胞检测示意图
图4为连续自动采集5个单细胞在进样点和检测点荧光信号。
【具体实施方式】
[0011]以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但不应以此限制本发明的保护范围。
[0012]参见图1，采用一种用于单细胞自动分析的双光路装置，此装置包括双光路光学单元、数据采集单元、微流控电源、光路控制单元。其中:双光路光学单元中的光电倍增管(119)的输出端与数据采集单元中的放大电路(2)连接；数据采集单元中的模数转换器(3)通过RS232接口与数据处理单元(4)连接；数据处理单元(4)的输出经RS232接口与直流高压电源(5)连接；数据处理单元(4)的输出经RS232接口与光路控制单元的数模转换器
(6)连接，控制伺服电机(7)驱动光路转换盘(102)。
[0013]微流控芯片置于样品台(120)，开启仪器，微调样品台，激光光斑在微通道内精确聚焦。 [0014]细胞经荧光染料染色，调节细胞悬液浓度至0.5~2X IO5 cells/ml。细胞悬液注入样品池S，缓冲溶液注入S、SW、BW，调节液面高度，使细胞从S流向SW，参见图2。当单细胞流经位于通道交叉点的激光光斑，被激发发出荧光。此荧光信号经进样光路被光电倍增管(119 )采集，经模数转换送至数据处理单元(2 )。
[0015]数据处理单元(2)接收并处理信号后，同时发出两个指令。一方面控制伺服电机
(3)转动光路转换盘(102)，改变激光传输方向，将激光切换至检测光路，激光光斑聚焦于分离通道末端，用作后续的检测(细胞计数、胞内组分检测等)。另一方面控制高压电源(4)，输出一组电压，分离通道+150 V~+1500 V，进样通道+70 V~+700 V，推动细胞由B流向BW。至此，实现单细胞自动进样，参见图3。利用计算机程序判断因细胞成团引起的过大信号并自动剔除，从而保证单细胞进样。
[0016]单细胞进入分离通道到达末端检测点，经过激光光斑发出荧光信号。荧光信号经检测光路到达光电倍增管(119)，经模数转换送至数据处理单元(2)并输出结果。至此，实现单细胞自动检测，参见图4。图4为在通道交叉点以及分离通道末端连续测定的5个单细胞(未溶膜)荧光信号峰，每组峰为同一个细胞的进样信号(左)和未溶膜情况下在分离通道末端的检测信号(右)。全部过程由仪器自动完成。从图4可以看出，同一个细胞在前后两个位置的信号大小有差异，有两个原因:一是激光在两个位置的聚焦有偏差；二是细胞经过分离通道的过程有可能发生缓慢溶膜，造成前后差异。
[0017]本装置也适用于单细胞组分自动分析。调节高压电源并在B中加入溶膜试剂，可使单细胞迅速溶膜，从而自动完成单细胞进样、溶膜、分离、检测全过程。
【权利要求】
1.一种基于双光路的微流控芯片自动化单细胞分析方法，包括下列步骤: O细胞悬液加入到样品池中； 2)单细胞进样:利用双光路中的进样光路将单细胞从进样通道(S-SW)引入分离通道(B-Bff)； 3)检测:完成单细胞进样的同时，数据处理单元(2)控制高压电源(4)推动细胞由储液池B流向储液池BW ;同时，数据处理单元(2)控制伺服电机(3)转动光路转换盘(102)，改变激光传输方向，即将激光由进样光路切换至检测光路；光束经平面反射镜(111，112)反射至显微镜物镜(113)，在分离通道末端聚焦成直径10-20 μ m的光斑，用作激光诱导荧光检测；荧光和激光经聚光透镜(114)汇聚到达半透半反镜(115)，在此，激光透过半透半反镜(115)，而荧光被反射至平面反射镜(116)，之后，荧光被反射至凹面反射镜(110)，被平行反射至针孔(117)，荧光经过针孔(117)过滤并透过长波通滤光片(118)，最终到达光电倍增管(I 19)； 4)输出结果:检测器将此 单细胞信号送至数据处理单元(2)，并输出结果。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片自动化单细胞分析方法，其特征是，步骤I)中，细胞悬液用微量移液器、注射器或微量注射泵加入到样品池中。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片自动化单细胞分析方法，其特征是，步骤I)中所述的细胞悬液浓度0.5^2X IO5 cells/ml，加入到微流控芯片上样品池S中。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片自动化单细胞分析方法，其特征是，步骤2)中利用液压泵、电动泵结合进样光路控制单细胞传输方法，在储液池B、SW、Bff中加入一定体积的电泳缓冲溶液，保持液面高度S>B=BW>SW ;或在进样通道(S-SW)施加一组较高电压(+100疒+200 V)，在分离通道(B-BW)施加一组夹流电压(+50疒+100 V)，使细胞成单行间隔一定距离(0.5^5 mm)以一定流速(0.05~0.5 mm/s)成单行通过进样通道(S-SW)。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片自动化单细胞分析方法，其特征是，步骤2)中所述的单细胞自动进样，具体做法是，光源(101)发出的光束沿OX轴穿过光路转换盘(102)上的圆孔，经平面反射镜(103~105)反射至显微镜物镜(106)，在通道交叉点聚焦成直径10-20 μ m的光斑，当被荧光物质标记的某个单个细胞经过激光斑点，发出荧光，荧光和激光经聚光透镜(107)汇聚到达半透半反镜(108)，在此，激光透过(108)，而荧光被反射至平面反射镜(109)，然后，荧光被反射至凹面反射镜(110)，将荧光平行反射至针孔(117)，荧光经过针孔(117)过滤并透过长波通滤光片(118)，最终到达光电倍增管(119)，检测器将此单细胞信号送至数据处理单元(2)，由数据处理单元(2)控制多通道高压直流电源(4)，改变通道两端电压差，使该单细胞运输方向改变，即由S-SW变为B-BW，完成单细胞进自动进样。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片自动化单细胞分析方法，其特征是，步骤2)所述的双光路包括进样光路和检测光路。
7.根据权利要求1所述的微流控芯片自动化单细胞分析方法，其特征是，步骤2)所述的进样光路将激光光斑聚焦于芯片通道交叉点，在此激发经过的细胞并产生荧光。
8.根据权利要求1所述的微流控芯片自动化单细胞分析方法，其特征是，步骤2)所述的进样光路产生的荧光信号由所述的数据处理单元(2)处理。
9.根据权利要求1所述的微流控芯片自动化单细胞分析方法，其特征是，步骤3)所述的数据处理单元控制伺服电机(3)转动光路转换盘(102)，改变激光传输方向，将激光切换至检测光路。
10.根据权利要求1所述的微流控芯片自动化单细胞分析方法，其特征是，步骤3)所述的数据处理单元(2)控制高压电源(4)输出一组电压，分离通道+150 V~+1500 V，进样通道+70 V~+700 V，推动细胞由B流向BW。
11.根据权利要求1所述的微流控芯片自动化单细胞分析方法，其特征是，步骤3)所述的检测光路将激光光斑聚焦于芯片分离通道末端，在此激发经过的细胞或细胞组分并产生荧光。
12.根据权利要求1所述的微流控芯片自动化单细胞分析方法，其特征是，步骤4)所述的检测光路产生的荧光信号由所述的数据处理单元(2)处理并输出结果。
【文档编号】G01N15/14GK103926190SQ201410192110
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年5月8日 优先权日:2014年5月8日
【发明者】刘彧, 班青, 高健 申请人:齐鲁工业大学